专利名称：叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一条21nt水稻抗病相关DNA分 子的设计、验证及应用。本发明人工设计了一条21nt的人工microRNA序列，并利用天然 microRNA osa_MIR528前体作为骨架，构建了人工microRNA前体。在转基因水稻中，叶片特 异性地表达这条人工microRNA的前体，可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性，同时不影 响转基因水稻的育性等重要农艺性状。
背景技术：
抗病、虫育种是农业生产上主要育种目标之一。在抗病、虫育种中，抗性基因资源 是最重要的。因此，育种家和生物学家们在大量的栽培品种或野生品种中进行大规模的鉴 定以获得抗性基因资源。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害。幸运的是，由于生产上抗白叶枯病品种 的应用使得这种水稻细菌性病害在生产生被有效控制。目前在水稻中已鉴定出30多个抗白叶枯病菌主效基因，其中有5个是隐性的。 xal3基因是近年来从水稻籼稻品种IRBB13克隆的一种特殊的水稻隐性抗白叶枯病基因 (Chu et al.2006)。xal3与其显性等位基因Xal3在基因的编码区没有差异，但是xal3启 动子部分的序列变异导致了其在水稻叶片中的表达显著下降，从而使得水稻植株获得了对 白叶枯病菌菌株PX099特异性的抗性。组成型抑制xal3等位显性基因Xal3的表达可以提 高水稻对菌株PX099抗性，但是同时会导致花粉育性显著下降，表明该基因不仅控制水稻 的抗病性还与水稻的育性有关(Bart et al. 2006 ；Chu et al.2006)。在育种上特别是杂交育种，由于隐性抗性基因的使用并不方便(需要同时改良杂 交品种的两个亲本)，因此育种家更重视显性抗白叶枯基因如Xa21或Xa23等的应用。由于 致病菌的进化，一种抗病基因在生产上使用几年或者十几年后会逐步丧失其抗性。隐性抗 病基因xal3的功能与抗病和育性有关，和以往发现的抗病基因有较大差异，其抗病机理与 其他抗病基因应有较大的差异，是对抗病基因资源的重要补充。因此人类在生产上与病原 菌进行长期斗争的过程中，充分利用这些隐性抗性基因具有重要意义。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的一种RNA介导的基因沉默现 象。利用RNAi技术特异性地沉默植物内源相关代谢途径上的关键基因来改良作物品质，已 经取得了很多成功的例子。比如，提高小麦籽粒中直链淀粉含量(Regina et al.2006)；提 高玉米赖氨酸和色氨酸含量(Huang et al.2006)；提高棉籽油中硬脂油和油酸含量(Liu et al. 2002)，降低棉籽中棉酚的含量(Ganesan et al.)；提高油菜油酸含量，降低芥酸含 量(Peng et al. 2010)；提高番茄中类胡萝卜素和类黄酮含量(Davulurj et al.2005)，延 长番茄成熟期(Xiong et al. 2005)；降低木薯块茎氰苷含量(Jorgensen et al. 2005)等 等。由于RNAi导致基因沉默的分子机理是通过RNA介导的反式作用方式来实现的，因而利 用RNAi机理改良的作物性状均为显性遗传。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用水稻和拟南芥来源的叶片特异性启 动子，精确地抑制Xal3基因在叶片中的表达而不影响其在花药中发挥功能，既能提高转基 因水稻对白叶枯病的抗性，又不影响其的育性。本发明是这样实现的参考Chu等人(2006)发表的文献获得Xal3基因的基因序列号编号并在网上查到 其序歹lU 禾丨J用 amiRNA 设计软件(http://wmd3.weigelworld.org/cgi_bin/webapp.cgi ？ page = Designer ；project = stdwmd)设计21nt的amiRNA序列。通过人工分析,挑选其 中2条amiRNA序列命名为amiA和amiB，并设计引物，利用PCR的方法构建amiRNA的植物 表达载体。由于Xal3的基因功能与水稻花粉发育相关，本发明使用叶片特异性表达启动子 水稻的rbcS启动子(Osrbcsp)以及拟南芥rbcSIA启动子(Atrbcsp)驱动amiRNA前体的 表达。通过农杆菌介导的遗传转化将amiRNA表达载体转化到水稻优良恢复系明恢63中。 人工接种检测表明，转含amiB表达载体的水稻植株高抗白叶枯病菌菌株P0X99，而转amiA 表达载体的水稻植株抗性增强不明显。对这些转基因植株的育性进行考察发现，转基因水 稻植株花粉发育正常，育性与野生型明恢63无显著差异。本发明的优点在于(1)利用基因沉默技术将隐性抗病性状转化为显性抗病性状；(2)利用组织特异性启动子，将目标基因的沉默限定在特定组织内，减少基因沉默 导致的其他不良后果如育性下降。
序列表SEQ ID NO :1是人工microRNA :amiA的前体DNA序列，长度为257nt。序列表SEQ ID NO 2是人工microRNA amiA的DNA序列，长度为21nt。序列表SEQ ID NO 3是人工microRNA :amiB的前体DNA序列，长度为257nt。序列表SEQ ID NO 4是人工microRNA amiB的DNA序列，长度为21nt。序列表SEQ ID NO :5是水稻来源的叶片特异性启动子Osrbcsp的序列，长度为 1631bp。序列表SEQ ID NO :6是拟南芥来源的叶片特异性启动子Atrbcsp的序列，长度为 1703bp。序列表SEQ ID NO :7_37是本发明的相关引物序列。图1 本发明所涉及的基础质粒载体pC1300示意图。图2 本发明所涉及的中间载体PC1300-N0S示意图。图3 本发明所涉及的中间载体pC1300-amiA-N0S示意图。图4 本发明所涉及的中间载体pC1300-amiB-N0S示意图。图5 :4个最终表达载体的示意图。a)载体Osrbcsp+amiA ；b)载体Atrbcsp+amiA ； c)载体 Osrbcsp+amiB ;d)载体 Atrbcsp+amiB。图6 转基因植株的叶片及花药中amiRNA的RT-PCR检测，TO被作为内源对照。检 测结果表明野生型明恢63的叶片及花药中均无amiRNA表达。转基因植株的叶片中amiA和amiB均可高效表达，而花药中几乎没有表达。a)和g)野生型明恢63叶片；d)和g)野 生型明恢 63 花药；b)0srbcsp+amiA 叶片；c) Atrbcsp+amiA 叶片；e) Osrbcsp+amiA 花药；f) Atrbcsp+amiA 花药；h) Osrbcsp+amiB 叶片；i) Atrbcsp+amiB 叶片；k) Osrbcsp+amiB 花药； 1) Atrbcsp+amiB 花药。图7 部分抗病转基因株系叶片中Xal3基因的相对表达量。这些转基因家系的叶 片中Xal3的表达量下降了 57% -95%，证明了 amiRNA的表达的确导致了 Xal3表达量的下 降。图8 转基因水稻接种PX099菌株14天后的表现。a)野生型明恢63 ；b) Osrbcsp+amiB ；c)Atrbcsp+amiB ；d)Osrbcsp+amiA ；e)Atrbcsp+amiA图9:转基因水稻的花粉的碘化钾染色观察。转基因水稻的花粉碘化钾染色 率和野生型的无明显差异。a)野生型明恢63 ；b)Osrbcsp+amiA ；c)Atrbcsp+amiA ；d) Osrbcsp+amiB ；e)Atrbcsp+amiB
具体实施例方式实施例1 amiRNA序列的设计以及amiRNA前体的构建根据Chu等人(2006)发表的文献获得Xal3基因在Genebank中的序列 号 “DQ421395”，根据该序列号在 NCBI 网站(www. ncbi. nlm. nih. gov)的 Genebank 中 获得DQ421395的序列。根据DQ421395的序列在TIGR Rice网站(http //rice, plantbiology. msu. edu/LocusNameSearch. shtml)进行 blastn 获得其在 TIGR Rice 中的 locus identifier :0s08g42350. 1。在 Web MicroRNA Designer 网页上(http://wmd3. weigelworld.org/cgi_bin/webapp.cgi ？ page = Designer ；project = stdwmd)输 A 0s08g42350. 1，软件返回17条Xal3的amiRNA序列，人工筛选出其中的2条分别命名为 amiA(序列为 TAGACTACTAGTAGATCCGCT)和 amiB (序列为 TGTAGCGAGAATCTGTCGCCG)进行下 一步的研究。参考Warthmarm等人(2008)发表的方法，以质粒pNW55为模板(含有水稻天然 miRNA 0sa-miR528的前体序列，由德国Max Planck发育生物所Prof. Detlef ffeigel惠 赠)，利用PCR的方法分别构建含有amiA和amiB的amiRNA前体，该amiRNA前体通过TA克 隆的方法构建到T-easy vector上(购自美国Promega公司)。PCR MM 白勺弓L fi Web MicroRNA Designer N M (http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ page = Oligo ；project = stdwmd)设计，弓丨物序列见表 1。amiRNA前体的构建为两轮PCR，下面是amiA前体的构建过程，amiB的构建过程完 全一样，仅所用引物不同。第一轮PCR有3个独立的PCR反应，使用如下所示的引物对PCR1 :G-4368+Xal3MIRa-II PCR2 :Xal3MIRa_I+Xal3MIRa_IV ；PCR3 Xal3MIRa-III+G-4369反应体系为10xPCRbuffer 5u l,2mM dNTPs 5 ii 1，10 ii M 的引物各 2 ii 1，pNW55 质粒10ng，Pfu酶(购自美国Promega公司)0. 5 yl，加灭菌双蒸水至50 yl。反应程序为95°C2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 重复 34 个循环；72°C 7min反应完成后，1 %琼脂糖凝胶电泳并回收PCR产物。
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第二轮PCR 反应体系:10xPCRbuffer 5u l,2mM dNTPs 5 u 1，10 ii M 的引物G-4368 和G-4369 各2iU，PCR1、PCR2、PCR3的回收产物各lyl，Ex-Taq酶(购自宝生物工程大连有限公 司)0. 5 ill，加灭菌双蒸水至50 u 1反应程序:94°C2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 重复 32 个循环；72°C 7min将PCR产物于琼脂糖凝胶电泳检测并TA克隆于T-easy vector (购自美国 Promega 公司)0将构建完成的TA克隆进行测序分析，确认amiA和amiB的前体被正确构建。本发 明所涉及到的相关引物的DNA序列如表1所示。表1本发明所涉及到的引物序列表中引物名序列号引物序列引物用途X13MR a-ISEQ NO7IDagTAGACTACTAGTAGATCCGCTcagga gattcagtttga构建ami A前体X13MR a-IISEQ NO8IDtgAGCGGATCTACTAGTAGTCTActgctg ctgctacagcc构建amiA前体X13MR a-IIISEQ NO9IDctAGCGGTTCTTCTAGTAGTCTAttcctgc tgctaggctg构建amiA前体X13MR a-IVSEQ NO10IDaaTAGACTACTAGAAGAACCGCTagag aggcaaaagtgaa构建amiA前体X13MR b-ISEQ NO11IDagTGTAGCGAGAATCTGTCGCCGcagg agattcagtttga构建amiB前体X13MR b-IISEQ NO12IDtgCGGCGACAGATTCTCGCTACActgct gctgctacagcc构建amiB前体X13MR b-IIISEQ NO13IDctCGGCGTCAGTTTCTCGCTACAttcctg ctgctaggctg构建amiB前体X13MRSEQIDaaTGTAGCGAGAAACTGACGCCGagag构建amiB前体b-IVNO14aggcaaaagtgaaG4368SEQ NO15IDCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC构建amiRNA前体通用 引物G4369SEQ NO16IDGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA CAG构建amiRNA前体通用 引物OsrbcS-FSEQ NO17IDAAGCTTTCGGGTCGAGGTGAACTTT A扩增Osrbcsp启动子OsrbcS-RSEQ NO18IDCTGCAGAGATGCACTGCTCTGCACA C扩增Osrbcsp启动子AtrbcS- FSEQ NO19IDCTGCAGTCCGTGGTCGAGATTGTGT A扩增Atrbcsp启动子AtrbcS-RSEQ NO20IDGTCGACTCTTTGTGTGACTGAGGTT TGG扩增Atrbcsp启动子Htp-IFSEQ NO:21IDAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGA潮霉素抗性基因PCRHtp-IRSEQ NO22IDTCAAGACCAATGCGGAGCATATAC潮霉素抗性基因PCRGAPDH -FSEQ NO23IDCTGCAACTCAGAAGACCGTTGReal time PCR内参引物
权利要求
一种提高水稻对白叶枯病抗性的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO4所述。
2.一种提高水稻对白叶枯病抗性的转基因的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的来源于水稻及拟南芥的叶片特异性表达启动子，以及序列 表SEQ IDN0 3所示的人工amiRNA前体构建获得如图5所示的表达载体Osrbcsp+amiB 和Atrbcsp+amiB，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将所述的表达载体Osrbcsp+amiB和 Atrbcsp+amiB导入水稻受体中，使其在转基因水稻中表达21nt的人工microRNA，特异性地 抑制水稻中Xal3基因在叶片中的表达，使转基因植株增强对白叶枯病的抗性。
3.权利要求1所述的DNA分子在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一条21nt水稻抗病相关DNA分子的设计、验证及应用。本发明人工设计了一条21nt的人工microRNA序列，并利用天然microRNAosa-mi528的前体作为骨架，构建了人工microRNA前体。在转基因水稻中，利用水稻或拟南芥来源的叶片特异性启动子特异性地表达这条人工microRNA的前体，可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性，同时不影响转基因水稻的育性等重要农艺性状。
文档编号C12N15/82GK101979548SQ201010286238
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者李昌焱, 林拥军, 陈浩 申请人:华中农业大学