专利名称：一种水稻根围伯克氏菌及其在防治水稻纹枯病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌菌株，尤其涉一种水稻根围伯克氏菌及其在防治水稻纹枯病 中的应用。
背景技术：
水稻作为一种重要的粮食作物，许多病害都能导致其严重减产。其中，由立枯丝核 菌引起的水稻纹枯病是一种毁灭性病害，在世界上水稻产区普遍发生，与稻瘟病、白叶枯病 和细条病构成水稻四大病害。水稻纹枯病又称“云纹病”，多在高温高湿条件下发生。据统 计，目前全国水稻纹枯病发病面积达1333. 33万hm2以上，占水稻总栽种面积的40%。发病 水稻植株茎秆、叶鞘干枯至腐烂，不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，结实率下降，粒重下降，甚 至植株倒伏。发病田块一般导致24% -50%的经济损失。长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留的问题已引起人们的 高度重视，迫切需要寻求一条安全防治水稻纹枯病的新途径。生物防治以其无污染、无残 留、无生态毒性和安全性好等优点在植物病害的防治中发挥着越来越重要的作用。目前，包 括洋葱伯克氏菌在内的许多根围细菌已被报道能抑制水稻纹枯病菌的生长。洋葱伯克氏菌广泛分布于自然环境中，是一组表型相近、基因型不同的细菌群，称 为洋葱伯克氏菌群，简称Bcc。它是一种广泛存在于土壤、水和植物表面，与医院感染病密切 相关的革兰氏阴性细菌，20世纪50年代作为植物病原菌被认识。Bcc菌具有多种生物学功 能，它既能作为生防菌有效防治多种植物土传病害，如腐霉病害；同时也是一些植物的致病 菌，如可引起洋葱鳞茎腐烂；此外Bcc中有些菌还是人体条件致病菌，如洋葱伯克氏菌在医 院可引起多种感染病。因此，利用洋葱伯克氏菌菌株防治水稻纹枯病具有一定的潜在风险， 有必要寻找一种更安全、高效的伯克氏菌应用于防治水稻纹枯病。
发明内容
本发明提供了一株防治水稻纹枯病的伯克氏菌R456，该菌株在离体试验中对水稻 纹枯病菌生长有较强的抑制作用，在温室和大田试验中，对水稻纹枯病也表现出较好的防 治效果。一株防治水稻纹枯病的伯克氏菌菌株，经鉴定命名为伯克氏菌(Burkholderia SeminaliS)R456，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏日期为2010年8月20日，保藏号为CCTCC NO =M 2010207。伯克氏菌R456主要表型及生物学特征如下在营养琼脂培养基上，30°C培养条件 下，菌落圆形、黄色、光滑、凸起、全缘。菌体革兰氏染色阴性，严格需氧型，过氧化氢酶和氧 化酶都为阳性。用该菌株的细胞悬浮液接种烟叶，24h内能够导致典型的过敏性反应，但接 种水稻幼苗则不表现出明显的病害症状。本发明还提供了一种含有上述伯克氏菌R456的菌悬液，制备该菌悬液可以选用 常用细菌培养基，优选采用LB(即普通培养基，含酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15 20g，水1000ml，PH 7. 4 7. 6)培养基，伯克氏菌R456含量优选为IO7 108CFU/ml， 可以直接应用于防治水稻纹枯病。本发明伯克氏菌R456菌株在离体、温室及田间试验中对水稻纹枯病菌的生长有 较强的抑制作用，能有效防治水稻纹枯病。相对于其它洋葱伯克氏菌，本发明伯克氏菌R456对水稻纹枯病菌生长表现出更 好的抑制效果。此外，本发明伯克氏菌R456具有较低的蛋白酶活性，对离体洋葱和水稻幼 苗无明显致病性，适宜用作防治水稻纹枯病的生防菌，使用安全性较高。
图1为依据本发明伯克氏菌R456和Bcc组成种的相关菌株的recA基因建立的分 子系统发育树。图2为本发明伯克氏菌R456和菌株B. cepacia LMG 1222τ接种到脑心浸液牛奶 培养基24h和48h后蛋白酶活性变化情况；图3为本发明伯克氏菌R456不同接种时间对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响；图4为本发明伯克氏菌R456对接种水稻纹枯病菌的水稻幼苗病害发生率的影 响；图5为本发明伯克氏菌R456对接种水稻纹枯病菌的水稻幼苗病斑直径的影响；
具体实施例方式菌株B. cepacia LMG 1222τ由比利时根特大学世界菌种保藏中心提供。伯克氏 菌R456和B. c印acia LMG 1222τ在营养琼脂培养基(即NA培养基，含牛肉浸膏lg，蛋白 胨5g，酵母膏2g，氯化钠5g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000ml)上培养，最适培养生长温度为 300C。水稻纹枯病菌分离自中国浙江省感病的水稻，该菌株为试验材料，无特异性要求，于 28 V下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养。实施例1分离纯化菌株从浙江省杭州市一块水稻田采集水稻根际周围10-20cm的表层土壤，装入无菌聚 乙烯塑料袋中，封口。称取土壤10g，加入装有90ml无菌水的三角瓶中制得悬液，180r/min 震荡30min，然后从所得悬液中吸取5ml加入有45ml无菌水的三角瓶中，依次梯度稀释到第 5个三角瓶为止，得到IO-1UO-2UO-3UO-4和ΙΟ"5的稀释液。分别取100 μ 1 10_4和ΙΟ"5的稀 释液涂布于营养琼脂培养基中，每个稀释度重复3次，置于30°C恒温培养箱中培养48h后， 挑取培养特征相异的单个菌落，经培养纯化后作为供试菌株。通过供试菌株对水稻纹枯病 菌的抑菌图实验，筛选出抑菌效果最好的一株菌株。该菌株在营养琼脂培养基上，30°C培养条件下，菌落圆形、黄色、光滑、凸起、全缘。 菌体革兰氏染色阴性，严格需氧型，过氧化氢酶和氧化酶都为阳性。用该菌株的细胞悬浮 液接种烟叶，24h内能够导致典型的过敏性反应，但接种水稻幼苗则不表现出明显的病害症 状，如下对该菌株进行鉴定。实施例2脂肪酸鉴定具体试验方法如下1、将菌株置于28°C下，在胰化酪蛋白大豆琼脂培养基(含胰酪化蛋白胨15g，大
4豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000ml)上培养24h ；2、使用脂肪酸鉴定系统MIDI测定上述菌株的脂肪酸组成；3、根据测定的菌株脂肪酸组成与MIDI鉴定数据库TSBA50 5. 00版本的对比来鉴
定菌株。根据微生物脂肪酸鉴定系统的指导手册，相似值达到0. 6以上的说明匹配度好， 而相似值在0. 4-0. 6的说明二者并非同一个种。与微生物脂肪酸鉴定系统中需氧细菌数据 库中的种对比，发现该菌株与Burkholderiagladioli的相似值为0. 72，与洋葱伯克氏菌的 相似值为0. 56。实施例3 Biolog碳源利用鉴定利用Biolog法检测了菌株对碳源的利用率，具体方法如下将菌株置于胰化酪蛋 白大豆琼脂培养液中，在28°C条件下培养24h，利用Biolog革兰氏阴性板检测了该菌株对 碳源的利用率，并将结果与Biolog鉴定数据库GN 4. 01进行对比。结果表明该菌株可以利用乳糖和蜜二糖，鉴定该菌株为洋葱伯克氏菌，相似指数 达到0. 65。实施例4 recA基因系统分析对该菌株和已发表的38个Bcc种的recA基因进行了系统性分析，用MEGA软件4. O 版本中的临位连接法建立分子系统发育树并进行分子进化分析，铜绿假单胞用做外群。通过对recA全基因序列分析，我们将该菌株与GenBank中已收录的Bcc其他已知 种进行了对比。系统发育分析表明该菌株和B. seminalis聚集在同一组群内而与Bcc的其 他种相互分离(见图1)，上述分析都表明该菌株是B. seminalis的成员之一，名为伯克氏菌 (B. Seminalis) R456。保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期为2010年8月20日，保藏号为CCTCC NO M 2010207。实施例5伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 1222τ对离体洋葱和水稻幼苗的致病 性本试验检测了伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 1222τ对离体洋葱和水稻幼苗的 致病性，具体试验方法如下1、将洋葱片放置在培养皿中，用灭菌的吸管尖端在洋葱鳞片内侧刺成伤口，并接 种上5μ 1经营养琼脂液体培养基过夜培养的菌株悬浮液(107CFU/ml)；2、将接种过的洋葱片置于30°C下培养5d ；3、用牙签针刺检测洋葱片的腐烂程度，并记录；4、伯克氏菌R456和B. cepacia LMG 1222τ的接种试验各重复3次，对照试验用等
量营养琼脂液体培养基进行接种。同样，用针刺接种的方法检测了伯克氏菌R456和B. cepacia LMG1222T对水稻幼 苗的潜在致病性。试验结果表明菌株B. c印acia LMG 1222τ能够导致离体洋葱鳞茎腐烂，而伯克 氏菌R456对离体洋葱的致病性较弱，这与前人研究结果一致，在中国引起洋葱球茎内部细 菌性腐烂病的病原菌为洋葱伯克氏菌。然而在接种水稻幼苗的试验中，伯克氏菌R456和 B. cepacia LMG 1222τ都不能导致水稻幼苗产生明显的病害症状。
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实施例6伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 12221蛋白酶活性检测许多研究已发现，蛋白酶活性高低与洋葱伯克氏菌的致病能力有关。蛋白酶活性 高，则潜在致病能力强，对植物具有一定的风险；蛋白酶活性低，则潜在致病能力弱，对植物 的风险低或不具有风险。通过以下方法检测了伯克氏菌R456和B. cepacia LMG 1222τ的蛋白酶活性用 灭菌牙签分别将这两株菌株接种到脑心浸液牛奶琼脂培养基上，在30°C培养条件下，接种 24h和48h后，通过测量接种位置周围水解空白区域的直径来检测菌株产蛋白酶的活性，直 径越大，产蛋白酶活性越高。每个处理重复4次，整个试验重复2次。脑心浸液牛奶琼脂培养基根据以下方法配制1、溶解18. 5g的脑心浸液和7. 5g的琼脂于400ml的水中；2、备好IOOml 15%浓度的脱脂乳；3、将分开灭过菌的两种溶液在60°C下混合，每个培养皿中倒入IOml培养基。试验结果表明接种24h后，菌株B. cepacia LMG 1222τ在脑心浸液牛奶琼脂培养 基上围绕菌落形成的水解区域直径为0. 5mm，而伯克氏菌R456则未形成可见的水解区域； 接种48h后，前者水解区域直径为2. 3mm，后者的为0. 8mm(见图2)。研究结果表明，洋葱病 原菌B. cepaciaLMG 1222τ表现出较强的溶解蛋白质活性，而伯克氏菌R456表现出较低的 蛋白酶活性。结合之前离体洋葱和水稻幼苗的致病性试验，说明伯克氏菌R456对植物不具 有风险，作为生防菌防治水稻纹枯病的安全性较高。实施例7离体试验在离体条件下测定了伯克氏菌R456对水稻纹枯病菌生长的拮抗作用，具体方法 如下1、于28°C下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养水稻纹枯病菌；2、ld后，用灭菌打孔器打取直径0.5cm的菌落，浸于浓度108CFU/ml的伯克氏菌 R456悬浮液中；3,30s后转移至新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于28°C下培养；4、分别于培养后10h、20h和30h测量菌落直径；5、用灭菌蒸馏水处理做对照试验，每个处理重复5次，整个试验重复3次。试验结果表明在没有伯克氏菌R456悬浮液处理的情况下，水稻纹枯病菌在接种 IOh后菌落平均直径为0. 86cm，接种20h禾口 30h后分别为4. 37cm和7. 63cm(见图3)。水稻 纹枯病菌菌落直径随着培养时间的增加而增长。整体上而言，伯克氏菌R456悬浮液处理严 重抑制了水稻纹枯病菌菌丝的生长。经伯克氏菌R456悬浮液处理后，水稻纹枯病菌在接种 IOh后，菌丝的生长完全被R456所抑制；在接种20h和30h后，菌落平均直径分别为2. 07cm 和4. 36cm,与对照相比差异显著，菌丝相对于对照菌丝分别被抑制52. 63%和42. 86% (见 图3)。实施例8温室试验在温室条件下测定了伯克氏菌R456对水稻纹枯病的发生率和严重程度的抑制作 用。具体方法如下1、将水稻种子播种于盛有稻田土壤的塑料盆内，每盆10粒种子，每处理重复4 次；
2、伯克氏菌R456在营养琼脂液体培养基中培养，并调节浓度至108CFU/ml ；3、3个星期后，用伯克氏菌R456悬浮液喷洒接种水稻幼苗，用等量灭菌蒸馏水喷 洒做对照试验；4、风干后，用灭菌打孔器打取培养了 2d，直径为0. 5cm的水稻纹枯病菌菌落接种 到每株水稻幼苗从上向下数的第2片叶的基部；5、用塑料袋覆盖所有接种过的幼苗24h以保持高湿环境，在生长箱中培养，温度 设置为28°C，相对湿度90%，每天光照黑暗交替，光照16h，黑暗8h ；6、接种后2d，观察和记录病害发生率和病斑的平均直径大小，整个试验重复2次。试验结果表明在未接种伯克氏菌R456的对照处理中，水稻幼苗在接种纹枯病菌 2d后表现出病害症状，经伯克氏菌R456处理后，病害症状出现推迟了 Id。在对照处理时，水 稻幼苗在接种后7d病害发病率达到100%，接种后7d和IOd分别进行测量，其平均病斑直 径分别为13. 64cm和16. 96cm，分别占叶长的79. 47%和96. 84% (见图4和图5)；然而，经 伯克氏菌R456处理后，水稻幼苗接种7d和IOd后病害发生率分别减少57. 50%和57. 21%， 病斑直径分别减少76. 47%和76. 33% (见图4和图5)，与对照相比差异显著。并且经伯克 氏菌R456处理后，水稻纹枯病的发生率和病斑直径在接种IOd后保持稳定。未经接种纹枯 病病菌的水稻幼苗则不表现病害症状。实施例9 田间试验设计田间小区试验检测伯克氏菌R456对水稻纹枯病的田间防治效果。试验在浙 江临安市水稻田进行，供试水稻田为历年发病田块，试验地肥力中等，水利排灌设施一般。 根据历年来该田块水稻纹枯病的发生情况，在水稻纹枯病发生初期，饱和喷雾接种已培养 48h、浓度约为108CFU/ml的伯克氏菌R456的菌悬液，着重喷水稻茎基部，以均勻喷湿为度， 清水喷雾作为对照。接种后14d和28d各调查病情1次，取两次调查的平均值。试验重复 3次，取平均值。以株为单位，5点取样，每点调查相连的5丛，共25丛，记录调查总株数、病株率和 病级数。根据水稻叶鞘及叶片发病症状进行病情分级，病情分级标准如下0级全株无病，植株健康；1级第4叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级第3叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；5级第2叶片及其以下各叶鞘或叶片发病；7级剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级全株发病、提早枯死。病情指数=Σ (各级病叶数X相对病级数)X 100/总调查的植株数X9防治效果(%) = (CK-PT) X 100/CK式中，CK和PT分别为对照区及菌悬液处理区的病情指数，防治效果的计算采用的 是处理前未调查病情基数的公式。试验结果表明对照区纹枯病发生率平均为68. 7%，病情指数平均为6. 25 ；而经 伯克氏菌R456悬浮液处理的试验区，病情指数平均为1.96，平均防治效果为68. 64%。伯 克氏菌R456在田间环境中对水稻纹枯病菌仍具有较好的抑制作用，能够在水稻实际生产 中应用于防治水稻纹枯病。
离体试验、温室试验及田间试验的结果基本一致，显示伯克氏菌R456对水稻纹枯 病菌生长有较强的抑制作用，这表明，直接拮抗作用或许是伯克氏菌R456生物防治水稻纹 枯病的主要机制。
权利要求
一株伯克氏菌菌株，其特征在于命名为伯克氏菌(Burkholderiaseminalis)R456，保藏号为CCTCC NOM 2010207。
2.一种含有权利要求1所述的伯克氏菌R456的菌悬液。
3.根据权利要求1所述的菌悬液，其特征在于所述的菌悬液中伯克氏菌R456含量为 IO7 108CFU/ml。
4.根据权利要求1所述的菌悬液，其特征在于制备菌悬液所用的培养基为LB培养 基。
5.权利要求1所述的伯克氏菌R456在防治水稻纹枯病中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株防治水稻纹枯病的伯克氏菌，经鉴定命名为伯克氏菌R456，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2010年8月20日，保藏号为CCTCC NOM2010207。本发明伯克氏菌R456可在离体、温室及田间条件下对水稻纹枯病菌的生长产生较强烈的抑制作用，对水稻纹枯病表现出较好的防治效果。与洋葱伯克氏菌相比，伯克氏菌R456对植物不具有风险，作为生防菌防治水稻纹枯病安全性较高，表明该根围细菌能够作为生防菌防治水稻纹枯病。
文档编号C12R1/01GK101985606SQ20101029058
公开日2011年3月16日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者刘宝平, 吴志毅, 李斌, 石雨, 谢关林, 陶中云 申请人:浙江大学