特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组病毒，特别涉及一种特异促成软骨分化的核心结合因子 al (Cbfal)基因重组病毒，还涉及该重组病毒的制备方法和应用。
背景技术：
随着软骨形成过程的组织学、细胞学和材料学研究的不断深入，对细胞因子和信 号分子、细胞-材料界面相互作用的了解不断拓展，已有学者利用组织工程技术于体外形 成了组织工程软骨，并显示了组织工程软骨的广阔应用前景。尽管组织工程软骨研究开展 较早，技术相对较成熟，但有效合理的种子细胞来源成为限制其临床应用的瓶颈。在自体或 异体软骨细胞、骨膜和软骨膜细胞、骨髓或其它组织来源的间充质干细胞(MSCs)、以及胚胎 干细胞等众多备选种子细胞中，间充质干细胞因其具有来源充足、取材方便、低免疫原性、 增殖能力强、可大量培养扩增等优势，成为目前组织工程软骨领域种子细胞的首选。但间充 质干细胞具有多向分化潜能，为了满足组织工程软骨的构建要求，必须寻求一种能够高效、 特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化的方法。既往研究显示，利用多种旁分泌、自分泌来源的生物活性因子如骨形成蛋白_7、转 化生长因子-β 1、白介素-1等以及非蛋白性化合物如地塞米松、前列腺素E2等均可明显刺 激间充质干细胞的II型胶原与蛋白多糖合成，但这些活性因子和非蛋白性化合物的特异 性差，往往使间充质干细胞呈多向分化。应用软骨细胞外基质进行间充质干细胞的体外3D 培养，提供适宜于干细胞成软骨分化的外部环境，可促进间充质干细胞成软骨分化，但该方 法更多的是从支架材料的研发考虑，而忽略了细胞自身的生物学特性。间充质干细胞与滑 膜囊巨噬细胞或胚胎颅盖细胞共培养可促进其成软骨分化，但该方法除了有导致病原传递 的危险之外，最主要的问题在于成软骨分化细胞难以与共培养细胞有效分离。因此，如何 高效、特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化，成为组织工程软骨领域目前需要解决的 重要问题。新近研究显示，在胚胎发育期，软骨细胞和成骨细胞都来源于未分化的间质细胞。 在骨骼形成过程中，部分间质细胞集缩并分化成软骨细胞构成软骨组织，形成骨骼的原始 雏形，在部分软骨细胞凋亡后，随着血管侵入，成骨细胞在残存软骨基质上合成骨基质，软 骨被骨替换，此过程称为软骨内成骨；同时，部分间质细胞集缩可直接分化成成骨细胞并形 成骨，此过程称为膜内成骨。因此，要促进间充质干细胞定向成软骨分化，首先需要使间充 质干细胞向双潜能的间质细胞分化，继而在此基础上加强间质细胞成软骨分化能力。Cbfal基因是Rimt结构域基因家族的重要成员之一，编码一个成骨细胞特异性转 录因子，调控成骨细胞发育、分化和骨的形成。在鼠中剔除Cbfal基因可导致成骨细胞分化 完全受抑制，使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化成骨均不能发生。Chfal-/-的头盖骨体 外培养细胞已经完全丧失了向成骨细胞分化的能力，反而具有了向脂肪细胞或软骨细胞分 化的潜能。尽管Cbfal-/-鼠的软骨细胞分化和软骨形成正常，但是软骨细胞成熟即肥大化受到严重抑制。而在体外培养的软骨细胞中，过量表达Cbfal促进软骨细胞肥大化。这些 结果说明Cbfal不仅控制成骨细胞分化和骨形成，而且还与软骨细胞肥大化有关。两项独 立的转基因鼠实验进一步证实了这种观点在II型胶原启动子和增强子的指导下，Cbfal 在软骨细胞内过表达明显地促进软骨细胞肥大化，并能够在一定程度上使Cbfal-/-软骨 细胞肥大化和凋亡，使血管侵入软骨。而在软骨细胞内过量表达Cbfal显性负突变体，由于 抑制内源Cbfal的功能，会使软骨细胞成熟受到抑制，使软骨表现永久软骨特性。Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，参与诸如性别决定、软骨形成 等多种早期胚胎发育过程，在除肥大软骨细胞外的所有前体软骨细胞和软骨细胞中均有 表达。Gordon等报道Sox9基因上游序列突变可影响软骨形成而导致短指等骨骼发育异 常。在软骨形成过程中，软骨细胞增殖、分化的调控过程复杂，参与的细胞因子较多，目前 比较明确的是Sox9结合于软骨细胞特异增强子Col2 α 1，直接调控其表达；L_Sox5、Sox6 与Sox9共同形成蛋白复合物协同作用于Col2a 1增强子序列，增强其转录，并通过结合于 PTHrP基因的启动子区上调PTHrP基因启动子活性，刺激软骨细胞早期阶段增殖和发育； Sox9与wnt/β -catenin和TGF-β /Smad信号转导通路相互作用，调控软骨细胞分化。此 外，最新研究显示，Sox9基因在软骨形成过程中还与其他生物因子和物理因子如低氧、电磁 场等相互影响、相互作用。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种特异促成软骨分化的Cbfal基因重组 病毒，可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨方向分 化；目的之二在于提供一种所述特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒的制备方法，操 作简便；目的之三在于提供一种所述特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒在医药方面 的应用及其应用方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒，包含一个由Sox9基因启动子调控的 Cbfal基因表达盒。进一步，病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。当然，病毒载体也可以选用逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载 体、慢病毒载体等基因工程领域常用的其它病毒载体，只要在病毒基因组中插入一个由 Sox9基因启动子调控的Cbfal基因表达盒，都可以同样达到本发明目的。2、所述特异促成软骨分化的Cbfal基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤a、Cbfal基因全长cDNA的克隆及Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒的构建根据 Cbfal基因全长cDNA的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的上、下游引物，以人成骨细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得Cbfal基因全 长cDNA，再定向克隆至复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点Xho I和 EcoRV之间，获得Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack_CMV/Cbfal ；b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建根据 Sox9基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物，以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获
4得Sox9基因启动子片段，再定向克隆至真核表达载体pEGFP-Nl的多克隆位点Bgl II和 Sal I之间，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/SoX9pro ；c、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒载体的构建自步骤b所得Sox9 基因启动子重组表达载体pEGFP/S0X9pr0中用Bgl II和Sal I双酶切出Sox9基因启动子 片段，再定向克隆至步骤a所得Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfal的多 克隆位点Bgl II和Sal I之间，获得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒穿梭 质粒 pAdTrack-Sox9pro/Cbfal，将其用 PmeI酶切使线性化后，再转化AdEasier-I细胞与复制缺陷型腺病毒骨架质粒 pAdEasy-Ι进行细胞内同源重组，获得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒载体 pAdEasy-l/Sox9pro-Cbfal ；d、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化将步骤c 所得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒载体pAdEaSy-l/S0X9pr0-Cbfal用脂 质体法转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂 解，离心收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液；将第一代重组腺病毒悬液感染人 胚胎肾293T细胞以扩增病毒，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂 解，离心收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液；按照上述操作连续感染扩增病 毒几代后，将所得含病毒上清液采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，即得Sox9基因启动子 调控的Cbfal基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfal。3、所述特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒在制备定向诱导成软骨分化的 种子细胞中的应用。4、利用所述特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒制备定向诱导成软骨分化 的种子细胞的方法，先用特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒转染间充质干细胞，再 用成软骨诱导培养基培养已感染重组病毒的间充质干细胞，诱导间充质干细胞定向成软骨 分化。本发明的有益效果在于针对目前组织工程软骨研究中种子细胞的定向成软骨分 化问题，本发明建立了一种特异促成软骨分化的Cbfal基因重组病毒，通过Sox9基因启动 子驱动Cbfal基因在间充质干细胞高表达，可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软 骨方向分化前提下向成软骨分化；该重组病毒的制备方法简单，成本低；该重组病毒可用 于制备定向诱导成软骨分化的种子细胞，从而为组织工程软骨的构建提供有力的支持。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1示出了重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal的构建示意图。图2示出了重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal感染间充质干细胞的情况，其中A为荧光 视野，可见感染后细胞呈现绿色荧光；B为对应的白光视野；标尺为200 μ m。图3示出了重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal感染间充质干细胞后促进其成软骨分化， A组细胞呈现甲苯胺蓝染色强阳性，光学放大倍数为400倍。图4示出了重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal感染间充质干细胞后促进其成软骨分化，A组细胞呈现II型胶原免疫组化染色强阳性，光学放大倍数为200倍。图5示出了用感染重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal的间充质干细胞构建的细胞支架复 合物在体修复关节软骨缺损12周的效果，修复组织与周围组织结构相似，细胞分泌基质 量略多于正常组织。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒的制备及鉴定1、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒的制备重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal的构建示意图如图1所示，其制备方法包括以下步 骤a、Cbfal基因全长cDNA的克隆及Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒的构建根据GenBank登录的Cbfal基因全长cDNA的核苷酸序列(登录号为 NM_001024630)，设计并合成如下引物上游引物5，-ccgctcgagatggcatcaaacagcctctt-3 ’ (SEQ ID No. 1)，下划线部分为Xho I酶切位点及其保护碱基；下游引物5’_ ccggatatct caatatggtcgccaaacagattca-3，(SEQ ID No. 2)，下划线部分为EcoRV酶切位点及其保护碱 基。抽提人成骨细胞总RNA，将所得总RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，采用上述 引物PCR扩增两端分别带有Xho I和EcoRV酶切位点的Cbfal基因全长cDNA。PCR扩增体 系为10XPCR缓冲液5yL，dNTPs5 μ L，上、下游引物各2 μ L，模板1 μ L，Taq DNA聚合酶 1 μ L，用无DNA酶水稀释至总体积50 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性5分钟；然后94°C 变性1分钟、59°C退火1分钟，72°C延伸1. 5分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。 PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约1. 7kb处出现特异性条带，与目标片段的分子 量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物和复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV分别用Xho I 和EcoRV双酶切，切胶回收纯化Cbfal基因全长cDNA片段和穿梭质粒pAdTrack-CMV骨 架，再将二者在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态 细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，测序验证，获得Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV/Cbfalob、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建根据GenBank登录的Sox9基因启动子片段的核苷酸序列(登录号为 NC000077. 5)，设计并合成如下引物上游引物5，-ggaagatctgtggagcgttttgtctgc-3‘ (SE QID No. 3)，下划线部分为BglII酶切位点及其保护碱基；下游引物:5，-catCCggtcgac-tga aactggcgagtctcc-3' (SEQ ID No. 4)，下划线部分为Sal I酶切位点及其保护碱基。以小鼠 软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有BglII和Sal I酶切位点 的Sox9基因启动子片段。PCR扩增体系为10XPCR缓冲液5 μ L，dNTPs 5yL，上、下游引 物各2 μ L，模板1 μ L，Taq DNA聚合酶1 μ L，用无DNA酶水稀释至总体积50 μ L。PCR扩增 条件为94°C预变性5分钟；然后94°C变性1分钟、59°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约Ikb处出现 特异性条带，与目标片段的分子量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物和真核表达载体pEGFP-Nl分别用Bgl 11和Sal I双酶切，切 胶回收纯化Sox9基因启动子片段和表达载体pEGFP-Nl骨架，将二者在T4DNA连接酶的作 用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，抽 提质粒，测序验证，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/SoX9pro。c、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒载体的构建将Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/S0X9pr0和Cbfal基因重组腺病毒穿梭 质粒pAdTrack-CMV/Cbfal分别用Bgl II和Sal I双酶切，切胶回收纯化Sox9基因启动子 片段和穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfal骨架，再将二者在T4DNA连接酶的作用下连接，连接 产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，抽提质粒，测序验证， 获得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-S0X9pr0/Cbfal。将Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTraCk-S0X9pr0/ Cbfal用Pme I酶切使线性化后，用电穿孔法转化AdEasier-I细胞，用LB培养基于37°C孵 育20分钟后，涂布于卡那霉素抗性平板上，37°C孵育过夜，挑取转化菌落，抽提质粒，用琼 脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用Pac I酶切鉴定，获得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因 重组腺病毒载体 pAdEasy-l/Sox9pro-Cbfal。d、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化将Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒载体pAdEasy-l/Sox9pro-Cbfal 经Pac I酶切、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后获得质粒DNA，采用脂质体DOTAP试剂(Roche公 司)转染约75%融合的293细胞，按照试剂说明书操作，具体方法为将2 μ g质粒DNA用 HEPES 缓冲液(20mmol/L HEPES+150mmol/LNaCl, PH7. 4)稀释至 50 μ L 制得 A 液；将 DOTAP 30 μ L与HEPES缓冲液70 μ L混合制得B液；将A液与B液混勻，室温下静置15分钟，再 加入无血清DMEM培养基850 μ L，室温静置30分钟，制得转染液；将已培养至约75%融合 的293细胞用无血清DMEM培养基洗涤2次后，加入上述转染液，37°C培养8小时，再换成 含有体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基继续培养。转染5 7天后出现细胞病变 (cytopathic effect, CPE)，表现为贴壁细胞变圆；转染10 12天后可见圆形细胞呈葡萄 串状丛集分布于正常的293细胞上，MTT染色显示病毒空斑。当显微镜下观察到90%以上 的细胞均出现病变时，离心收集细胞，于_80°C和37°C反复冻融3次使细胞裂解，离心去除 细胞碎片，收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液。取第一代重组腺病毒悬液lmL，37°C浸染293T细胞1小时，再换成含有体积分数 为10%的胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，7天后离心收集细胞，于-80°c和37°C反复冻 融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液。 按照上述操作连续感染293T细胞扩增病毒几代后，葡萄串状细胞病灶逐渐增多和增大，至 100%细胞出现脱落后，转入175cm2大瓶扩增，收集细胞冻融裂解液(即前述含病毒上清 液)，采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，获得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病 毒 Sox9pro_Cbfalο2、PCR法鉴定Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒
以所得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal的基因组 DNA为模板，采用如下引物PCR扩增Cbfal基因cDNA片段上游引物5，_agtatttacaacaga gggcacaag-3，(SEQ ID No. 5)；下游引物5，-aacagcggaggcatttcg_3，(SEQ ID No. 6)。PCR 扩增条件为94°C变性1分钟、58°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30个循环，最后72°C延 伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果在约600bp处出现特异性条带，与目标片段 的分子量大小一致，表明Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal构 建成功。3、GFP阳性细胞计数法测定重组腺病毒滴度因腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，故采 用GFP阳性细胞计数法测定重组腺病毒滴度将293T细胞以细胞浓度为4X IO4 2X IO5/ mL接种于96孔细胞培养板中，80 μ L/孔，培养24小时后，10孔为1组，每孔设对应复孔，向 第1孔内加入重组腺病毒悬液20yL，混勻后取20yL按5 1倍比稀释后加入第2孔，再 从第2孔中取20μ L按5 1倍比稀释后加入第3孔，如此类推，从第9孔中取出20μ L弃 去，第10孔作为阴性对照，培养18小时后，以浓度自高到低的方向，在荧光倒置显微镜下观 察绿色荧光细胞的数量，如前一孔阳性细胞较多5个)，而此孔及以后各孔荧光消失，或 此孔阳性细胞较少(< 5个)而以后各孔荧光消失，则以此孔作为计量孔(计为1U)计算 病毒滴度。结果显示，所得Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal 的滴度约为1 X IO10 3 X IO10U。二、Sox9基因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒特异促成软骨分化1、经重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal处理的种子细胞体外促成软骨分化选用体外培 养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺病毒转染。实验分为A、B、C三组A组用Sox9基 因启动子调控的Cbfal基因重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal进行转染，B组用CMV启动子调控 的Cbfal基因重组腺病毒进行转染，C组为空白对照。具体转染方法为转染前用PBS冲洗 细胞，经胰酶/EDTA消化后，用2mL无抗生素的完全培养基重悬细胞，按5X IO5/孔接种于 6孔细胞培养板中，置温度为37°C、C02气体体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞生长至 90% 95%融合时，按MOI = 50进行重组腺病毒转染，37°C培养1小时后换成完全培养基 继续培养。A组培养48小时后在荧光显微镜下可见超过90%的细胞呈GFP阳性(图2)，表 明重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal已经成功转染间充质干细胞。分别将A组、B组已感染重组 腺病毒的间充质干细胞和C组处理细胞作为种子细胞，进行成软骨分化鉴定。分别取三组种子细胞各2. 5X IO5个，进行微团培养，用成软骨诱导培养基 (DMEM+10ng/mL转化生长因子β 1+50 μ g/mL维生素C+100 μ g/mL丙酮酸钠+100ng/mL地塞 米松+50mg/mL胰岛素+50mg/mL转铁蛋白+50mg/mL亚硒酸)在温度为37°C、C02气体体积 分数为5%、饱和湿度条件下培养2周后，进行如下检测(1) RT-PCR检测软骨特异性标志基因的表达分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，采用 Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，使用ImProm-II逆转录系统(Promega公司)将 总RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，采用PCR Master Mix试剂盒进 行PCR扩增，检测Sox9、Col2 α 1、Aggrecan基因的表达，以28sRNA做内参照。引 物序列如 T :Sox9-F 5 ‘ -tcctcaggctttgcgattt-3 ‘ (SEQ ID No. 7)，Sox9_R 5‘ -tgctcgggcac-ttattgg-3‘ (SEQ ID No. 8) ；Col2 α I-F 5' -tggtgctgctgacgctgctca tcgccacgacggtccta-3‘ (SEQ ID No· 9)，Col2α I-R :5' -gccttctgaaatcctccagccatctgggc cgc_3' (SEQ ID No. 10) ； Aggrecan-F 5' -tgctgtgcctcctcaaatgtcagagagtatct-3' (SE Q ID No. 11) ,Aggrecan-R -.5' -ctgctacacaggtgaagactttgtagacatcc-3' (SEQ ID No· 12)。 PCR扩增条件为95°C变性1分钟，58°C退火45秒，72°C延伸1分钟，共35个循环，最后72 延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Quantity One凝胶图像采集系统采集图像。 结果显示，A组种子细胞的Sox9、Col2 α UAggrecan基因表达明显高于B组和C组种子细 胞，提示本发明的重组腺病毒SoX9pro-Cbfal可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/ 软骨方向分化前提下向成软骨分化。(2)Western blot检测Sox9蛋白和II型胶原蛋白的表达分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用PBS洗涤3次后， 加入细胞裂解液，冰上裂解20分钟，离心收集上清液，与缓冲液混勻后煮沸5分钟，进行 SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后转移至PVDF膜上进行免疫杂交，检测Sox9蛋白和II型胶 原蛋白的表达，以β-actin蛋白做内参照。用Quantity One凝胶图像采集系统采集图像， 分析各条带的光密度值，计算蛋白相对表达量(目的蛋白与内参照的比值)。结果显示，A 组种子细胞的Sox9和II型胶原蛋白表达量明显高于B组和C组种子细胞。(3)甲苯胺蓝染色检测分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用体积分数为4% 的多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，甲苯胺蓝染色2分钟，再用体积分数为95%的乙 醇分色至背景清晰，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后进行观察。结果显示，A组 种子细胞的胞浆和胞外基质呈现甲苯胺蓝染色强阳性，说明细胞合成了软骨特异性细胞外 基质GAGs，而C组种子细胞的胞浆无明显蓝染，B组种子细胞的蓝染程度介于A组和C组之 间，提示Cbfal基因有促进间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化的 作用，但在Sox9基因启动子驱动下，此种作用明显增强。(4) II型胶原免疫组化染色检测分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用体积分数为 95%的乙醇固定20分钟，PBS洗涤3次，进行II型胶原免疫组化染色检测。结果如图4所 示，A组种子细胞的胞浆内有大量的荧光颗粒出现，呈现II型胶原免疫组化染色强阳性，表 示细胞合成了软骨特异性细胞基质II型胶原，而C组种子细胞的胞浆内无明显染色，B组 种子细胞的染色程度介于A组和C组之间，同样提示Cbfal基因有促进间充质干细胞在向 成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化的作用，但在Sox9基因启动子驱动下，此种作用 明显增强。2、经重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal处理的种子细胞在体修复关节软骨缺损选用体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞进行重组腺病毒转染，选用壳聚糖/ 磷酸甘油钠(C/GP)作为细胞支架材料。转染前用PBS冲洗细胞，经胰酶/EDTA消化后，用 2mL无抗生素的完全培养基重悬细胞，按5X 105/孔接种于6孔细胞培养板中，置温度为 37°C、CO2气体体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞生长至90% 95%融合时，按MOI =50转染重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal，37°C培养1小时后换成完全培养基继续培养。转 染1天后，用PBS冲洗细胞2次，经胰酶消化后，用PBS重悬细胞，IOOOg离心5分钟，弃上清，加入C/GP溶液小心吹打制成细胞浓度为1 X 107/mL的单细胞悬液，获得经重组腺病毒 Sox9pro-Cbfal 处理的 MSCs_C/GP 复合物。选用新西兰大白兔进行关节软骨缺损的修复。将兔麻醉后，取双膝关节内侧纵切 口，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜和关节囊，暴露膝关节关节面，用钻头在股骨内髁负重 区关节面上钻孔，造成直径为4mm、深度为3mm、穿透软骨下骨板的全层关节软骨损伤。实 验分为I、II、III三组1组在软骨缺损处植入上述经重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal处理的 MSCs-C/GP复合物，II组在软骨缺损处植入不含细胞的C/GP溶液，III组为空白对照。分 别于术后6周、12周各处死12只动物，取出膝关节进行观察。结果显示，术后6周时，I组标本软骨缺损区域由修复组织填充，色泽灰白，与周围 软骨组织结合良好，缺损边界较为明显，触之有一定硬度；II组标本软骨缺损区域修复组 织色泽乳白，表面光滑，质软；III组标本软骨缺损区域修复组织形成较少，修复组织表面 明显凹陷。术后12周，I组修复的关节面较光滑，修复组织与周围软骨基本整合，色泽相近， 质地较6周时明显变硬，细胞形态排列、基质及II型胶原与正常软骨组织相近(图5) ；II 组修复处表面略不平整，色泽变灰黄，组织学可见明显纤维组织修复缺损，甲苯胺蓝染色和 II型胶原免疫组化染色均呈弱阳性；III组软骨缺损区域凹陷，边界清晰，颜色不均一，缺 损边缘有少量修复，甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色均呈阴性。上述结果说明用感 染重组腺病毒SoxQpro-Cbfal的间充质干细胞构建的细胞支架复合物在体修复关节软骨 缺损可以取得良好的修复效果。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒，其特征在于包含一个由Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因表达盒。
2.根据权利要求1所述特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒，其特征在 于病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。
3.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒的制备方 法，其特征在于包括以下步骤a、核心结合因子al基因全长cDNA的克隆及核心结合因子al基因重组腺病毒穿梭质 粒的构建根据核心结合因子al基因全长cDNA的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分 别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的上、下游引物，以人成骨细胞总RNA为模板，通过 RT-PCR扩增获得核心结合因子al基因全长cDNA，再定向克隆至复制缺陷型腺病毒穿梭质 粒pAdTrack-CMV的多克隆位点Xho I和EcoRV之间，获得核心结合因子al基因重组腺病 毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV/Cbfal ；b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建根据Sox9基 因启动子片段的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所 示的上、下游引物，以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得Sox9 基因启动子片段，再定向克隆至真核表达载体pEGFP-m的多克隆位点BglII和Sal I之间， 获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/SoX9pro ；c、Sox9基因启动子调控的核心结合因子al基因重组腺病毒载体的构建自步骤b 所得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/S0X9pr0中用BglII和Sal I双酶切出Sox9 基因启动子片段，再定向克隆至步骤a所得核心结合因子al基因重组腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV/Cbfal的多克隆位点BglII和Sal I之间，获得Sox9基因启动子调控的核 心结合因子al基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-S0X9pr0/Cbfal，将其用Pme I酶切使 线性化后，再转化AdEasier-I细胞与复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι进行细胞内 同源重组，获得Sox9基因启动子调控的核心结合因子al基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/ Sox9pro-Cbfal ；d、Sox9基因启动子调控的核心结合因子al基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化将 步骤c所得Sox9基因启动子调控的核心结合因子al基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/ Sox9pro-Cbfal用脂质体法转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细 胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液；将第一代 重组腺病毒悬液感染人胚胎肾293T细胞以扩增病毒，待细胞出现明显病变时，离心收集细 胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液；按照上述 操作连续感染扩增病毒几代后，将所得含病毒上清液采用氯化铯密度梯度超离心法纯化， 即得Sox9基因启动子调控的核心结合因子al基因重组腺病毒S0X9pr0-Cbfal。
4.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒在制备定 向诱导成软骨分化的种子细胞中的应用。
5.利用权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒制备 定向诱导成软骨分化的种子细胞的方法，其特征在于先用特异促成软骨分化的核心结合 因子al基因重组病毒转染间充质干细胞，再用成软骨诱导培养基培养已感染重组病毒的 间充质干细胞，诱导间充质干细胞定向成软骨分化。
全文摘要
本发明公开了特异促成软骨分化的核心结合因子a1(Cbfa1)基因重组病毒及其制备方法和应用，该重组病毒包含一个由Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因表达盒；其制备方法包括Cbfa1基因全长cDNA的克隆及Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建，Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建，Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体的构建，Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化等步骤；该重组病毒可用于制备定向诱导成软骨分化的种子细胞，能够高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨方向分化。
文档编号C12N5/10GK101979520SQ20101029228
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者应大君, 康菲, 杨波, 董世武, 郭洪峰 申请人:中国人民解放军第三军医大学