专利名称：一种植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物表达载体。
背景技术：
20世纪以来，基因工程育种一直被认为是改良植物产量、品质和抗逆性的有效途 径。事实上，利用基因工程育种技术已经培育了一些转基因植物新品种，如转基因大豆、棉 花、玉米和油菜等，并在生产实践中得到了大面积应用。尤其近5年来，植物转基因研究的 发展非常迅速，利用转基因方法培育的植物品种逐年增加。同时，由于很多国家政府和消费 者对转基因植物安全性的重视，以及转基因植物内在的安全性障碍，多数转基因植物品种 难以获准商业化生产。其中，筛选标记基因的存在是转基因植物安全性的最大隐患之一。选择标记基因的广泛应用虽然提高了获得转基因植物的效率，但由于选择标记基 因大多属于编码抗生素或除草剂的抗性基因，随着选择过程的结束，这些外源选择基因在 植物基因组中的存在和表达变的多余，且它们会随着转基因植物的繁育而遗传给子代，从 而引发有关转基因植物安全的许多问题。转基因植物安全问题主要体现在食品安全和环境安全二个层面。在食品安全方 面，抗生素类基因及其产物对人类或者畜牧可能具有潜在毒性及致敏性，一旦食物中有所 残留，它们将有可能传入微生物中，进而可能增加人或动物消化道内的微生物数量，危及人 及牲畜的健康。在环境安全方面，选择标记基因有可能会通过基因漂移传播到野生近缘种 中，使杂草获得相应抗性，导致超级杂草的出现，此外，选择标记基因传播到其他生物体中， 可能会破坏生态系统的平衡。选择标记基因及其他冗余基因的剔除，可降低转基因植物的 潜在风险，利于转基因植物安全评价和推广。故此，培育安全型转基因植物是目前的研究热
；ο获得转基因植物涉及到的筛选标记有二类，其一是细菌筛选标记，如amp、kan、 aadA等，用于筛选构建的载体及转化的细菌；其二是植物筛选标记，如nptll、bar、hpt等， 用于筛选转化的植物细胞和再生植株。基因枪介导法不但转入了植物筛选标记，也转入了 细菌筛选标记。农杆菌介导法虽然可以避免将细菌筛选标记引入植物，但位于同一 T-DNA 区域的目标基因与筛选标记转入植物后紧密连锁。鉴于此，人们先后提出了几种获得无筛 选标记转基因植物的技术，包括共转化法、定位重组体系、多元自动转化载体系统、转座子 系统和同源重组体系等，但只有共转化法应用最为成功。基因枪介导的共转化法虽然可以 去除植物筛选标记，但不能去除细菌筛选标记。农杆菌介导的共转化法不但可以避免将细 菌筛选标记转入植物，而且可以避免将nptll、bar、hpt等筛选标记转入植物，在获得安全 型转基因植物方面具有独特优势。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物表达载体。本发明所提供的表达载体，按照包括如下步骤的方法得到在出发表达载体
3PZP201的HindIII和EcoRI酶切位点间插入SEQ ID NO :4所示DNA片段，得到中间载体I ； 再向中间载体I中的ScaI和ScaI酶切位点间插入含有如下片段的DNA片段LB、RB和SEQ ID NO :3所示DNA片段，得到目的表达载体；其中，RB位于SEQ ID NO 3所示DNA片段的5'端上游，LB位于SEQ ID NO 3所 示DNA片段的3'端下游；所述RB的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ IDNO 8 所示。本发明所提供的表达载体，还可以按照包括如下步骤的方法得到(1)用HindIII和EcoRI酶切载体PZP201，回收载体大片段；用HindIII和EcoRI 酶切载体PWMB006，回收4. Okb片段；将所述载体大片段与所述4. Okb片段连接，得到重组 载体，记作pWMBOll ；(2)用KpnI和SacI酶切pWMBOll，回收载体大片段；用KpnI和SacI酶切 pBluescript II-KS(-)，回收IOSbp片段；将所述载体大片段与所述IOSbp片段连接，得到 重组载体，记作PWMB012 ；(3)以 SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6 所示 DNA 片段为引物，以 pCAMBIA3301 载体 为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；用HindIII和EcoRI酶切PCR扩增片段，回收酶 切产物；用HindIII和EcoRI酶切载体ρΖΡΙΟΙ，回收载体大片段，将所述载体大片段与所述 酶切产物连接，得到重组载体，记作pWMBOlO ；(4)用ScaI酶切pWMB012，回收载体大片段；用ScaI酶切pWMBOlO，回收3. Okb片 段，将所述载体大片段与所述3. Okb片段连接，得到重组载体，即为目的表达载体；所述载体pWMB006按照包括如下步骤的方法得到用HindIII单酶切载体pRTL2， 回收2460bp片段；用HindIII单酶切载体pAHC25，回收4175bp的片段；将所述2460bp片段 与所述4175bp片段连接，得到重组载体，记作pWMB002 ；用BamHI及SacI双酶切pWMB002， 回收4635bp片段；用BamHI及SacI双酶切载体pTCK303，回收541bp片段；将所述4635bp 片段与所述541bp片段连接，得到载体PWMB006。上述任一所述表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用也属于本发明的 保护范围。上述遗传转化应用中，所述植物为小麦、玉米或水稻。所述小麦优选为小麦品种新
春9号。上述任一所述表达载体在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。上述植物育种应用中，所述植物为小麦、玉米或水稻。所述小麦优选为小麦品种新
春9号。其中，WMB为发明人所在小麦分子育种(Wheat Molecular Breeding)课题组缩写。实验证明，用本发明载体进行农杆菌转化，得到的转基因小麦植株中无外源抗性 筛选基因，保证了转基因植物的生物安全性。本发明载体可以方便、快捷插入目标基因，外 源基因可直接通过一步克隆便插入到本发明表达载体中，大大简化了操作步骤，无须构建 系列载体，操作简便，省时省力，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因 工程育种提供技术支撑，为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
图1为pWMB014表达载体构造。图2为pWMB002构建流程。图3为pWMB006构建流程。图4为中间载体pWMBO 10构建流程。图5为中间载体pWMBO 11构建流程。图6为中间载体pWMBO 12构建流程。图7为植物转化载体pWMBO 14构建流程。图8为pWMBO 14载体酶切鉴定。图9为pWMBO 15表达载体构造。图10为pWMB015载体酶切鉴定。图11为pWMB015载体转化小麦幼胚⑶S基因表达鉴定。图12为pWMB015载体中含有内含子的⑶S基因测序结果。图13为pWMBOlO载体中bar基因完整表达盒测序结果。图 14 为 Pubi-MCS-Osintron-MCS-Tnos 区段序列。图 15 为来自 pBluescript II-KS(-)的 MCS。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、pWMB014通用表达载体的制备与鉴定表达载体pRTL2、pZP101、pZP201、pCAMBIA3301 及 pBluescript II-KS (-)均购自 Biovector Science Lab (http //biovector. blog. 163. com/ ；电话18901268599)。克隆载体pEASY -Tl Simple购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为 CT111。表达载体pAHC25和pTCK303在文献(Christensen等，PlantMolecular Biology, 1992，18 675-689)和(Wang 等，Plant Molecular Biology R印orter，2004，22 409-417) 中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。SEQ ID NO=I 含ubi启动子启动的一段T-DNA区域，替换前；对应图14 ；SEQ ID NO 2 来自于 pBluescript II-KS(-)的多克隆位点，对应图 15 ；SEQ ID NO 3 含bar基因完整表达盒的T-DNA区域；对应图13，下划线为bar序 列；SEQ ID NO 4 含ubi启动子启动的一段T-DNA区域，替换后。一、pWMBO 14通用表达载体构建禾Ij用 pZPlOl、pCAMBIA330 1、pZP201、pRTL2、pTCK303、pAHC25、 pBlueSCriptII-KS(-)5个表达载体和pEASY _Tl Simple克隆载体逐步构建了用于获得安 全型转基因植物的pWMB014通用表达载体。1、向出发表达载体PZP201的HindIII和EcoRI酶切位点间插入第一段T-DNA区 域(含ubi启动子及nos终止子表达框)
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(l)pWMB006载体构建过程利用HindIII单酶切pRTL2及pAHC25，分别回收2460bp及4175bp的片段后连接， 从而构建出PWMB002载体(图2)。随后对pWMB002及pTCK303载体用BamHI及SacI进行 双酶切，分别回收4635bp及541bp片段后连接，构建出pWMB006载体(图3)。(2)插入大片段利用HindIII和EcoRI分别对pZP201和pWMB006进行双酶切，从pWMB006酶切 产物中回收4. Okb片段(含ubi启动子、Osintron和nos终止子)与pZP201连接，构建成 pWMBOll载体(图5)。将pWMBOll载体进行测序验证，结果在pZP201的HindIII和EcoRI 酶切位点间插入SEQ ID NO 1所示DNA片段。(3)替换利用KpnI 和 SacI 分别对 pWMBOll、pBluescript II-KS(-)进行双酶切，从 pWMBOll酶切产物中回收9. 7kb大片段(pWMBOll的主干序列)，从pBluescript II-KS (-) 酶切产物中回收IOSbp片段，将9. 7kb大片段与IOSbp片段进行连接，构建成PWMB012载体 (图6)。将pWMB012载体进行测序验证，结果图15所示序列替换了图14中下划线部分序 列。2、向pWMB012载体的ScaI和ScaI酶切位点间插入第二段T-DNA区域(含bar基 因完整表达盒)设计一对PCR 弓丨物 10135SHindIIIF 5 ‘ -GTAAGCTTGTATTGGCTAGAGCAGCTTG -3 ‘ (SF0 ID NO 5)和 101T35SEcoRIR 5 ‘ -CGAATTCACTACTGGATTTTGGTTTTAGGA-3 ‘ (SE0 ID NO 6)，从pCAMBIA3301载体上扩增出1550bp的bar基因完整表达盒(图 13，含35S启动子和35S polyA终止子)(即利用pCAMBIA3301载体作为模板扩增出 Hindi I I-35S-bar-polyA-EcoRI的表达盒)，两端添加HindIII和EcoRI酶切位点，先将 bar基因完整表达盒连接到pEASY -Tl Simple克隆载体上进行测序确认；利用HindIII和 EcoRI分别对ρΖΡΙΟΙ载体和pEASY -Tl Simple重组克隆载体进行双酶切，从pEASY _Tl Simple重组克隆载体酶切产物中回收1550bp的bar基因表达盒，连接到ρΖΡΙΟΙ载体上， 构建成pWMBOlO载体(图4)。将pWMBOlO载体进行测序验证，结果向ρΖΡΙΟΙ载体HindIII 和EcoRI位点间插入的DNA片段序列如SEQ ID NO 3所示。利用ScaI分别对pWMB012、pWMB010进行酶切，从pWMBOlO酶切产物中回收3kb (含 bar基因表达盒)的T-DNA区段与pWMB012连接，最终构建成pWMB014双T-DNA载体(图
7)。构建得到的载体pWMB014的结构如图1所示。将载体pWMB014进行测序验证，结果在 载体pZP201的HindIII和EcoRI分别间插入的序列如SEQ ID NO 4所示，在ScaI和ScaI 酶切位点间插入的DNA片段含有如下片段LB、RB和SEQ ID NO 3所示DNA片段，其中，LB 位于SEQ ID NO 3所示DNA片段的3'端下游，RB位于SEQ ID NO 3所示DNA片段的5' 端上游；所述RB的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ IDNO 8 所示。二、鉴定利用SacI酶切通用表达载体PWMB014，电泳，结果酶切片段大小为13kb左右(图
8)，与pWMB014载体预计大小相吻合。
三、本发明载体的使用本发明载体上含有二段彼此独立的T-DNA区域，第一段T-DNA区域携带ubi启动 子，ubi启动子下游为多克隆位点(多克隆位点包括XbaI、BamHI、SmaI、SpeI和SacI限制 性内切酶切点，可插入目标基因)，多克隆位点后面为nos终止子；第二段T-DNA区域含有 bar基因完整的表达盒，由35S启动子和polyA终止子调控，用于筛选转化后的植物细胞，获 得转基因植株。在PWMB014载体的T-DNA区外还含有aadA筛选标记(壮观霉素抗性)，该 标记用来筛选携带PWMB014载体的细菌，农杆菌转化后不随T-DNA区进入植物细胞。使用本发明载体时，可以采用XbaI、BamHI、SmaI、SpeI、SacI限制性内切酶对其进 行单酶切或双酶切后插入待转化的目标基因，重组后的载体可以转入任何根癌农杆菌和发 根农杆菌株系，携带重组载体的农杆菌可以用来转化任何植物(尤其用来转化小麦、水稻、 玉米、大豆和棉花等农作物)，利用bar基因进行筛选，在转基因T1-T2代可以筛选，得到只 含有目标基因且不含有bar基因及aadA基因2个筛选标记的转基因植物。关于本发明载 体的多克隆位点，BamHI与SmaI使用时只能选其一，且可与SpeI或SacI搭配使用。SmaI、 BamHI、SpeI不能与XbaI搭配使用，但可以和SacI搭配使用。实施例2.载体的应用-GUS基因向pWMB014中的插入和鉴定C58C 1 f艮癌农杆菌购自 Biovector Science Lab (http //biovector. blog. 163. ■Ζ ；电话18901268599)。小麦品种新春9号由国家农作物种质资源库保存并无偿提供用 户(中国农业科学院作物科学研究所，电话010-62189650)。一、⑶S基因向pWMB014中的插入设计一对PCR 引物⑶S014XbaI2F 5 ‘ -ATTCTAGAATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTC T-3'和 GUS014SacI2R :5 ‘ -ATGAGCTCTCACACGTGGTGGTGGTGGT-3 ‘，从 pCAMBIA3301 载体 上扩增2050bp的⑶S基因全长序列，二端添加XbaI和SacI酶切位点，先将⑶S基因全长 序列连接到pEASY -Tl Simple克隆载体上。然后，利用XbaI和SacI分别对pWMB014载体 和pEASY -Tl Simple重组克隆载体进行双酶切，从pEASY _Tl Simple重组克隆载体酶切 产物中回收2050bp的⑶S基因连接到pWMB014载体上，构建成pWMB015载体(图9)，即将 ⑶S基因0RF(0pen Reading Frame)插入到了 pWMB014载体上ubi启动子下游，用于验证 PWMB014通用载体的有效性。二、⑶S基因插入pWMB014后的鉴定利用SacI和XbaI双酶切含⑶S基因的重组表达载体pWMB015，得到一条2kb左右 的⑶S基因全长片段和一条13kb左右的pWMB014载体片段(图10)。进一步的测序表明全 长⑶S基因已正确导入pWMB014的多克隆位点处。测得的序列如图12所示。图12中，下 划线所示为来源于过氧化氢酶基因的内含子，从而使得PWMB015在农杆菌中不表达，避免 了假阳性。方框为构建时的酶切位点，分别是XbaI和SacI。然后，利用三亲交配法将pWMB015表达载体转入C58C1根癌农杆菌，侵染小麦品种 新春9号预培养4天的幼胚(开花授粉后12-13天，幼胚大小1. 0-1. 2mm)，在滤纸上共培养 2天后进行X-Gluc染色检测，结果GUS基因在小麦幼胚中较好表达(图11)，确认GUS基因 已正确插入PWMB015通用表达载体，并得到正确表达。上述实验证明，将⑶S基因插入本发明所构建的双T-DNA通用表达载体后，⑶S基 因正常表达，证明本发明构建的双T-DNA通用表达载体正确无误，可以方便、快捷插入任何功能基因(因为本发明所构建的双T-DNA通用表达载体上已含有表达功能基因所需要的 启动子和终止子，以及在启动子下游插入目标基因的多克隆位点)。利用二段彼此独立的 T-DNA载体进行农杆菌转化，农杆菌中的酶在LB和RB位点分别对二段T-DNA进行加工剪 切，产生2个T-DNA单链，二段T-DNA同时进入植物细胞，整合到不同染色体上或同一染色 体不同位点，获得Ttl代转基因植株。Ttl代转基因植株自交后二段T-DNA分离，亦即目标基 因与筛选标记基因分离，在后代中可以得到只有目标基因而没有筛选标记基因的植株，从 而保证了转基因植物的生物安全性。这方面已有许多成功的报道(Shirley等，2004，Crop Science, 44 :552_556 ；叶兴国等，2007，生物工程学报，23 :138_144 ；Behrens 等，2007， Science, 316 :1185_1188)。本发明构建的双T-DNA载体上含有多克隆位点和调控制序列， 可方便、快捷插入目标基因全长cDNA或gDNA，在获得安全型转基因植物方面具有潜在利用 价值。另外，上述实验中，外源基因可直接通过一步克隆载体便插入到本发明表达载体 中，大大简化了操作步骤，无须构建系列载体，操作简便，省时省力，降低了成本，提高了工 作效率。农杆菌转化植物原理农杆菌包括根癌农杆菌和发根农杆菌，分别携带Ti质粒和 Ri质粒，二种质粒上都含有一段可以转入植物细胞中的T-DNA，农杆菌侵染植物后伴随着 T-DNA的进入，构建到T-DNA上的目标基因即被带入植物，进一步进入细胞核，整合到染色 体上。研究表明，T-DNA可整合进植物基因组并表达产物，T-DNA上的基因不编码与T-DNA 转移有关的蛋白，并不与T-DNA的转移及整合有关，但T-DNA的转移和整合与其左右两端各 25bp的LB、RB同向重复序列关系密切，LB或RB —旦缺失，T-DNA则不能转入植物。T-DNA 转移由质粒上的Vir基因区控制，其大小约30kb，包括VirA、B、C、D、Ε、G、H等10个操纵 子，共计24个基因。植物受伤后产生的酚类物质激活VirA蛋白，自身磷酸化，进一步磷酸化 激活VirG蛋白，后者是一种DNA结合转录活化蛋白，特异性结合到其它Vir基因启动子区 上游的Vir box序列上，启动这些基因的转录。VirD产物在LB和RB位点对T-DNA进行剪 切，产生T-DNA单链，然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2蛋白组成的 复合物转入植物细胞。这种复合物在植物细胞中与DNA单链结合蛋白VirE2形成T链复合 物，在此过程中VirEl作为VirE2的特殊分子伴侣，具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA 链结合的功能。转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成 T链复合物，该复合物在VirD2和VirE2蛋白核定位信号引导下进入细胞核，然后T-DNA以 单拷贝或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上。通常，农杆菌转化中所用的载体只含有 一段T-DNA区域，目标基因与筛选标记基因在该区域串联，转入植物后紧密连锁遗传，很难 再后代中分离。利用本发明载体获得无筛选标记转基因植物原理本发明载体上含有二段彼此独 立的T-DNA区域，第一段T-DNA区域携带ubi启动子，ubi启动子下游为多克隆位点(多克 隆位点包括Xbal、BamHI, SmaI, SpeI和SacI限制性内切酶切点，可方便、快捷插入目标基 因)，多克隆位点后面为NOS终止子；第二段T-DNA区域含有bar基因完整的表达盒，由35S 启动子和35S终止子调控，用于筛选转化后的植物细胞，获得转基因植株。农杆菌介侵染植 物细胞时，VirD蛋白在LB和RB位点分别对二段彼此独立的T-DNA进行加工剪切，产生2个 T-DNA单链，二段T-DNA同时进入植物细胞，进一步整合到不同染色体上或同一染色体不同
8位点，获得Ttl代转基因植株。Ttl代转基因植株自交后，位于二段T-DNA上的目标基因与筛 选标记基因通过自由组合或染色体交换方式分离，在后代中可以得到只有目标基因而没有 筛选标记基因的植株。
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权利要求
一种表达载体，按照包括如下步骤的方法得到在出发表达载体pZP201的HindIII和EcoRI酶切位点间插入SEQ ID NO4所示DNA片段，得到中间载体I；再向中间载体I中的ScaI和ScaI酶切位点间插入含有如下片段的DNA片段LB、RB和SEQ ID NO3所示DNA片段，得到目的表达载体；其中，RB位于SEQ ID NO3所示DNA片段的5′端上游，LB位于SEQ ID NO3所示DNA片段的3′端下游；所述RB的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ IDNO8所示。
2.一种表达载体，按照包括如下步骤的方法得到(1)用HindIII和EcoRI酶切载体pZP201，回收载体大片段；用HindIII和EcoRI酶切 载体pWMB006，回收4. Okb片段；将所述载体大片段与所述4. Okb片段连接，得到重组载体， 记作 pWMBOll ；(2)用KpnI和SacI酶切pWMBOll，回收载体大片段；用KpnI和SacI酶切pBluescript II-KS (_)，回收IOSbp片段；将所述载体大片段与所述IOSbp片段连接，得到重组载体，记作 PWMB012 ；(3)以SEQID NO 5和SEQ ID NO 6所示DNA片段为引物，以pCAMBIA3301载体为模 板，进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；用HindIII和EcoRI酶切PCR扩增片段，回收酶切产 物；用HindIII和EcoRI酶切载体ρΖΡΙΟΙ，回收载体大片段，将所述载体大片段与所述酶切 产物连接，得到重组载体，记作pWMBOlO ；(4)用ScaI酶切pWMB012,回收载体大片段；用ScaI酶切pWMBOlO,回收3.Okb片段， 将所述载体大片段与所述3. Okb片段连接，得到重组载体，即为目的表达载体；所述载体PWMB006按照包括如下步骤的方法得到用HindIII单酶切载体pRTL2，回收 2460bp片段；用HindIII单酶切载体pAHC25，回收4175bp的片段；将所述2460bp片段与所 述4175bp片段连接，得到重组载体，记作pWMB002 ；用BamHI及SacI双酶切pWMB002，回收 4635bp片段；用BamHI及SacI双酶切载体pTCK303，回收541bp片段；将所述4635bp片段 与所述541bp片段连接，得到载体pWMB006。
3.权利要求1或2所述的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物为小麦、玉米或水稻。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述小麦优选为小麦品种新春9号。
6.权利要求1或2所述的表达载体在植物育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为小麦、玉米或水稻。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述小麦优选为小麦品种新春9号。
全文摘要
本发明公开了一种植物表达载体及其应用。该载体按照包括如下步骤的方法得到在出发表达载体pZP201的HindIII和EcoRI酶切位点间插入SEQ ID NO4所示DNA片段，得到中间载体I；再向中间载体I中的ScaI和ScaI酶切位点间插入含有如下片段的DNA片段LB、RB和SEQ ID NO3所示DNA片段，得到目的表达载体。本发明载体可以方便、快捷插入目标基因，外源基因可直接通过一步克隆载体便插入到本发明表达载体中，大大简化了操作步骤，无须构建系列载体，操作简便，省时省力，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供技术支撑，为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
文档编号C12N15/82GK101962657SQ20101029324
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者佘茂云, 冯晨, 别晓敏, 叶兴国, 徐惠君, 李欣, 杜丽璞, 殷桂香, 王新敏 申请人:中国农业科学院作物科学研究所