专利名称：转基因兔的生产方法
技术领域：
本发明涉及家畜生产的基因工程技术，尤其是涉及一种转基因兔的生产方法。
背景技术：
不饱和脂肪酸是细胞的基本组分之一，其摄入数量和类型直接影响到消费人群的 健康，有报道称高水平摄入n-6多聚不饱和脂肪酸(n-6 PUFAs)，尤其是同时伴有低水平 摄入n-3多聚不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)，会明显增加患乳腺癌、大肠癌和前列腺癌的危险 性。目前，大部分西方国家人民体内n-6/n-3 PUFAs的比例超过18 1，由此引发多种细胞 和机体功能障碍甚至癌症。这主要是由于哺乳动物体内缺乏合成n-3 PUFAs前体的酶，也 缺乏能够将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs的酶。因此，增加n_3 PUFAs的摄入量对于人类 健康具有极其重要的意义。家兔是一种用途广泛的经济性动物，目前国内外市场兔肉需求量不断加大。一方 面因为家兔具有繁殖速度快、生产周期短等优点；另一方面，兔肉蛋白质含量显著高于猪 肉、牛肉和羊肉，同时其脂肪含量低且多为不饱和脂肪酸。因此，大力发展养兔业不仅可以 增加农民收入，而且还能提高人们的健康和生活水平。近年研究发现线虫Caenorhabditis elegans (C. elegans)的n_3脂肪酸去饱 和酶能够以十八碳或二十碳的n-6 PUFAs为底物分别合成相应的n-3 PUFAs。此外，线 虫C. elegans的n-3去饱和酶基因(Fatl)被转入哺乳动物细胞以及小鼠能使其n_3 PUFAs (从十八碳到二十二碳)的含量显著提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉且快速的转基因兔的 生产方法，以改善家兔的肉质提高兔肉中不饱和脂肪酸含量，为人们的健康生活提供富含 n-3PUFAs的肉类食品。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案转基因兔的生产方法，该方法包 括以下步骤(1)克隆Fatl基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fatl基因和PGK1调控元件用来构建Fatl基因真核表达载 体；(3)将步骤(2)所得Fatl基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄性兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与 雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fatl基因的转基因兔。Fatl基因为序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列。克隆Fatl基因中设计合成的特异引物为P1 5' CTTCCGACATTGATTATTGAC3‘禾口 P2:5' GATCCACATGATAAGATAC3‘。PGK1调控元件为序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列。
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Fatl 基因真核表达载体为 pMD-PGKl-Fatl-CMV-EGFP。注射以DMS0或脂质体为转导试剂配制注射液。本发明采用Fatl基因和PGK1调控元件构建了 Fatl基因真核表达载体，通过睾丸 注射向雄性家兔的精原细胞中导入Fatl外源基因，然后由PCR检测阳性的雄兔与正常雌兔 交配，所产F1代仔兔即是整合Fatl外源基因的转基因兔。因为Fatl基因表达的n_3去饱 和酶能使哺乳动物体内十八碳或二十碳的n-6 PUFAs转化成相应的n-3 PUFAs，所以本发明 获得的转Fatl基因兔，其兔肉中不饱和脂肪酸的组成和含量应有明显改善。
图1是转Fatl基因组成型真核表达载体构建示意图。图2是Fatl基因真核表达载体的物理图谱。
具体实施例方式1.调控元件的克隆与验证应用oligo6. 0软件设计一对特异性扩增引物P1 :5，GAATTC AATGTAGGAGAGTTCCAGTGGC 3，(5'含 Kpnl 位点)禾口P2 :5，CTCGAG GATGAGACAGCGGCAGAGAC 3' (5'含 Xho I 位点)。以水牛基因 组为模板，并以PI、P2为引物，按照以下程序进行扩增94°C预变性2min ；以94°C 30sec, 64°C 3min，反应35个循环，64°C延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5 10 y L进行琼 脂糖凝胶电泳检测获得PGK1基因调控元件DNA片段。应用胶回收试剂盒回收目的片段，将 回收的片段与PMD-18T载体以摩尔比约2-10 1混合，按说明书14 16°C水浴反应过夜， 次日取5yL lOyL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌 落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h ；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10 y L 灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2XCracking buffer ；轻轻混勻后取 15 yL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，纯化后送上海捷瑞生物公司进行测 序验证，获得质粒PMD18T-PGK1。测序结果表明，PGK1基因调控元件长2013bp (见序列表 SEQ. ID. No. 2)。纯化质粒pMD18T-PGKl和pEGFP-附，以Sal I和BamH I对两个质粒分别进行双酶 切，得到含有水牛PGK1启动子的片段，将其连接到酶切去除CMV启动子的pEGFP-Nl中，最 终建成含有水牛PGK1基因启动子的真核表达载体pPGKl-EGFP-Nl，长达6. 2Kb。采用PCR 和酶切分析对构建载体进行全面验证，确认得到了设计的真核表达载体。用Omega无内毒 素质粒小量提取试剂盒提取构建好的pPGKl-EGFP-Nl，并以ApaL I酶切线性化后电泳胶回 收；或以ApaL I酶切后用2. 5倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠沉淀DNA。12000rpm 离心10分钟，收集沉淀，75%乙醇洗涤。真空抽干，溶解DNA于灭菌超纯水中。兔胎儿成纤维细胞培养与转染取预处理兔胎儿体部皮肤组织剪切成1mm3左右 的小块。用0. 25%胰蛋白酶消化后，用含15% FCS的DMEM培养液制备细胞悬液，最终以 1 X 106个/mL的密度接种于培养瓶，置37°C、5% C02饱和湿度的培养箱中进行原代培养，每 隔3 4天换一次液。当原代细胞生长至90%汇合时，按照1 3比例进行传代培养。阳 性脂质体法细胞转染外源DNA片段将传至3代的细胞生长到80-90%汇合时开始转染。将2. 0u g线性化pPGKl-EGFP-Nl质粒DNA稀释在100 u L无血清双抗的培养液DMEM中，轻轻 混勻。脂质体使用前先轻轻摇勻，取15y L脂质体稀释在lOOy L无血清双抗的培养液DMEM 中，混勻，室温放置5min。将含有质粒DNA的DMEM和含有脂质体的DMEM轻轻混勻，室温静 置20min，使形成DNA-脂质体复合体。在DNA/脂质体混合液中继续加入800 u L无血清双 抗培养液DMEM，混勻。取欲转染的细胞，吸出培养液，再用无血清双抗培养液DMEM洗细胞2 次。将DNA-脂质体混合液加入培养皿中，前后轻轻摇晃培养皿使之分布均勻，放入C02培 养箱内，37°C培养8h。吸出转染液，加入2mL不含双抗的培养液DMEM+10% FCS，继续培养， 转染后24h在荧光显微镜下观察，能够看到部分家兔胎儿成纤维细胞表达EGFP，证明水牛 PGK1启动子可以启动目的基因在家兔细胞中转录。2.转Fatl基因组成型真核表达载体的构建(见图1和图2)(1)目的基因Fatl的获得设计合成特异引物P1: 5 ‘ CTTCCGACATTGATTATTGAC3 ‘和 P2 :5 ‘ GATCCACATGATAAGATAC3 ‘，以实验室保存的 pMD-Fatl质粒DNA为模板，按照以下程序进行扩增94°C预变性2min ；以94°C 30sec, 58°C 30sec，72°C lmin20sec，反应35个循环，72°C延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5 10UL进行琼脂糖凝胶电泳检测获得Fatl基因编码片段。应用胶回收试剂盒回收目的片 段，将回收的片段与PMD-18T载体以摩尔比约2-10 1混合，按说明书14 16°C水浴反应 过夜，次日取5yL lOyL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出 的单菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h ；用枪头挑取少量菌体，涂于含有 10 iiL灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2XCracking buffer ；轻轻混勻 后取15 yL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，纯化后送上海捷瑞生物公司进 行测序验证，经PCR扩增获得长1209bp的Fatl基因编码序列DNA (见序列表SEQ. ID. No. 1)， 共编码403个氨基酸，密码子在线虫序列的基础上进行了优化，更加适合在哺乳动物中表 达。(2)真核表达载体骨架用纯化质粒pcDNA3. 1㈠和pMD18T_PGKl，分别用BamHI 和Nhel进行双酶切，胶回收获得PGK1片段和去除了 CMV的pcDNA3. 1 (-)片段，以摩尔比约 2-10 1混合，按说明书14 16°C水浴反应过夜，次日取5iiL 10iiL连接产物转化感 受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线 培养12-16h ；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10 y L灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后， 加入等体积的2 X Cracking buffer ；轻轻混勻后取15 y L电泳，设阴性对照，鉴定出插入目 的片段的克隆，获得重组质粒pPGKl-cDNA3. 1作为真核表达的骨架。(3)转Fatl基因组成型真核表达载体构建用试剂盒纯化含有目的基因 Fatl质粒pMD-Fatl和pPGKl_cDNA3. 1，分别应用Nhel加Aflll双酶切，纯化获得线性 pPGKl-cDNA3. 1片段和Fatl编码片段，然后按上文所述的方法进行连接，转化和筛选，获得 载体pcDNA3. 1-PGKl-Fatl，经过酶切和PCR验证载体构建正确。设计特异性扩增引物P1 5' CTTCCGACATTGATTATTGAC3‘禾口 P2:5' GATCCACATGATAAGATAC3‘，弓丨物两端带有 BamHI 和SacI酶切位点，以pcDNA3. l-PGKl-Fatl质粒DNA为模板进行PCR扩增，获得PGKl-Fatl 基因片段，TA 克隆到 pMD-18T 获得 pMD-PGK 1 -Fat 1。用 BamHI 加 Sac I 双酶切 pMD-PGK 1 -Fat 1 和实验室保存的载体pMD-CMV-EGFP，将酶切产物胶回收后，按照上述连接方法连接、转化和 筛选，获得阳性重组质粒
pMD-PGKl-Fatl-CMV-EGFP，经酶切、PCR和测序验证载体构建正确。3.睾丸注射法生产转基因兔(1)两种研究方法一种为DMS0与DNA共注射，雄性家兔4只，对照组1只，雌性 家兔25只；另一种为脂质体与DNA共注射，雄性家兔4只，对照组1只，雌性家兔25只。(2)注射液 1:脂质体(LipefectaminTM-2000)质粒(pPGKl-Fatl-EGFP)= 3 1，溶于DMEM。注射液2 :DMS0 质粒40 u g/ml (线性环状=3:1)。对照组注 射液4% DMS0 禾口 PBS。(3)注射量和注射频率孵育液每次注射500 u 1/侧，每周注射1次，共注射4次。(4)雄兔麻醉称重，速眠新II肌肉注射麻醉(0. l_0.2ml/kg)，待完全麻醉后，绑 定在绑定架上。(5)睾丸组织注射①剪毛，用酒精棉球擦拭，使其睾丸血管明显，术者用拇指和 食指将睾丸挤入阴囊并固定；②用一次性胰岛素注射器吸取500 yl注射液，用酒精棉球擦 拭，小心避开血管，进针深度15mm，每侧睾丸注射2-4点，尽量使注射液分布均勻且对睾丸 损伤最小，针头进入机体后应缓慢移动，注射单点完毕后应缓慢移出针头，并将注射完毕的 雄兔放于室温下苏醒；③注射完毕后小心按摩，使注射液尽快吸收，酒精棉球消毒。(6)睾丸注射后的护理精心饲养，防止撕咬睾丸，观察睾丸变化情况。注射后家 兔睾丸会比正常睾丸膨胀和坚硬，一般3-5d后该现象自行消失。2周后，家兔的性欲变得正
堂
巾o(7)雄兔的人工采精在进行第四次注射后，对雄兔进行人工采精，具体步骤如 下用于采精的假阴道由外壳、内胎和集精管(杯)三部分组成。外壳用硬制塑料管制成， 其长约10厘米，直径约4厘米，在中段钻一直径0. 5厘米的小孔，安上活塞，以便由此灌入 热水和吹气调压。内胎由避孕套制成，用剪去盲端的避孕套翻套在管子两端，并用橡皮筋箍 牢。集精管可以用玻璃试管代替。假阴道的温度要控制在45 47°C。注意避孕套用前 要经过高温处理，防止杀精物质影响精子质量。采精操作用正常雌兔作为雄兔爬跨的台 兔。采精者一手抓住雌兔两耳和颈皮，放入雄兔笼内，使雌兔后躯朝向笼内。雄兔爬跨雌兔 时，采精者用另一手持假阴道伸入雌兔腹下，使假阴道开口紧贴在雌兔阴户下方，并使假阴 道与水平面成30°左右的角度，即假阴道的开口端稍低，集精管一端稍高。当雄兔阴茎反复 抽动时，采精者持假阴道的手指可感觉到雄兔阴茎挺出的方向，及时调整假阴道的位置和 角度，以利雄兔阴茎顺利伸入假阴道射精。雄兔射精后即将假阴道开口端抬高，从雌兔腹下 抽出，放掉假阴道内的水，用集精管收集精液。收集到精液后，要及时去除精清，将精液放在 保温盒里保存。(8)精子基因组的提取将采集到的精子分装到1. 5ml Eppendorf管中，并逐一编 好序号；7200rpm离心5min，倒上清液，加入PBS液洗沉淀并用移液器吹打混勻；7200rpm离 心5min，倒上清液，加精子抽提液并用移液器吹打至肉眼看不到沉淀；加入20iU蛋白酶K， 用封口胶封住Eppendorf管，放入水浴锅55°C水浴过夜消化直至溶液澄清透明为佳。每管 加入5 10 ill RNA酶，加等体积PH8. 0的Tris饱和酚，轻倒混勻lOmin, 12000rpm离心 lOmin，用枪头将上层液相移到另一 Eppendorf管中；加入1 1酚仿(饱和酚/氯仿)轻倒 混勻lOmin，12000rpm离心lOmin，抽提上层液相；加入等体积的氯仿抽提，轻倒混勻lOmin， 12000rpm离心lOmin，抽提上层液相；加入10%体积醋酸钠，再加入2倍体积预冷过的无水
6乙醇，来回颠倒沉淀DNA ； 12000rpm离心20min将DNA沉入管底，小心倒去上清液；用75% 乙醇洗两次DNA ；用pH8. 0的TE溶液或灭菌双蒸水溶解DNA。经紫外分光光度计检测后，将 DNA稀释成相同的浓度。(9)PCR扩增验证精子中外源基因的整合设计合成一对转基因的验证引物为5' -GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3‘和5' -CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'，理论扩增产物大小为 645bp，反应体 系为20 iil，按照以下程序进行扩增94°C预变性5min ；以94°C 30sec，6rC 30sec，72°C 50sec,反应35个循环，72°C延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5 10 y L进行琼脂糖 凝胶电泳检测，获得清晰条带的雄兔，表明精子的阳性率较高，取对应雄兔进行下一步的与 雌兔交配试验。(10)雌兔的交配和仔兔的鉴定对精子基因组PCR检测阳性的个体，选择外阴部 潮红的雌兔进行交配试验，交配分两次进行中间间隔12小时。仔兔出生7-10d后，断其尾 部约0. 3-0. 5cm，用作基因组DNA的提取。将断尾放入预冷的离心管，用剪刀将组织块在冰 上剪得尽可能碎，加入200 yl抽取液；加入蛋白酶K储存液震荡至彻底悬浮；每管加入5 10 ill RNA酶；加等体积PH8. 0的Tris饱和酚，轻倒混勻lOmin, 12000rpm离心lOmin,用枪 头将上层液相移到另一Eppendorf管中；加入1 1酚仿(饱和酚/氯仿)轻倒混勻lOmin， 12000rpm离心lOmin，抽提上层液相；加入等体积的氯仿抽提，轻倒混勻lOmin，12000rpm离 心lOmin，抽提上层液相；加入10%体积醋酸钠，再加入2倍体积预冷过的无水乙醇，来回颠 倒沉淀DNA ；7000rpm离心4min将DNA沉入管底，小心倒去上清液；用75 %乙醇洗两次DNA ； 用PH8. 0TE溶液或灭菌双蒸水溶解DNA ；测定浓度后4°C保存。为增加检测的准确性，应用两对PCR引物进行检测，一对是5' -GAATTC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3‘和5' -CTCGAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3‘，该对引物理论扩增 EGFP 片段长度 为700bp。其反应体系为20ul，反应程序为94°C预变性5min ；以94°C 30sec，61°C 30sec, 72°C 50sec，反应35个循环，72°C延伸8min。另一对引物是5 ‘ -ATGGTCGCTCATTCCTCAGAAG-3‘和5' -TTACTTGGCCTTTGCCTTCTCC-3‘，该对引物理论扩增Fatl基因片段长度为 1200bp。反应体系为 20ul，反应程序为94°C预变性 5min ；以 94°C 30sec，66°C 30sec，72°C 80sec,反应35个循环，72°C延伸8min。PCR反应结束后，取反应液5 10 y L进行琼脂糖 凝胶电泳检测，对PCR反应阳性的仔兔进行统计分析。试验例试验先将质粒(pPGKl-Fatl-EGFP) cDNA完整序列按常规方法提取、纯化、酶切鉴 定后，用于转基兔的研究。然后，配制注射液1 脂质体(LipefectaminTM-2000)质粒 (pPGKl-Fatl-EGFP) = 3 1，溶于 DMEM。注射液 2 :DMS0 4% ；质粒40 u g/ml (线性环 状=3 1)。接着，将注射液多点注射到睾丸实质部，注射量为500 yL/侧，每隔一周注射 一次，共注射4次，从第一次注射日期始，一个月后对雄兔进行人工采精。通过对精子DNA的 PCR阳性检测，筛选出精子呈阳性的雄兔4只，其中分别选择注射液1和注射液2的雄兔与 正常雌兔交配。所产仔兔经PCR阳性检测，注射液1的F1代仔兔阳性率为61. 5% (8/13)， 注射液2的F1代仔兔阳性率为56. 5% (13/23)。
权利要求
一种转基因兔的生产方法，其特征在于包括以下步骤(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fat1基因和PGK1调控元件用来构建Fat1基因真核表达载体；(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄性兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fat1基因的转基因兔。
2.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述Fatl基因为序列表 SEQ. ID. No. 1的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述克隆Fatl基因中设 计合成的特异引物为P1 5' CTTCCGACATTGATTATTGAC3‘禾口 P2:5' GATCCACATGATAAGATAC3‘。
4.根据权利要求1至3任一所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述PGK1调控 元件为序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列。
5.根据权利要求4所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述Fatl基因真核表达 载体为 pMD-PGKl-Fatl-CMV-EGFP。
6.根据权利要求5所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述注射以DMS0或脂质 体为转导试剂配制注射液。
全文摘要
本发明公开了一种转基因兔的生产方法，该方法包括以下步骤(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fat1基因和PGK1调控元件用来构建Fat1基因真核表达载体；(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄兔与雌兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fat1基因的转基因兔。其中，Fat1基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，PGK1调控元件为序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。本发明通过导入线虫的n-3去饱和酶基因(Fat-1)，获得转Fat1基因兔新品系。
文档编号C12N15/85GK101979585SQ201010298039
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者刘庆友, 刘玉兵, 石德顺, 陆凤花 申请人:广西大学