野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体的制作方法

文档序号:586272阅读:291来源:国知局
专利名称:野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体的制作方法
技术领域
本发明涉及了野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体的构建,属于分子生物学 领域。
背景技术
随着全球水资源危机和土壤盐渍化问题的加剧,盐胁迫已经成为影响作物生长, 导致作物减产的重要因素。我国耕地中有将近1/10是盐渍化土壤,主要分布在西北、华北 等粮食主产区,盐渍化能造成植物细胞内水分和离子平衡的破坏,引起氧化胁迫,破坏蛋白 质的功能,导致植物在形态、生理、生化和分子方面的严重变化,影响作物的生长和产量。转 基因技术是解决盐渍化问题的有效途径之一,将耐盐相关基因克隆并转化作物,使其在作 物中过量表达,将会大幅提高作物的耐盐能力。P5CS编码高等植物体内脯氨酸合成途径的一个关键酶Δ ‘-吡咯啉-5-羧酸 合成酶。该酶具有谷氨酸激酶(Y-glutamyl kinase, γ _GK)和Y-谷氨酰磷酸还原酶 (y -glutamylphosphate reductase, y -GPR)双重活性,催化脯氨酸生物合成的前两步 谷氨酸磷酸化及谷氨酸-Y -半醛还原(参考文献Hu CAA, Delauney A J,Verma D P S. A bifunctionalenzyme(Δ ‘ -pyrroline-5-carboxylate synthetase)catalyzes the first two steps in prolinebiosynthesis in plants. Proc Natl. Acad. Sci. 1992,89 9354-9358)。耐盐基因P5CS转化植物提高植物的耐盐性已有诸多报道Zhu等(1998) 将来源于乌头叶豇豆的P5CS连接在胁迫诱导启动子后转化水稻,脯氨酸在胁迫下超量合 成积累,其第二代转基因植株在渗透胁迫下表现出的生物量增加明显高于非转基因组。 (参考文献:Zhu B C,Su J,ChangM C,Verma DPS,Fan Y L,WU R. Overexpression of a Δ ' -pyrroline-5-carboxylatesynthetase gene and analysis of tolerance to water-and salt-stress in transgenic rice. PlantScience. 1998,139 41~48) ;Aida 等 (2005)将拟南芥的P5CS由农杆菌介导转化马铃薯,在IOOmM NaCl培养条件下,转基因马铃 薯的脯氨酸积累量高于对照组,转基因马铃薯对于高盐胁迫表现出了较高的耐受性。(参 考文献:Aida H S, Radhia G B, AmiraB, Lei L J, Arnould S, Samir J. Overexpression of Δ ' -pyrroline-5-carboxylate synthetaseincreases proline production and confers salt tolerance in transgenic potato plants. PlantScience. 2005,169 746-752.)在植物的遗传转化途径中,农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一,其中找到 合适的植物表达载体至关重要。将耐盐基因克隆并连接到合适的植物表达载体,可以直接 用于农杆菌介导的植物遗传转化,获得耐盐新种质。对于优良耐盐新品种的培育,具有重要 的意义。

发明内容
技术问题本发明涉及了野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体的构建,属于分子生物学领域。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化,获得耐盐 新种质,提高目标植物的耐盐性。技术方案野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体,其构建方法如下1)野生茄子耐盐基因StP5CS的克隆选用野生茄子(为日本砧木品种,购自日本Takii种苗株式会社)幼嫩叶 片为材料,提取总RNA,反转录成cDNA,参照番茄耐盐基因P5CS序列信息(参考文 献:MaggioA, Garcia-Rios Μ, Fujita Τ, Bressan, R A. and Csonka, L N. Cloning of tomPROl(AccessionNo. U27454)and tomPR02(Accession No. U60267)from Lycopersicon esculentum L. coexistence of policistronic and monocistronic genes which encode the enzymes catalyzingthe first two steps of proline biosynthesis(PGR96-077). Plant Physiol. 1996,112 =862-870) (NCBI登录号U60267),设计特异引物扩增野生茄子 耐盐基因StP5CS 上游引物ZHPs:5' -CACATTTCTGCTCCTACATT-3‘下游弓丨物ZHPa 5 ‘ -CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3 ‘以反转录的cDNA作为模板,进行PCR反应,产物回收并连接到pMD19_T载体 (TaKaRa),转化T0P10感受态细胞(南京天为生物技术有限公司),进行序列测定;2)中间载体 pCAMBIAl301_BI220 的改造Hind III (Promega)和 EcoR I (Promega)双酶切 pCAMBIA1301 (澳大利亚国际 农业分子生物学应用中心)和pBI220. 6(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),回收 PCAMBIA1301 的大片段(11787bp)和 pBI220. 6 的小片段(1200bp),按 1 4 的比例用 T4DNA 连接酶(TaKaRa)连接,连接产物转化T0P10感受态细胞(南京天为生物技术有限公司),提 取质粒,进行双酶切验证,得到改造好的中间载体PCAMBIA1301-BI220 ;3)植物表达载体 pCAMBIA1301-BI220-StP5CS 的构建设计引物以野生茄子cDNA作为模板,用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)进行PCR反应,在StP5CS的上游和下游分别引入酶切位点 BamHI(GGATCC)禾口 Sma I (CCCGGG)上游引物ZHPMBsI :5' -CGCGGATCCCACATTTCTGCTCCTACATT-3‘下游引物ZHPMSal :5' -TCCCCCGGGCTTCCTAAATACACAACTGGAT-3‘BamH I (Promega)和 Sma I (Promega)双酶切 pCAMBIA1301_BI220 中间载体和 PCR 产物,回收PCAMBIA1301-BI220大片段和StP5CS小片段(2250bp),按1 4的比例用T4DNA 连接酶(TaKaRa)连接,产物转化T0P10感受态细胞(南京天为生物技术有限公司),提取质 粒,进行双酶切验证,植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS构建成功。植物表达载体 pCAMBIA1301-BI220-StP5CS可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化,用于植物新品种的改 良,提高作物的耐盐能力。有益效果1.本发明首次构建了含有StP5CS的植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS, 可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化,提高作物的耐盐能力,获得耐盐新种质,用于植物 新品种的改良。
2.本发明构建载体所用到的基因来源于野生茄子,具有较好的品种来源,用于转 化作物可以避免作物中脯氨酸底物对StP5CS产物活性的干扰。


图lStP5CS琼脂糖凝胶电泳分析1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)2 :StP5CS ;图2中间载体pCAMBIA1301-BI220质粒双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)2,3 :pCAMBIA1301-BI220/Hind III/EcoR I ;图3植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS质粒双酶切检测琼脂糖凝胶电泳 分析1:DNA Marker(15Kb/10Kb/7. 5Kb/5Kb/2. 5Kb/lKb/0. 25Kb)2,3 :pCAMBIA 1301-BI220_StP5CS/BamH I/Sma I ;图 4 植物表达载体 pCAMBIA 1301_BI220_StP5CS 图谱
具体实施例方式植物表达载体pCAMBIA1301-BI220_stP5CS 的构建1. StP5CS 的克隆选用野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor’(为日本砧木品种,购 自日本Takii种苗株式会社)作为材料,幼苗期(4-5片真叶)用IOOmmol -L^NaCl连续胁 迫处理5天,取幼嫩叶片,参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒说明书方法,提取叶片总RNA 并反转录成cDNA,用RNase消化cDNA产物,参照番茄耐盐基因P5CS序列信息(NCBI登录 号TO0267),经01igo6. 0软件分析设计引物扩增野生茄子耐盐基因StP5CS ;上游引物ZHPs:5' -CACATTTCTGCTCCTACATT-3‘下游引物ZHPa 5 ‘ -CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3 ‘以提取的叶片cDNA为模板,进行PCR反应,50 μ L反应体系10 X RCR Buffer 5. 0μ L, ZHPs, ZHPa 弓丨物各 1. 0μ L(20ymol · L-1),dNTP mix 4. 0μ L(2. 5mmol · L-1),Taq DNAPolymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 8 μ L ;反应程序95°C预变性4min,然后94°C解链30sec,52. 7°C退火30sec,72°C延伸 2min 30sec,反应30个循环,72°C延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯 化,用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19_T载体(TaKaRa),转化T0P10感受态细胞(南 京天为生物技术有限公司),进行序列测定;2.中间载体 pCAMBIA1301-BI220 的改造Hind III (Promega)和 EcoR I (Promega)双酶切 pCAMBIA1301 (澳大利亚国际 农业分子生物学应用中心)和pBI220. 6(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),回收 PCAMBIA1301的大片段和ρΒΙ220· 6的小片段,按1 4的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连 接,产物转化Τ0Ρ10感受态细胞(南京天为生物技术有限公司),提取质粒,酶切验证①取质粒载体pCAMBIA1301 和 ρΒΙ220. 6 各 15 μ L,分别用 Hind III(Promega)和 EcoR 1(卩1~011^83)双酶切,5(^1^酶切体系10\81^作『E 5 μ L, BSA 0. 5yL,质粒 PCAMBIA1301 或 ρΒΙ220· 615 μ L, Hind III 1. 25 μ L, EcoR I 1. 25 μ L, ddH20 27 μ L ;37°C 酶切反应3h,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒 PCAMBIA1301大片段和质粒pBI220. 6小片段。②回收质粒pCAMBIA1301 大片段(11787bp)和质粒 ρΒΙ220· 6 小片段(1200bp), 按照1 4的比例用T4DNA酶(TaKaRa)连接,连接反应体系(25 μ L) 10XT4Iigase Buffer2. 5 μ L, pCAMBIA1301 大片段 2 μ L, pBI220. 6 小片段 8 μ L, T4DNA 连接酶 1 μ L, ddH20 11. 5μ L ; 16°C过夜反应,取10 μ L连接产物转化TOPlO感受态细胞,涂板37°C过夜培养;挑 取单克隆扩大培养后,提取质粒,进行酶切验证;PCAMBIA1301-BI220中间载体改造完成;3.植物表达载体 pCAMBIA1301-BI220-StP5CS 的构建设计引物进行PCR反应,在目的基因StP5CS的上游和下游分别引入酶切位点 BamHI 和 Sma I,BamH I (Promega)和 Sma I (Promega)双酶切 pCAMBIA1301_BI220 中间载 体和PCR产物,回收pCAMBIA1301-BI220大片段和StP5CS小片段,按1 4的比例用T4DNA 连接酶(TaKaRa)连接,产物转化TOPlO感受态细胞(南京天为生物技术有限公司),提取质 粒,进行双酶切验证上游引物ZHPMBs 1 :5' -CGCGGATCCCACATTTCTGCTCCTACATT-3‘下游引物ZHPMSal :5' -TCCCCCGGGCTTCCTAAATACACAACTGGAT-3‘①以野生茄子叶片cDNA作为模板,用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)进行 PCR 反应,50 μ L 反应体系=IOXRCR Buffer 5. O μ L,ZHPMBs 1、ZHPMSal 引物各 1· O μ L(20 μ mol · I71), dNTP mix 4. Ομ L(2. 5mmol · I71), PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0. 4yL, cDNA 模板 lyL,ddH20 37. 6 μ L ;反应程序95 °C 预变性 4min,然后 98 °C 解链 10sec,68°C延伸2min 30sec,反应30个循环,72°C延伸lOmin。PCR产物用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN)回收,进行序列测定;②取改造好的质粒载体pCAMBIA1301-BI220. 615 μ L和第①步所得到的StP5CS分 别用 Sma I (Promega)禾Π BamH I (Promega)分步双酶切,分步酶切体系(50 μ L) 10 X Buffer E 5μ L, BSA 0. 5μ L,质粒 pCAMBIA1301_BI220. 6 或 StP5CS 15 μ L, Sma II. 25 μ L, ddH20 28. 25 μ L ;25°C 反应 3h 后,65 °C 保温 IOmin,待冷却后补加 BamH II. 25 μ L, 37 °C 反应3h;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒 PCAMBIA1301-BI220. 6 大片段和 StP5CS 小片段;③回收的质粒pCAMBIA1301-BI220. 6大片段和StP5CS小片段,按照1 4的比 例,用 T4DNA连接酶(TaKaRa)连接,连接反应体系(25 μ L) =IOXT4Iigase Buffer 2. 5 μ L, PCAMBIA1301-BI220. 6 大片段 2 μ L, StP5CS 小片段 8 μ L, T4DNA 连接酶 1 μ L, ddH2011. 5 μ L ; 16°C过夜连接反应,取10 μ L连接产物转化TOPlO感受态细胞。37°C过夜培养,挑取单克隆 扩大培养,提取质粒,进行酶切验证。植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS的构建成 功。综上所述,本发明构建了含有野生茄子耐盐基因StP5CS的 pCAMBIA1301-BI220-StP5CS植物表达载体,其中StP5CS首次报道。所构建的载体可导入大 豆及其他作物中,提高作物的耐盐性。
权利要求
野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体,其构建方法包括1)野生茄子耐盐基因StP5CS的克隆以提取的野生茄子幼嫩叶片为材料,提取总RNA,反转录为cDNA,设计引物扩增StP5CS,上游引物ZHPs5′ CACATTTCTGCTCCTACATT 3′下游引物ZHPa5′ CTTCCTAAATACACAACTGGAT 3′以反转录的cDNA为模板,进行聚合酶链式反应PCR,产物连接到pMD19 T载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;2)中间载体pCAMBIA1301 BI220的改造Hind III和EcoR I双酶切载体pCAMBIA1301和pBI220.6,回收pCAMBIA1301的大片段和pBI220.6的小片段,按体积1∶4的比例用T4DNA连接酶连接,得到中间载体pCAMBIA1301 BI220,产物转化TOP10感受态细胞,提取质粒,进行酶切验证;3)植物表达载体pCAMBIA1301 BI220 StP5CS的构建设计引物以野生茄子cDNA为模板,用高保真酶进行PCR反应,在StP5CS的上游和下游分别引入BamH I和Sma I酶切位点,上游引物ZHPMBs 15′ CGCGGATCCCACATTTCTGCTCCTACATT 3′下游引物ZHPMSa15′ TCCCCCGGGCTTCCTAAATACACAACTGGAT 3′用BamH I和Sma I双酶切PCR产物和pCAMBIA1301 BI220质粒,回收酶切产物,用T4DNA连接酶连接,连接产物转化TOP10感受态细胞,提取质粒,进行酶切验证,植物表达载体pCAMBIA1301 BI220 StP5CS构建成功。
2.权利要求1所述植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS在提高作物的耐盐性方 面的应用。
全文摘要
本发明涉及野生茄子耐盐基因StP5CS植物表达载体,属于分子生物学领域。以野生茄子叶片cDNA为模板,克隆StP5CS并连接到载体pMD19-T。改造pCAMBIA1301和pBI220.6载体,得到中间载体pCAMBIA1301-BI220。BamH I和Sma I双酶切StP5CS和改造的中间载体pCAMBIA1301-BI220,回收并连接酶切产物,得到最终的植物表达载体pCAMBIA1301-BI220-StP5CS。将该植物表达载体用于作物遗传转化,StP5CS在CaMV35S启动子的启动下超量表达,大量合成脯氨酸生物合成关键酶,植物体内积累脯氨酸,提高植物耐盐性。
文档编号C12N15/82GK101955971SQ201010501799
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者张功臣, 朱月林, 杨立飞, 盖钧镒 申请人:南京农业大学
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