专利名称：一种运用一步rt-pcr法检测犬瘟热病毒的方法
技术领域：
本发明属病毒检测领域，具体涉及一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法。
背景技术：
^iSf!;(Canine distemper) ^(Canine distemper virus)弓 的高度接触性、急性传染病。CDV在分类上属副粘病毒科麻疹病毒(MV)属，与麻疹病毒、牛 瘟病毒之间有密切的抗原关系和共同特征，并与其超微形态和结构完全一样，而且与新城 疫及其他副粘病毒非常相似。犬瘟热病毒是一种传染性极强的病原体，在易感的犬和水貂 中很容易传播。病毒存在于肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等多种器官与组织中，通过眼泪、鼻 液、唾液、尿液和呼出的空气向外排出病毒。犬瘟热一年四季均可发生，但以冬春多发，本病 有一定的周期性，每三年一次大流行，不同年龄、性别和品种的犬均可感染，但以未成年的 幼犬最为易感。临床上以双相热、急性鼻卡他、结膜炎及其后出现的支气管炎或肺炎、胃肠 炎和神经症状为特征。犬瘟热是当前我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害 最大的疫病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30%-80%，雪貂高达100%。这 不但给毛皮动物养殖场(户)造成了严重的经济损失，且严重地影响和制约整个产业的快 速发展。根据CDV的流行病学资料及临床症状，如双向热、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫 角化过度等主要症状，可做出初步诊断；而确诊则需要依据实验室检测，如理包涵体检查、 病毒分离等，其中检测特异性抗体进行诊断的前提条件是发病动物没有疫苗接种史，这些 方法包括琼脂扩散沉淀试验、ELISA和中和试验、荧光抗体技术以及其他免疫组化技术。虽 然上述方法取得了一定的效果，但有的耗时较长，有的敏感性、特异性或准确性较差，不能 及时确诊。
发明内容
本发明目的在于提供一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法，以解决⑶V 检测时耗时长、敏感性及特异性差、准确性不高的问题。为了实现本发明目的，本发明的技术方案采用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒，针 对GeneBank中⑶V的N基因设计一对特异性引物，序列如下
上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，。本方法的具体步骤如下
1)犬瘟热病毒样品总RNA提取，并测提取后总RNA的浓度；
2)—步RT-PCR法扩增⑶V的N基因片段；
3)取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。步骤1)所述的犬瘟热病毒样品总RNA提取，包括以下步骤
3A、分泌物(鼻、眼睛、消化道)、脏器(心、肝、脾、肺、肾、)和脑组织及淋巴结的预处理 ①组织样品的预处理取样品稀释液，(0. 01mol/LPBS(pH7. 2-7. 4)) IOX稀释研磨待 检脏器及脑组织，取100 μ 1研磨液，置1. 5ml离心管中，保存于_20°C待检。②液体样品(鼻液、眼部结膜分泌物、唾液、尿液)的预处理用棉签采集的液体样 品处理时，将采集棉签倒置于离心管中，加入样品稀释(0. 01mol/LPBS(pH7. 2-7. 4) ) 4°C静 置2h，4°C>2000-3000r/min离心IOmin,取上清200 μ 1，置1. 5ml离心管中，保存于_20°C待 检。B、提取总 RNA
取待检样品200μ 1于1. 5mlEppendorf管中，加入800 μ ITrizol，充分混勻，静置 5min，加入 200 μ 1 氯仿剧烈震荡 30s，4°C、12000r/min 离心 lOmin，取水相 400-600 μ 1，加 入等体积的异丙醇轻轻颠倒混勻，4°C预冷IOmin后，4°C、lOOOOr/min离心lOmin，弃去上 清，加入 600 μ 175 % 乙醇，4°C、10000r/min 离心 lOmin,弃去上清，加入 20 μ IDEPC- H2O 溶 解RNA沉淀。步骤2)所述的一步RT-PCR反应体系为 总RNA溶液
dNTPs (2. 5mM) IOXTaq Buffer MgCL2
引物 CDV 1 (20 μ Μ) 引物 CDV 2 (20 μ Μ) Ex-Taq 聚合酶(OT/μ 1) M-MuLV 反转录酶(200υ/μ 1) Ι.ΟμΙ RNasin (40U/y 1)
10. Ομ 1 5. Ομ 1
5. Ομ 1
10 μ 1
2. Ομ 1 1· Ομ 1 0. 5μ 1
1· Ομ 1
DEPC-H2O
总体积
步骤2)所述的-
14. 5μ 1
50 μ Io
-步RT-PCR反应程序为42°C反转录30min，94°C灭活反转录酶
-个循环，共401
2min，预变性 94°C 2min ；然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，此步骤为-循环；最后72°C延伸IOmin0
⑶V基因组为负链线性RNA病毒，由15690个碱基组成，⑶V基因组中包括6 ^
非重叠基因区，它们的编码基因按3'
5'端顺序依次为N-P-M-F-H-L系
列，其中N蛋白是保护性较强的免疫源性蛋白，具有包裹和保护内部基因的功能，N基因是 CDV的不同毒株、不同基因型间相对保守的结构基因，本发明根据N基因的特点设计了一对 特异性引物用于一步RT-PCR快速检测。 本发明的有益效果本发明建立了可以对多种犬瘟热病毒易感的动物组织样品及 液体样品CDV检测的普遍方法，具有灵敏度高、快速、检测准确、易于操作、污染率低、成本 低的优点。
图1为一步RT-PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图，从左至右1_8泳道依次
4为检测样品；泳道9为阳性对照组；泳道10为阴性对照组；M为DL 2000bpmarkero
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所用方法如无特殊说明为常规方法。实施例1液体样品总RNA的提取
1)液体样品(鼻液、眼部结膜分泌物及唾液)的预处理
分别用棉签采集发病动物的鼻液、眼部结膜分泌物及唾液样品，将采集完的棉签 倒置于离心管中，加入样品稀释液(0. Olmol/LPBS (pH7. 2-7. 4) ) 4°C静置2h，2000_3000r/ min离心lOmin，取上清200μ 1，置1. 5ml Eppendorf管中，明确标记后，放入_20°C待检； 2)样品总RNA的提取 取待检样品200μ 1于1. 5ml Eppendorf管中，加入800 μ 1 Trizol，充分混勻，静 置5min ；加入200μ 1分析纯氯仿剧烈震荡30s，4 °C、12000r/min离心IOmin ；取水相 400-600 μ 1，加入等体积的异丙醇轻轻颠倒混勻，4°C预冷IOmin后，4°C、10000 r/min离 心IOmin ；弃去上清，加入600 μ 1 75 %乙醇，4°C、10000r/min离心IOmin ；弃去上清，加入 20 μ IDEPC-H2O 溶解 RNA 沉淀。同时以犬瘟热病毒弱毒株细胞培养物作为RT阳性对照样品，以未接毒细胞培养 物作为阴性对照样品，与检测样品同时进行总RNA的提取，并做好标记。实施例2运用一步RT-PCR检测液体样品中⑶V 1、设计一步RT-PCR的扩增引物
针对GeneBank中⑶V的N基因设计一对特异性引物，序列如下 上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，； 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。2、RT-PCR反应体系的建立
提1)取的总RNA沉淀加入20 μ 1 DEPC-H2O使其溶解，取10 μ IRNA溶液，加入 2. 5mmol/LdNTPs 5. 0 μ 1，IOXTaq Buffer 5. 0 μ LMgCL2 10 μ 1，20pmol/μ 1 的引物 CDV 1 2. 0μ l，20pmol/y 1 的引物 CDV 2 1. 0μ l,5U/y IEx-Taq 0. 5 μ 1，200υ/μ 1 的 M-MuLV 反 转录酶 1. 0μ 1，40υ/μ 1 的 RNasin 1. 0μ 1, DEPC-H2O 14. 5 μ 1，反应的总体为 50 μ 1。同时分别以阳性对照的总RNA、阴性对照的总RNA为模板，建立RT-PCR反应体系， 做好标记。其中一步RT-PCR反应程序为
42°C反转录30min，94°C灭活反转录酶2min，预变性94 °C 2min ；然后94 °C lmin， 52°C lmin，72°C lmin，此步骤为一个循环，共40个循环；最后72°C延伸lOmin。3、取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定
分别取阳性对照、阴性对照及检测组的一步RT-PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电 泳，在紫外灯下观察扩增结果，
实验结果如图1所示在阳性对照组，第9泳道出现一条片段大小为240bp的特异性条 带，在阴性对照组，第10泳道未出现一条片段大小为240bp的特异性条带；在第2泳道为⑶V犬的鼻分泌物样品检测组，第3泳道为⑶V犬的眼部结膜分泌物样 品检测组，7泳道为CDV犬的唾液样品检测组，在这三条泳道中也均出现一条片段大小为 240bp的特异性条带，说明检验结果为阳性；
1、4、5泳道为健康犬的鼻分泌物样品检测组，6泳道为健康犬的眼部结膜分泌物样品 检测组，8泳道为健康犬的唾液样品检测组，以上各泳道均无条带出现，说明检验结果为阴 性；
综上，采用此方法可准确检测到犬瘟热病毒。
权利要求
一种运用一步RT PCR法检测犬瘟热病毒(CDV)的方法，其特征在于针对GenBank中CDV 的N基因设计一对特异性引物，序列如下上游引物CDV 15’ GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC 3’；下游引物CDV 25’ CCAAGAGCCGGATACATAG 3’；以CDV 1/ CDV 2为引物，扩增产物大小为240bp。
1.一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒(⑶V)的方法，其特征在于针对GenBank 中CDV的N基因设计一对特异性引物，序列如下上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，； 以CDV 1/ CDV 2为引物，扩增产物大小为240bp。
2.根据权利要求1所述的运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病I 包括以下步骤1)犬瘟热病毒样品总RNA提取，并测提取后总RNA的浓度；2)—步RT-PCR法扩增⑶V的N基因片段；3)取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.根据权利要求2所述的运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病 骤2)所述的一步RT-PCR反应体系为总RNA溶液 dNTPs (2. 5mM) IOXTaq Buffer MgCL2 (2. 5mM) 引物 CDV 1 (20 μ Μ) 引物 CDV 2 (20 μ Μ) Ex-Taq 聚合酶(OT/μ 1) M-MuLV 反转录酶(200υ/μ 1)Ι.ΟμΙRNasin (40U/μ 1)Ι.ΟμΙ；的方法，其特征在于步10 μ 1 5. 0μ 15. 0μ 110 μ 1 2. 0μ 1 1. 0μ 1 0. 5μ 1DEPC-H2O14. 5μ 1总体积50 μ 1。
4.根据权利要求2所述的运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法，其特征在于步 骤2)所述的一步RT-PCR反应程序为42°C反转录30min，94°C灭活反转录酶2min，预变性 940C 2min;然后94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，此步骤为一个循环，共40个循环；最后 72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法，该方法步骤如下将RT-PCR检测的样品进行预处理后，提取总RNA，通过一步RT-PCR反应获得特异性扩增产物，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。本发明方法具有灵敏度高、特异性强、操作步骤简便、污染率低，检测结果可信的特点，获得的序列信息直接用于流行毒株遗传衍化关系分析，适用于犬瘟热的病原学诊断和流行病学研究。
文档编号C12Q1/70GK101974653SQ20101050572
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者吴红云, 李建正, 范金红 申请人:郑州后羿制药有限公司