专利名称：一种植物耐高pH盐碱基因SucHP及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，确切地说一种植物耐高pH盐碱基因SucHP及应用。
背景技术：
由于自然因素及人为因素的长期影响，全球范围内的土壤盐碱化日趋严重。目前， 全球约有10亿公顷盐碱地，而我国盐碱地面积为9913万公顷(约占世界总面积的10% )。 这些盐碱地主要包括以NaCl、Na2SO4等中性盐为主的盐土，以及以NaHC03、Na2CO3等碱性盐 为主的苏打盐碱土。在我国日益扩大的内陆盐碱地中，很大部分是苏打盐碱土。这类土壤 中，由于大量碳酸盐(NaHCO3、Na2C03)的水解作用，土壤pH高达8. 0以上。因此，苏打盐碱 土中NaHCO3、Na2CO3对植物的胁迫因素除了和NaCl、Na2SO4共有的离子毒害、渗透胁迫之外， 还有高PH值及其造成的矿质元素可利用性明显降低等因素。在我国东北西部较严重的盐 碱地区仅限几个种类的植物零星地分布于这种土壤，其他植物几乎不能生存，给当地的农 业生产、经济以及生态环境的发展带来了巨大的影响。因此，提高作物的耐盐碱能力，尤其 是耐高PH盐碱胁迫的能力，培育耐高盐碱作物新品种具有重要意义。因此，对植物耐盐碱 分子机制的研究，以及通过基因工程技术培育耐盐碱作物新品种已成为近年来国际植物分 子生物学研究领域的一个前沿内容。在高盐碱下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐碱胁迫造成 的毒害。但是，目前国内外有关植物耐盐碱分子机制与基因工程的研究，主要以NaCl为 研究对象(Sahuet al,2009 ；Qudeimat et al,2008 ；Rapala-Kozik et al. ,2008 ；Wu et al.，2004)，而对苏打盐碱土中NaHCO3、Na2CO3等胁迫作用的机理研究较少(Zhang et al.， 2006)。最近，定位在液泡膜上的质子泵基因从许多植物中分离出来。研究结果表明液泡 膜质子泵将细胞质中的H+泵入液泡中，一方面，建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及 其他溶质进出液泡提供驱动力，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离 子(比如Na+和CD对细胞质的毒害及pH值的作用(Queiros et al.，2009 ；Shi et al.， 2003 ；Blumwald et al.，2000)，有利于细胞质中生理生化反应的顺利进行。这大大促进了 耐盐碱基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。2001年，Gaxiola等将带有35S启动 子的AVPl基因转入拟南芥，与同基因型的野生型相比，AVPl超表达的转基因植株耐盐性和 耐旱性显著提高。Park等将AVPl基因转入番茄(Lycopersicon esculentum)的一个商业 栽培品种(money maker)中，转基因植株表现出下列特点根系生长较为强壮，生物量显著 增加；根系液泡中积累大量依赖于H+-PPase驱动而运输的阳离子，因而转基因植株耐旱性 明显增强(Park et al, 2005,Proc Natl Acad Sci USA, 102(52) :18830_18835)。但是，国 内外学者对于耐高pH盐碱的研究还未见报道。碱蓬(Suaeda corniculate)是一年生藜科植物，营养丰富，是一种优质蔬菜和油 料作物。碱蓬又是一种盐生植物，俗称“盐蒿”、“海鲜菜”，喜高湿、耐盐碱、耐贫瘠、少病虫 害，是种天然的无公害绿色食品，适于沿海地区沙土或沙壤土种植。碱蓬是一种高耐盐碱的 野生植物，它在生长的过程中能够从盐碱地里吸取盐碱，改良土壤，进而引来其它草生长，
3使盐碱地转化成新草原。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐高pH盐碱基因SucHP。一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其碱基序列如SEQ ID No, 1所示；所述的SucHP，由此推得蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；它是从碱蓬中分离出编码液泡膜质子泵的全长cDNA ；一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，是由下述的方法获得1)将碱蓬种子用升汞消毒后，插种于MS培养基中，3周后将幼苗转移至水培系统， 在水培系统中培养4周后用IOOmM NaHCO3 200mM NaCl进行处理，处理24h后，采取整株植 株，分离碱蓬总RNA;2)采用磁珠法分离纯化mRNA、利用Library Construction Kit试剂盒反转录，建 立碱蓬cDNA文库；利用PCR-Select cDNA Subt raction Kit试剂盒抑制消减杂交构建 SSH文库；然后用在SSH文库中已鉴定的碱蓬耐盐碱关键基因，即质膜型H+-Ppase基因片段 为探针，筛选碱蓬cDNA文库，从而获得上述基因的全长cDNA片段。本发明又一个目的是提供一种植物耐高pH盐碱基因SucHP的制备方法1)提取碱蓬总RNA，采用磁珠法分离纯化mRNA，反转录为cDNA，人工合成下述引 物引物 1:5' -AAAAAGCAGGCTATGAGTGGCATTCTTCTTC-3'引物 2 5 ‘ -AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTCAAGAGCA-3 ‘引物 3 5 ‘ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 ‘引物 4 5 ‘ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 ‘2)利用引物1和引物2，以碱蓬的总RNA反转录的cDNA为模板，进行第一轮PCR 扩增，得到2295bp SucHP基因片段；3)以第一轮的PCR产物稀释100倍为模板，使用引物3、引物4，进行第二轮PCR扩 增，得到纯化的2295bp SucHP基因片段。本发明的另一个目的是，提供一种植物表达载体，其特征在于，它含有上述纯化的 SucHP基因片段。本发明的又一个目的是，一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，在转基因植物中的应用。本发明一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，是利用抑制差减杂交和高密度点阵膜技 术研究碱蓬苗期高PH盐碱胁迫诱导基因的表达，从碱蓬中首次分离出编码液泡膜质子泵 的基因，将该基因构建正义表达载体，转化拟南芥，转基因植株具从有较高的耐高PH盐碱 性，在100mMNaHC03+200mM NaCl, pH8. 5条件下，能正常生长，该基因可用于植物的遗传转 化，提高植物的耐盐碱能力。
图1是盐碱胁迫处理碱蓬的RT-PCR检测结果。图2是酶切载体pCB35S-SucHP-GFP后1 %琼脂糖凝胶电泳检测得到的基因2295bp片段产物。图3是不同浓度的盐和盐碱处理转基因拟南芥植株图片。图4是不同浓度的盐和盐碱处理转基因拟南芥种子图片。具体发明实施方式实施例1 碱蓬液泡膜质子泵基因SucHP的克隆1)总RNA的提取碱蓬种子采自吉林省白城地区。将碱蓬种子用升汞消毒 后，播种于MS培养基中，3周后将幼苗转移至水培系统，在水培系统中培养4周后用 100mMNaHC03+200mM NaCl进行处理；处理24h后，采取整株植株(包括根系和叶片)，液氮 固定后，贮于-80°C冰柜备用；采用RNAeasy mini kit (promoga公司产品)提取碱蓬总RNA ； 2)分离上述盐碱处理的碱蓬总RNA，采用磁珠法(Promega公司)分离纯化mRNA、 利用Library Construction Kit(Clontech)试剂盒反转录，建立碱蓬cDNA文库；利用 PCR-SeIec 1 cDNA Subt raction Kit(Clontech)试剂盒抑制消减杂交构建 SSH 文库3)通过筛选克隆的SSH文库，获得多个阳性克隆。用ABI377测序仪对阳性克隆测 序，共获得质量较好的EST (Expressed Sequence Tag)序列，对位比较后获得不重复EST ； 将不重复EST序列在NCBI上与Genbank中的dbEST库进行同源性比较，发现其中一些EST 可以找到序列同源性较高的cDNA ；这些基因都是在生物体中直接或间接对细胞遭受逆境 胁迫起保护作用的基因；4)利用液泡膜质子泵基因H+-Ppase基因片段为探针，筛选碱蓬cDNA文库，从而获 得碱蓬液泡膜质子泵基因SucHP的全长cDNA片段；5)基因克隆取2 μ 1 PCR与pMD18_T载体进行连接，操作步骤按Promcga公司产 品PMD18-T Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α南株(本实 验室保存)，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素 (100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜；6)质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA ；7)序列测定本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行，测定结果，其 DNA序列测定，得到全长为2295bp的cDNA片段，包括起始密码子和终止密码子；由此推得 其764个氨基酸的一段序列，其碱基序列如SEQ ID No 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。实施例2RT-PCR检测盐碱胁迫的碱蓬RT-PCR 检测引物引物5 (上游序列)5，-CTgCTggAAACACTACCgCT-3，引物 6 (下游序列)5，-CATTgTCCCAAgCACCTCCT-3，
引物 7 (上游序列)5，-TACCACATCCAAggAAggCA-3，引物 8 (下游序列)5，-ACCCAAAgTCCAACTACgAg-3，引物5和引物6是载体中SucHP基因的引物，扩增片段为569bp ；引物7和引 物8为内参基因Actin的引物，扩增片段为438bp ；碱蓬分别经250mM NaCl和200mM NaCl+100mMNaHC03处理0h、6h、12h、24h、48h。以碱蓬根，茎和叶的cDNA为模板，检测基因 的表达；PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，结果
5显示SucHP基因的表达具有一定的盐碱诱导性。实施例3植物表达载体pCB35S_SucHP的构建根据SEQ ID No 1序列，设计构建表达载体的加ATTBl和ATTB2接头引物引物 1 5 ‘ -AAAAAgCAggCTATgAgTggCATTCTTCTTC-3 ‘引物 2 5 ‘ -AgAAAgCTgggTTTAgAAgATCTTCAAgAgCA-3 ‘引物 3 5, -ggggACAAgTTTgTACAAAAAAgCAggCT-3 ‘引物 4 5 ‘ -ggggACCACTTTgTACAAgAAAgCTgggT-3 ‘1)以碱蓬总cDNA为模板，利用加ATTBl和ATTB2接头的引物1、引物2进行第-轮PCR扩增，扩增体系如下扩增体系和程序为
2 X Taq Mix12 5μ 1
引物11.0μ 1
引物21.0μ 1
模板DNA1.0μ 1
ddH209.5 μ 1
权利要求
1.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP表达的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2 所示。
3.根据权利要求1所述的一种植物耐高PH盐碱基因SucHP，其特征在于，它是从碱蓬 中分离出来的cDNA。
4.根据权利要求3所述的一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其特征在于，它是由下述 的方法获得1)将碱蓬种子用升汞消毒后，播种于MS培养基中，3周后将幼苗转移至水培系统，在水 培系统中培养4周后用IOOmM NaHC03+200mM NaCl进行处理，处理24h后，采取整株植株， 分离碱蓬总RNA ；2)采用磁珠法分离纯化mRNA、利用LibraryConstruction Kit试剂盒反转录，建立碱 蓬cDNA文库；利用PCR-Select cDNA Subt raction Kit试剂盒抑制消减杂交构建SSH文 库；然后用在SSH文库中已鉴定的碱蓬耐盐碱关键基因，即质膜型H_-PpaSe基因片段为探 针，筛选碱蓬cDNA文库，从而获得上述基因的全长cDNA片段。
5.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP的制备方法1)提取碱蓬总RNA，采用磁珠法分离纯化mRNA，反转录为cDNA，人工合成下述引物引物 1 5 ‘ -AAAAAGCAGGCTATGAGTGGCATTCTTCTTC-3 ‘引物 2 5 ‘ -AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTCAAGAGCA-3 ‘引物 3 5 ‘ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 ‘引物 4 5 ‘ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 ‘2)利用引物1和引物2，以碱蓬的总RNA反转录的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增、 得到2295bp SucHP基因片段；3)以第一轮的PCR产物稀释100倍为模板，使用引物3、引物4，进行第二轮PCR扩增， 得到纯化的2295bp SucHP基因片段。
6.一种植物表达载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的纯化的SucHP基因片段。
7.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，在转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，它是利用抑制差减杂交和高密度点阵膜技术研究碱蓬苗期高pH盐碱胁迫诱导基因的表达，从碱蓬中首次分离出编码液泡膜质子泵的基因，将该基因构建正义表达载体，转化拟南芥，转基因植株具从有较高的耐高pH盐碱性，在100mM NaHCO3+200mM NaCl，pH8.5条件下，能正常生长，该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐碱能力。
文档编号C12N15/82GK102002505SQ201010508079
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者刘亮, 李海燕, 王南, 王莹 申请人:吉林农业大学