专利名称：一株沙门氏菌噬菌体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株噬菌体菌株及其应用，特别涉及一株沙门氏菌(Salmonella)强 裂解性噬菌体PSA-6在预防食品及控制食品加工环境净化方面的应用。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人兽共患病原菌，为人类食物中毒引起胃 肠炎的主要病原菌之一，在医学、兽医和公共卫生上均有十分重要的意义。WHO将沙门氏菌 列入具有严重危害的食物传播性病原。目前，在我国发生的各类细菌性食物中毒中，由沙门 氏菌污染而引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，由沙门氏菌引起的食品安全事故占我 国细菌性食物中毒的70% 80%。由此可见，沙门氏菌等微生物污染已对我们的食品安全 构成了主要的威胁。而预防和控制这类细菌最常用的方法是采用抗生素，但使用抗生素易在食品中残 留，长期使用还会使沙门氏菌产生耐药性，因此，亟待研究开发一种新型的疗法和产品，以 解决和应对细菌对抗生素耐药性问题，以控制食物细菌性污染。噬菌体是一类细菌依赖性病毒，可以吞噬、侵染细菌，并在菌体内繁殖使细菌裂解 而杀灭细菌。其被发现于1个世纪以前，前苏联和东欧的许多国家临床使用噬菌体已有80 多年经验。但随抗生素的发现，科学家几乎停滞了对噬菌体的研究。现今，随着耐药菌株日 益显现和抗生素的使用弊端，噬菌体又被科学家重新认识并利用其可以特异性裂解病原菌 的特性，开展新的细菌性感染治疗途径。噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时非常有效，且杀 死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，是一种潜在的新型抗菌剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对沙门氏菌(Salmonella)有强裂解性的噬菌体。本发明的另一目的是针对目前食品中沙门氏菌污染严重、给人类健康带来一定 的危害等问题，提供一种新的防治产品和防治手段，开发一种新的对沙门氏菌引起的食品 污染有显著防治效果的单一或组合药物产品和防治方法。该噬菌体PSA-6可以特异性的灭 活沙门氏菌，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体来源。本发明的目的是这样实现的一株沙门氏菌噬菌体，其特征在于保藏号为 CCTCCM 2010226，该噬菌体命名为 PSA-6，其对沙门氏菌 ATCC 13076、ATCC 13311 和 CVCC 2184都有裂解作用；该噬菌体具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约64nm，尾部 长约114nm;噬菌体株在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规 则，直径为1 2mm;取纯化的噬菌体颗粒，用蛋白酶K消化噬菌体衣壳，释放出核酸，酚氯 仿抽提，溶解定量后分别采用Dnase I, Rnase A及限制性核酸内切酶Hind III酶切噬菌体 基因组核酸，酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA分子(dsDNA)；根据国际病毒分类委员 会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》为标准，该噬菌体应属于肌尾病毒科。在本发明中所述的噬菌体在30 60°C中放置60min，其活性稳定，在70°C中放 置60min效价降低两个数量级，在80°C中则失活；pH为4时，其效价降低约两个数量级；pH 为5. 0 10. 0时，其效价与初始效价无显著性差异。一种上述噬菌体的应用，其特征在于将沙门氏菌噬菌体纯化后，用于抑制沙门氏菌。在所述的噬菌体的应用中将获得的噬菌体用于控制食品中沙门氏菌的污染。在所述的噬菌体的应用中将噬菌体用水稀释后，作为喷洒液或淋洗液，用于对食 品的生产环境或生产器具或相应的生产设备进行喷洒消杀，用于控制沙门氏菌对所述的环 境或器具或设备的污染。在所述的噬菌体的应用中所述食品是指由粮食、肉类、蔬菜、蛋类中择一的加 工制品，或由它们组合的加工制品。在所述的噬菌体的应用中所述食品是指水果或乳类，或由它们择一加工或组 合加工后获得的制品，所述的制品为固体类或液体类。本发明的优点在于沙门氏菌噬菌体对沙门氏菌具有较强的裂解活性，且不会产 生耐药菌株的特点；是一种新型的控制食品中食源性病原菌污染的产品和手段；经小鼠试 验，沙门氏菌噬菌体毒副作用小，安全性高；由于沙门氏菌噬菌体具有较好的亲水相，容易 配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行消杀。
图1为PSA-6噬菌体电镜图；图2为PSA-6噬菌体双层平板；图3为PSA-6噬菌体酶切图；图4不同温度对PSA-6噬菌体的作用结果；图5不同pH条件对PSA-6噬菌体的作用结果；图6噬菌体PSA-6裂解沙门氏菌的阳性结果，其中A =ATCC 13076 ；B =ATCC 13311 ；C =CVCC 2184。
具体实施例方式实施例1、噬菌体PSA-6的分离制备本发明中的粪液污水样品采自江苏省农业科学院兽医所动物实验场；宿主菌为肠炎沙门氏菌ATCC 13076。将粪液污水样品经双层滤纸过滤，8000rpm离心20min，再分别用0. 45 μ m和 0. 22 μ m滤膜过滤上清。取50mL上清，加入500 μ 1噬菌体宿主菌(沙门氏菌)过夜培养物，再加入CaCl2 母液至终浓度ImM混勻后，加入20mL LB培养基，放置于37°C培养12 16h。次日，取上述 培养物以12000rpm离心lOmin，取上清并加入0. 3%氯仿，形成噬菌体原液。取三块1. 5%的普通营养琼脂平板，标记为1、2和3，分别吸取宿主菌液0. ImL滴 于正中央，用涂棒将菌液均勻地涂开，5min后，平板1滴加0. 05mL噬菌体原液，平板2滴加0.05mL0. 85%生理盐水，平板3不滴加任何溶液，待自然晾干后，置于37°C温箱培养IOh后， 观察三块平板的变化。对上述鉴定后含有噬菌体的水样进行以下操作取噬菌体原液0. lmL，进行10倍 稀释，取IO2UO4和IO6稀释液各0. ImL与过夜培养的宿主菌液0. ImL混勻，室温作用15min 后，加入约4mL 0.7% LB培养基，混勻后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇勻平置5min，待 其凝固，置于37°C培养1 后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。实施例2、噬菌体的扩增培养和纯化在形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种 于3 5mL LB培养基中，加入噬菌体宿主菌液0. lmL，混勻，室温作用15min，37°C培养10 14h, 12000rpm, 4°C，离心 IOmin,取上清，加入 0. 3 %氯仿。取ImL新鲜培养的宿主菌，加0. ImL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主 菌分别按照1 1、1 10和1 100的比例)。37°C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿 主菌；加入IOOmL LB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度ImM，37°C摇振培养12 16h， 12000rpm, 4°C，离心lOmin，取上清，得到噬菌体裂解液。在裂解液中加入RNase A、DNase I 至 1 μ g/mL，37°C温育 30min ；加 9. 3g PEG 8000,5. 8g NaCl，摇勻至溶解，冰浴Ih或4°C过夜；4°C离心IOOOOrpm lOmin，去上清液； 加2mL SM液，充分洗涤管壁及沉淀，室温作用Ih;通过加入等体积的氯仿抽提，温和振荡 30s ；4°C，5000rpm离心IOmin以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得 纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(图2)。纯化的噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2010226，保 藏日期为2010年9月12日，保藏单位地址中国武汉武汉大学，邮编430072。噬菌体具有以下微生物学特征1.形态学特性在透射电子显微镜下观察噬菌体颗粒(见图1)，该噬菌体具有呈正多面体的头部 结构和可伸缩性的尾部，头部直径约64nm，尾部长约114nm。2.培养学特性噬菌体菌株在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则， 直径为1 2mm(见图2)。3.噬菌体基因组核酸类型鉴定取纯化的噬菌体颗粒，用蛋白酶K消化噬菌体衣壳，释放出核酸，酚氯仿抽提，溶 解定量后分别采用Dnase I.Rnase A及限制性核酸内切酶Hind III酶切噬菌体基因组核酸， 根据酶切图谱(见图3)分析得出，该噬菌体核酸是双链DNA分子(dsDNA)。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会 第八次报告》中对噬菌体的新分类方法，根据该噬菌体的形态学特征判断，应属于肌尾病毒 科，我们把它命名为^ilmonella phage PSA-6。实施例3、温度及pH对PSA-6噬菌体稳定性的影响以实施例2的PSA-6噬菌体为基础，配制成6X K^pfu/mL纯化噬菌体，分别取1.OmL在30 V、40°C、50 V、60°C、70 V、80°C、90 V水浴作用Ih后，提取样品并将其冰浴冷却 后测其效价，结果如图4所示，PSA-6噬菌体在30 60°C分别作用Ih后，其活性无显著变化；70°C作用Ih后，活性有所降低；80°C作用后，噬菌体全部被灭活。以实施例2的PSA-6噬菌体为基础，配制成8 X l(fpfu/mL纯化噬菌体备用；配制 pH值分别为3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0的蛋白胨水备用，将备用的PSA-6 噬菌体分别与备用的不同PH值按照1 9的体积比混合，37°C水浴作用池后分别检测它们 的效价，结果如图5所示，PSA-6噬菌体在pH为3和11时，噬菌体全部被灭活；pH为4时， 其效价降低约两个数量级；PH为5. 0 10. 0时，其效价与初始效价无显著性差异。实施例4、噬菌体宿主谱分析以实施例2的PSA-6噬菌体为基础，配制成效价为l(fpfu/mL的纯化噬菌体备用。试验选择5种沙门氏菌标准菌株和20从食品中分离的沙门氏菌菌株，来做噬菌体 PSA-6的宿主谱分析，具体操作如下分别取所述的25株沙门氏菌的过夜培养物100μ 1，滴 加在1. 5% LB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均勻的菌苔。然后将每个平板平 均分成两个区域，其中一个区域，取10 μ 1噬菌体PSA-6滴加在菌苔表面，另一个区域滴加 10 μ 1生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37°C培养12 16h，观察结果。结果显示，PSA-6噬菌体对其中的3个沙门氏菌菌株ATCC 13076、ATCC 13311和 CVCC 2184都具有很好的裂解作用。如图6所示，其中A为肠炎沙门氏菌ATCC 13076 ；B为 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 ;C为禽沙门氏菌CVCC 2184。实施例5、噬菌体安全性实验
8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g士 2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随 机分为2组，每组10只；其中一组口服噬菌体PSA-6 109pfu/0. ImL/只(实施例2提供)； 对照组口服等体积PBS。连续口服14d后，每组脱劲致死5只小鼠，观察内脏、消化道及黏膜 变化情况；每组剩余的5只小鼠继续饲喂，每天取其粪便检测噬菌体数量变化。结果显示，此剂量噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查未见异常，且在口服 噬菌体结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。实施例6、噬菌体在固体食品中的杀菌效果实验此试验选取火腿肠作为试验样品，将火腿肠切为2X2X2cm小块，高压灭菌备用。 以肠炎沙门氏菌ATCC 13076配制效价为5 X 105Cfu/mL的宿主菌，备用。以实施例2的噬菌 体 PSA-6 为基础，制备 5XKfpfu/mUMOI 10)禾口 5X IO8 (Μ0Ι 1000)的 PSA-6 噬菌体样品， 备用。在无菌环境下，先将沙门氏菌菌液以20ul滴于火腿肠小块表面，约5min后，再分成实 验组和对照组，其中，将不同浓度的PSA-6噬菌体各20ul分别滴于已滴加过细菌的实验组 火腿块表面，对照组则滴加20ul的PBS ；将制备好的样品置于4°C，于lh、2hjh、24h和4 分别将实验组和对照组单独对照，检测沙门氏菌的数量。结果如表1所示，与细菌对照组相比较，4°C作用Mi后，MOI 10和MOI 1000的噬 菌体几乎均可以完全杀灭沙门氏菌，且能够对食品提供长久的保护。表1噬菌体在固体食品中的杀菌效果实验
权利要求
1.一株沙门氏菌噬菌体，其特征在于保藏号为CCTCC M 2010226，该噬菌体对沙门 氏菌 ATCC 13076, ATCC 13311 和 CVCC 2184 有裂解作用；该噬菌体具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约64nm，尾部长约 114nm;噬菌体株在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径 为1 2mm;取纯化的噬菌体颗粒，用蛋白酶K消化噬菌体衣壳，释放出核酸，酚氯仿抽提， 溶解定量后分别采用Dnase I、foiaseA及限制性核酸内切酶Hind III酶切噬菌体基因组核 酸，酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA分子(dsDNA)；该噬菌体应属于肌尾病毒科。
2.根据权利要求1所述的一株沙门氏菌噬菌体，其特征在于所述的噬菌体在30 600C中放置60min，其活性稳定，在70°C中放置60min效价降低两个数量级，在80°C中则失 活；PH为4时，其效价降低约两个数量级；pH为5. 0 10. 0时，其效价与初始效价无显著性 差异。
3.—种如权利要求1或2所述噬菌体的应用，其特征在于将沙门氏菌噬菌体纯化后， 用于杀灭沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于将获得的噬菌体用于控制食品 中沙门氏菌的污染。
5.根据权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于将噬菌体用水稀释后，作为喷洒 液或淋洗液，用于对食品的生产环境或生产器具或相应的生产设备进行喷洒消杀，用于控 制沙门氏菌对所述的环境或器具或设备的污染。
6.根据权利要求4或5所述噬菌体的应用，其特征在于所述食品是指由粮食、肉类、 蔬菜、蛋类中择一的加工制品，或由它们组合的加工制品。
7.根据权利要求4或5所述噬菌体的应用，其特征在于所述食品是指水果或乳类， 或由它们择一加工或组合加工后获得的制品，所述的制品为固体类或液体类。
全文摘要
本发明一株沙门氏菌噬菌体，其保藏号为CCTCC No:M 2010226，该噬菌体对沙门氏菌ATCC 13076、ATCC 13311和CVCC 2184有裂解作用；本发明将沙门氏菌的噬菌体用于控制沙门氏菌对食品的污染，以及用于控制沙门氏菌对食品生产环境和生产器具以及相应的设备表面的细菌性污染。
文档编号C12N7/00GK102041247SQ201010508259
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者包红朵, 张辉, 王冉 申请人:江苏省农业科学院