专利名称：改良染色体制备组织细胞培养方法
改良染色体制备组织细胞培养方法本发明涉及改良染色体制备组织细胞培养方法，主要用于医学领域的细胞遗传、 出生缺陷或产前诊断实验室作染色体制备及其核型分析的组织细胞培养。染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，染色体结构或数目的异常，会引起相应的病变或生物学功能的改变。为了研究组织细胞中染色体的结构与功能，需要做以下三步预实验操作其一是待检组织块的培养前处理，目的是使之成为单个细胞或近乎单个细胞的细胞团，以有利于细胞贴壁生长。经典的处理方法是无菌操作取组织块5 10mg，以无菌生理盐水洗涤3 次后，剪碎组织块(尽量达到近单个细胞状)，以0. 25%胰酶或胶原酶Iml消化，5 10分钟后，轻轻振摇，待大块组织自然下沉后，吸取上层单个细胞和较小的组织，置离心管中， 1000r/min离心lOmin，吸弃上层液，用无菌生理盐水洗3次，沉淀物转至2个培养瓶中，加 3 5ml细胞培养液。其二是细胞培养，经典的培养方法是将培养瓶置37°C、5% CO2的培养箱中、半开启瓶盖、培养M 4 后，显微镜下观察细胞生长情况，见有单个细胞生长时， 换液，此后每隔1 2天观察、换液一次，当细胞长至60% 80%融合并表现良好的活力时，可收获细胞作染色体制片。其三是染色体制备，使染色体成形，以供染色体核型分析等 Z用ο经典的组织块培养前处理方法存在以下的缺点①是需用小剪刀反复剪碎组织块 20 30分钟，费时费力。②是需要用胰酶或胶原酶消化5 10分钟，消化后需用无菌生理盐水悬浮细胞、离心沉淀、重复洗涤3次以去除残余的酶，此过程操作繁琐，酶试剂费用昂贵、易失效，会对细胞造成损伤，此外，长时间的消化会破坏细胞膜表面的整合素，从而影响细胞的粘附力，并造成细胞外基质合成时基因表达的改变，从而影响细胞合成胞外基质、维持表型及增殖的能力，很难实现细胞体外生长和扩增的目的。③操作过程步骤多，易污染而致细胞培养失败。经典组织细胞培养方法的缺点是因为组织细胞需要在37°C、5% CO2的环境中生长，在细胞培养的过程中，如果把培养瓶的盖子拧紧，则培养瓶外(培养箱中)的CO2就难以进入培养瓶内，从而影响细胞生长；反之，如果为了使培养瓶内与培养箱中的CO2含量处于平衡状态，则需要以半开启或全开启培养瓶盖的方式培养，特别是在培养时间长的情况下， 培养瓶外(培养箱中)的微生物很容易进入培养瓶内而造成污染，致使细胞培养失败。本发明人为了解决上述问题，提出了本发明。本发明的目的是要提供改良染色体制备组织细胞培养方法，它能够有效地消除经典组织块培养前处理方法的缺点及经典组织细胞培养方法的缺点。本发明的目的是这样实现的用无菌生理盐水洗涤待检组织块，然后置于特制的组织研磨器中，研磨10 30秒钟，加常规细胞培养液1 3mL，悬浮细胞，移入防污染的细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，37°C,5% CO2培养箱中培养。本发明简略了经典方法中需要反复剪碎组织块、胶原酶消化、重复洗涤和离心沉淀的过程，消除了由此产生的实验影响因素，同时使用了特制的培养瓶，既能有效地预防细胞培养过程的细菌污染，又能确保细胞培养过程中所需的(X)2含量和湿度。本发明可大大提高工作效率和细胞培养成功率、节省实验成本。
图1是根据本发明提出的防污染细胞培养瓶的剖面图。图2是根据本发明提出的组织研磨器的剖面图。下面结合图1和图2，对本发明所提供的改良染色体制备组织细胞培养方法作详细的描述。如图1所示，防污染培养瓶1由塑料制成，其中培养瓶壁底2内表面光滑平整，在组织细胞静置培养的过程中，起初悬浮于液体培养基的组织细胞沉淀并贴壁在培养瓶壁底 2内表面呈细胞集团生长，瓶颈外口呈螺纹状，与瓶盖3内螺纹相接，两者拧紧时呈密封状态，盖顶4为具有目前微生物实验室通用的普通滤菌器的结构与功能，由石棉板制成，或由硅藻土和石棉混合制成，含有微细小滤孔，孔径一般不超过0. 15 0. 22 μ m,但不小于44A， 这些小孔能机械性地过滤细菌、真菌等微生物，阻止这类微生物进入培养瓶内，而二氧化碳、水蒸汽等小分子气体则能自由通过，进入培养瓶内，所以在细胞培养过程中，使用具有滤菌器结构和功能的盖顶4的组织细胞培养瓶，当拧紧瓶盖后，既可使组织细胞在规定的二氧化碳浓度和水份湿度的条件下生长，又可起到防止细菌、真菌等微生物进入培养瓶内而污染作用。盖顶4的功能可设置在瓶壁、瓶底、瓶颈及瓶盖的其他部位。如图2所示，组织研磨器由研棒1和研杯2组成，研杯2的口径为0. 5 20cm，研杯高为1 20cm，研棒1的大小和长度与研杯2相配套，以方便使用为标准。研棒1和研杯 2以瓷、玻璃、玛瑙、氧化铝或铁为材料制成，也可以玻璃或塑料为材料制成的一次性用品。本发明具体的实施步骤是用无菌生理盐水洗净待检组织块，去除组织块表面的污物或污染的细胞、血迹等，如疑有微生物污染，可用含100U/mL双抗(青霉素、链霉素)的 PBS液浸泡或冲洗3次，对大的组织块可考虑浸泡于75%洒精中5 10分钟后再用无菌生理盐水冲净，取组织块中部处理、培养。将已作预处理的组织块置于本发明提供的组织研磨器中，研磨10 30秒钟，加常规细胞培养液1 3mL，悬浮细胞，移入本发明提供的防污染细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，37°C、5% CO2培养箱中培养。培养M 4 后，显微镜下观察细胞生长情况，见有单个细胞生长时，换液，此后每隔1 2天观察、换液一次，当细胞长至 60 % 80 %融合并表现良好的活力时，可收获细胞作常规染色体制片，使染色体成形，以供染色体核型分析等之用。
权利要求
1.一种用于医学领域的改良染色体制备组织细胞培养方法，其主要特征是设计组织研磨器及防污染培养瓶，用于改良经典染色体制备组织细胞培养方法，在待检组织块放入组织研磨器后，仅运作10 30秒钟，就可达到组织培养的细胞分散要求，即可用常规细胞培养液悬浮细胞，移入防污染细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，作常规细胞培养染色体制备，因此简略了经典方法中需要反复剪碎组织块、胶原酶消化、重复洗涤、离心沉淀及试剂配制等近2 小时的作业，而且消除了由经典方法产生的对细胞物理和化学的损伤、实验污染和感染等影响因素，防污染培养瓶既能有效地预防细胞培养过程的细菌污染，又能确保其所需的CO2 含量和湿度。
2.根据权利要求1所述的改良染色体制备组织细胞培养方法，其特征是防污染培养瓶1的盖顶4由石棉板、硅藻土制成具有滤菌器结构和功能，滤孔口径不超过0. 15 0. 22 μ m，不小于44A，滤孔可设置在瓶壁、瓶底、瓶颈及瓶盖的其他部位。
3.根据权利要求1所述的改良染色体制备组织细胞培养方法，其特征是组织研磨器由研棒1和研杯2组成，研杯2的口径为0. 5 20cm，研杯高为1 20cm，研棒1的大小和长度与研杯2相配套，制作材料为瓷、玻璃、玛瑙、氧化铝或铁，或以玻璃、塑料制作一次性用PΡΠ O
全文摘要
本发明提供了一种用于医疗领域的改良染色体制备组织细胞培养方法，其主要特征是设计并应用由研棒1和研杯2组成的组织研磨器，仅运作10～30秒钟就可取代经典方法中反复剪碎组织块、胶原酶消化、重复洗涤、离心沉淀及试剂配制等近2小时的作业，还消除了由经典方法产生的对细胞物理和化学的损伤、实验污染和感染等影响因素；同时设计了具有滤菌器结构和功能的防污染培养瓶，既能有效地预防细胞培养过程的细菌污染，又能确保其所需的CO2含量和湿度，从而大大提高工作效率和细胞培养成功率、便于成批操作、节省实验成本、优化了实验方法。
文档编号C12N5/00GK102443563SQ20101051183
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月10日 优先权日2010年10月10日
发明者翁炳焕, 黄荷凤 申请人:翁炳焕