专利名称：用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法。
背景技术：
随着人类体细胞研究的发展，多种人体细胞(尤其是间充质干细胞)在多种人类疾病治疗中的作用也逐渐为人们所关注，比如用于肝损伤、免疫损伤、神经损伤、血液疾病等的治疗，而这种新型治疗药物的临床前安全性评价尤为重要，急需研究药后人体细胞药物在动物体内的分布情况。目前研究人体细胞药物在动物体内的分布主要有两种方法一种方法是将人体细胞药物进行修饰(居胜红，滕皋军，毛曦等，脐血间充质干细胞磁探针标记和MR成像研究， 中华放射学杂志，2005，39 :101-106 ；Bos C, Delmas Y, Desmouliere A, et al. In vivo MR imaging of intravascularIy injected magnetically labeled mesenchymal stem cells in rat kidney and liver. Radiology，2004，233 :781-789)，或者转入能够表达特异蛋白 (如绿色荧光蛋白)的外源基因(施小凤，傅晋翔，梁建英等，骨髓间充质干细胞体内归巢特性的研究[J]，江苏医药杂志，2004，3(K4) :264-265),利用必要的设备，通过检测动物各组织荧光强度间接反映人体细胞在动物体内的分布情况。利用该方法，首先需要对体细胞进行修饰，操作复杂，过程繁琐；研究对象是修饰后的体细胞，而不是药物本身，因此不确定这种方法得到的结果能否真实反映药物本身的特点，试验结果不可靠。另一种方法是提取组织或体液样本总DNA，通过定量PCIUQ-PCR)或半定量PCR 法检测DNA样本中人体细胞染色体DNA上看家基因(如β-actin、globin、GAPDH等基因)含量，从而推算组织或体液样本中人体细胞药物含量(周进明，邹仲敏.培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布[J].中华放射医学与防护杂志，2002， 22(3) :167-169;邓为民，李长虹，廖联明，等.成体骨髓源多能间充质干细胞体内分化皮肤干细胞和皮肤组织[J].细胞生物学杂志，2003，25 O) =98-104 ；Deng W，Han Q，Liao L，et al. Engrafted bone marrow—derived fIk-(1+)mesenchymal stem cells regenerate skin tissue. Tissue Eng 2005 ；11 (1-2) :110-119)。该方法可以用于人体细胞药物在小鼠、大鼠等与人同源性低的动物体内分布的研究，但由于人与猴基因序列同源性高，看家基因序列基本一致，用该方法就无法区分人和猴的染色体DNA，也就无法检测猴子体内人体细胞的含量。因此该方法目前仅用于人体细胞药物在啮齿类动物体内分布情况的研究，应用范围较窄。因此，迫切需要一种能够有效研究人体细胞药物在各种动物体内分布特点的方法，来研究人体细胞药物作为治疗药物的安全性，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明提供一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法，包括如下步骤
(1)根据人特异基因选择PCR扩增区域、设计PCR扩增引物；(2)提取人基因组DNA，PCR扩增目的基因片段；(3)将扩增片段连入T载体构建标准质粒；(4)利用标准质粒建立标准曲线；(5)人体细胞药物给予动物后，采集各组织，提取总DNA样本进行定量PCR反应；(6)利用标准曲线，计算总DNA样本中人基因组DNA的含量，从而推算组织中人体细胞药物的含量。本发明还提供一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的试剂盒。
图1表示实施例1的标准曲线。图2表示实施例1的肺组织中人体细胞药物含量。图3表示实施例2的标准曲线。图4表示实施例2的肌肉组织中人体细胞药物含量。图5表示实施例3的标准曲线。图6表示实施例3的脾组织中人体细胞药物含量。图7表示实施例4的标准曲线。图8表示实施例4的肺组织中人体细胞药物含量。图9表示实施例5的标准曲线。图10表示实施例5的肌肉组织中人体细胞药物含量。
具体实施例方式定量PCR(Q-PCR)可以确定实验样品中DNA的数量(分子数)，所以，通过分析核酸样本中人基因组DNA上特异核酸序列，可以测定组织中人源细胞的含量。人体细胞药物内均含有基因组DNA。选择人基因组DNA上一段特异核酸序列为靶序列，构建含有该靶序列的标准质粒。利用标准质粒进行定量PCR反应，建立标准曲线。人体细胞药物给予动物后，在不同时间采集各组织和全血，提取总DNA进行定量PCR反应，利用标准曲线计算总DNA中人基因组DNA含量，从而计算组织、全血样本中人体细胞药物含量，考察人体细胞药物在动物体内的分布和代谢情况，为人体细胞药物的临床前评价提供参考。该方法简单、快速，结果可靠。本发明提供一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法，包括如下步骤(1)根据人特异基因序列选择PCR扩增区域、设计PCR扩增引物；(2)提取人基因组DNA，PCR扩增目的基因片段；(3)将扩增片段连入T载体构建标准质粒；(4)利用标准质粒建立标准曲线；(5)人体细胞药物给予动物后，采集各组织，提取总DNA样本进行定量PCR反应；(6)利用标准曲线，计算总DNA样本中人基因组DNA的含量，从而推算组织中人体细胞药物的含量。其中，在所述步骤(1)中，所述的人特异基因为10号染色体上生长板和软骨基质相关基因上游区域 (upper zone of growth plate and cartilage matrix associated on chromosome 10, UCMA) (Gene ID :224514932, http://www. ncbi. nlm. nih.gov/ nuccore/224514932 ？ report = gbwithparts&from = 13204103&to = 13216258#)或 7 号染色体上叉头框P2基因(forkhead box P2on chromosome 7，F0XP2) (Gene ID :299522979, http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NG_007491. 2)。优选为 UCMA。所述的 PCR 扩增区域可以是该基因序列中任意一段长度在60-5000个碱基的区域，优选为100-1000个，最优选为SEQ ID N0. 1、最优选为SEQ ID NO 3、最优选为SEQ ID NO 5、最优选为SEQ ID NO 7、最优选为SEQ ID NO 9。所述PCR扩增引物选自(1)从所述目的基因片段的15-50个碱基，或者( 与(1)存在1-5个碱基差异的序列，优选为17-30个碱基，更优选为20-27个碱基，要求能扩增出目的扩增区域且无非特异扩增条带。所述步骤( 中，优选为采集健康人全血，利用常规组织总DNA提取试剂盒提取全血中基因组DNA。按下列反应条件PCR扩增目的基因片段
权利要求
1.一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法，包括如下步骤(1)根据人特异基因序列选择PCR扩增区域、设计PCR扩增引物；(2)提取人基因组DNA，PCR扩增目的基因片段；(3)将扩增片段连入T载体构建标准质粒；(4)利用标准质粒建立标准曲线；(5)人体细胞药物给予动物后，采集各组织，提取总DNA样本进行定量PCR反应；(6)利用标准曲线，计算总DNA样本中人基因组DNA的含量，从而推算组织中人体细胞药物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中，所述的人特异基因为UCMA或F0XP2。
3.根据权利要求2所述的方法，所述的人特异基因为UCMA。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中，所述的PCR扩增区域是所述基因序列中任意一段长度为60-5000个碱基的基因片段。
5.根据权利要求4所述的方法，所述的PCR扩增区域是所述基因序列中任意一段长度为100-1000个碱基的基因片段。
6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤⑴中，所述PCR扩增引物选自(1)从所述目的基因片段的第一个碱基起的15-50个碱基；或者(2)与(1)存在1-5个碱基差异的序列。
7.根据权利要求6所述的方法，所述PCR扩增引物长度为17-30个碱基。
8.根据权利要求7所述的方法，所述PCR扩增引物长度20-27个碱基。
9.根据权利要求1所述的方法，所述步骤O)中，取健康人全血样品，利用常规组织总 DNA提取试剂盒提取全血中基因组DNA，按下列反应条件PCR扩增目的基因片段步骤反应温度反应时间循环数预变性 85-100°C 3-20分钟1变性 85-100°C 5-120 秒退火 45-60 0C 5-120 秒15-50延伸 55-75 °C 10-300 秒延伸 55-75°C 10秒-24小时 1。
10.根据权利要求9所述的方法，所述PCR扩增目的基因片段的条件为 步骤反应温度反应时间循环数预变性 90-95°C 3-15分钟 1 变性 90-95 °C 10-90 秒退火 47-58 0C 10-90 秒 15-40 延伸 56-74°C 10-150 秒延伸 56-74°C 10秒-10分钟 1。
11.根据权利要求10所述的方法，所述PCR扩增目的基因片段的条件为 步骤反应温度反应时间循环数预变性 95°C10分钟1变性 95 °C15秒退火 55°C15秒；35延伸 72 °C120秒延伸 72 °C7分钟1。
12.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)中，按照T载体说明书操作，将扩增片段连入T载体构建标准质粒，测序正确后，提取标准质粒，测定标准质粒浓度。
13.根据权利要求12所述的方法，所述T载体为pMD19-T载体。
14.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(4)中，根据标准质粒中插入的扩增片段的序列设计并合成定量PCR反应用的引物和探针，要求定量PCR反应的扩增区域为70-500个碱基，引物和探针长度均为15-50个碱基，定量PCR反应时能产生指数增长的扩增信号；将标准质粒2-20倍梯度稀释进行定量PCR反应，反应条件如下步骤反应温度反应时间循环数预变性 85-100°C 3-20min 1 变性85-100°C 5-120sec退火45-60 °C5-120sec 15-50延伸55-75°C10-300sec根据各反应体系产生的循环数绘制循环数-标准质粒含量的标准曲线； 所述PCR扩增引物选自(1)从所述目的基因片段的15-50个碱基；或者(2)与(1)存在1-5个碱基差异的序列。
15.根据权利要求14所述的方法，所述定量PCR反应的扩增区域为70-300个碱基。
16.根据权利要求14所述的方法，所述引物和探针长度均为17-30个碱基。
17.根据权利要求14所述的方法，将标准质粒5-15倍梯度稀释进行定量PCR反应。
18.根据权利要求14所述的方法，所述的定量PCR反应条件如下 步骤反应温度反应时间循环数预变性 90-95°C 3-15min1变性90-95 °C10-90sec20-50退火50-60 °C10-90sec延伸58-72°C10-150seco
19.根据权利要求18所述的方法，所述的定量PCR反应条件如下 步骤反应温度反应时间循环数预变性 95 °CIOmin1变性95 °C30sec退火55 °C30sec45延伸72°C90seco
20.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(5)中，人体细胞药物给予动物后，利用常规组织总DNA提取试剂盒提取各组织及全血中总DNA，提取总DNA样本进行定量PCR反应；所述各组织包括脑、生殖腺、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、血液、皮肤。
21.根据权利要求20所述的方法，所述的人体细胞药物是人间充质干细胞药物。
22.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(6)中，利用标准曲线，根据总DNA样本产生的Ct值计算总DNA样本中人基因组DNA的含量，推算组织中人体细胞药物的含量。
23. 一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的试剂盒，其特征在于包括权利要求 1-22任一项所述的标准质粒、定量PCR反应的引物和探针。
全文摘要
本发明提供一种用于测定人体细胞药物在动物体内分布的方法，其包括如下步骤(1)根据人特异基因选择PCR扩增区域、设计PCR扩增引物；(2)提取人基因组DNA，PCR扩增目的基因片段；(3)将扩增片段连入T载体构建标准质粒；(4)利用标准质粒建立标准曲线；(5)人体细胞药物给予动物后，采集组织，提取总DNA样本进行定量PCR反应；(6)利用标准曲线，计算各组织总DNA样本中人基因组DNA的含量，从而推算组织中人体细胞药物的含量。本发明的测定方法实验过程简单，实验结果准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102453758SQ201010526508
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者冯宇霞, 孙云霞, 左从林, 李洪贞, 龚兆龙 申请人:北京昭衍新药研究中心有限公司