一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

文档序号:586880阅读:423来源:国知局
专利名称:一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌新菌株及其应用,特别是涉及一株具有解磷作用的枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8及应用此菌产生中性植酸酶的方法。
背景技术
磷是动植物生长的必需元素,在生命活动过程中发挥着重要的作用。土壤中的磷 大部分以植酸态、核酸、磷脂态等有机磷形式存在,不能被植物直接吸收利用,并且作为磷 肥原料来源的磷矿石地下储存量非常有限,这将使磷成为制约现代农业可持续发展的一个 重要因素。另一方面,水产养殖业中,鱼类饲料中40 70%的磷也以植酸态形式存在,因 鱼类消化道内缺乏水解植酸磷的酶类,磷大部分随粪便排出,不但不能充分利用饲料中的 磷源,而且造成严重的水体磷污染。因此,急需解磷菌产生出酶类物质将有机磷转化成生 物体易于吸收的磷。植酸酶就可以催化植酸及植酸盐水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷 酸(或磷酸盐),提高磷和其它微量元素的生物利用率。但目前大多植酸酶都属酸性植酸 酶(pH2.5 5.5)。因此,研究开发新的菌株,使其能产生中性植酸酶,有效pH作用范围在 6. 5 7. 5之间,能够提高中性条件下的解磷效果,应用于磷细菌肥料和鱼类(消化道呈 中性)饲料的开发,提高土壤或饲料中磷的利用率,改善土壤及水体生态环境,具有重要意 义。

发明内容
本发明的目的之一是提供一株能产生中性植酸酶的具有解磷作用的枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)XF-8。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF_8分离自山东省济宁市田间土 壤,在筛选平板上产生水解圈,菌落边缘整起,湿润,革兰氏阳性,并结合16SrDNA和BIOLOG 微生物鉴定系统进行鉴定,确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8。该菌已于2010年7月16日保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏 中心,保藏编号为=CCTCC NO =M 2010182。本发明的第二个目的是提供利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8 CCTCC NO =M 2010182产生中性植酸酶的方法。为实现这目的,本发明采取以下技术方案菌种接至LB培养基,30°C振荡培养过 夜,以1 5%接种量接种于产酶培养基中,pH 5. 5 7. 5,25 37°C振荡培养2 4天。 4°C,5000rpm,离心15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活。利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)XF-8CCTCC NO :M 2010182发酵产生植酸 酶的培养基碳源为麦麸,氮源为酪蛋白胨和(NH4)2SO4,其中的酪蛋白胨有利于诱导植酸酶 的产生。由本发明所得到的中性植酸酶具有良好的热稳定性,其pH作用范围在6. 5 7. 5 之间,可以有效弥补酸性植酸酶的不足,能够应用于鱼类饲料开发,降低水体中磷的污染; 还能用于研制生物菌肥,有效利用土壤中有机磷,减少磷肥施用量,改善土壤微环境,提高 农产品的品质。
具体实施例方式

图1为植酸酶标准曲线。在下面的实施例中所用菌种均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) XF-8CCTCCN0 =M 2010182,实施例中不同培养基及溶液配方如下1.LB 培养基:1000ml 水,10. Og 蛋白胨,5. Og 酵母浸粉,5. OgNaCl,pH 7.0-7.2。2.蹄选培养基1000ml 水,20. OOg葡萄糖,2. OOg CaCl2, 5. OOg NH4NO3,0. 50g KCl, 0. 50g · MgSO4 · 7Η20,0· Olg FeSO4 · 7Η20,0· Olg MnSO4, 3. OOg 植酸钙,15. OOg 琼脂。3.产酶培养基称取IOOg麦麸加入900ml H2O中,121°C下60min,6层纱布过滤,滤 液定容至 1L,加入 0. 4g (NH4)2SO4jO. 2g MgSO4 · 7H20,0. 5g KH2PO4,0. 4g K2HPO4, 2. Og CaCl2, 10. Og酪蛋白胨。4.酶活测定溶液酶稀释液2mmol/LCaCl2, 50mmol/L Tris-HCl, ρΗ 7·0,10%甘油;底物溶液2mmol/L植酸钠(lOOmmol/LTris-HCl ρΗ 7. 0,2mmol/L CaCl2)终止液20%三氯乙酸(TCA);硫酸亚铁 硫酸铵显色液[(1. 5%钼酸铵5. 5%硫酸)(2. 7%硫酸亚铁)= 4 1,ν/ν]1. 5g钼酸铵溶于水,加入98%浓硫酸5. 6mL,定容至IOOmL ;0. 68g硫酸亚铁溶于 25mL水,两部分混勻,存放于4°C。5.磷标准液(用于计算直线回归方程)A、50mM磷酸盐母液1. 3609g ΚΗ2Ρ04(干燥)溶于200ml重蒸水中(定容)。B、磷标准液将母液按一定比例,分别稀释成0. 2mM,0. 4mM,0. 8mM, 1. 6mM, 3. 2mM
的工作液。实施例1、分离鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8,CCTCC NO :M2010182实验材料来自山东省济宁市田间土壤。具体实施步骤如下在无菌操作下,称取1. Og 土样溶于9ml无菌生理盐水中,充 分振荡后,置于85°C水浴锅中15min,并梯度稀释后,涂布于已制好的筛选平板上。倒放于 28 30°C恒温箱中培养2 3天,用接种针挑起有透明圈的菌落,进一步分离、纯化。再 将菌株接于产酶培养基中,进行复筛,以确定产植酸酶的菌株。经过革兰氏染色、16S rDNA 基因序列分析及BIOLOG鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) XF-8,经保藏编号为CCTCC NO :M 2010182。实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8,CCTCC NO :M 2010182 的产酶
培养实验1采用产酶培养基,具体步骤如下菌种接至LB培养基,30°C振荡培养过夜,以 1.0%接种量接种于产酶培养基中,25°C,pH 5. 5,160rpm振荡培养2天。4°C,5000rpm,离 心15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活。磷标准曲线的绘制采用溶液4、5制作磷标准曲线。具体步骤如下用不同浓度的磷标准溶液250 μ 1 加入Iml底物溶液,37°C水浴30min后,加入1. 25ml终止液;对照组为250 μ 1双蒸水中加 入1. 25ml终止液,37°C水浴30min后,加入Iml底物溶液,实验组和对照组均加入2. 5ml显色液,生成磷钼酸盐在700nm下测定OD值。得到的磷标准曲线如说明书附图1所示。枯草芽孢杆菌(Bacillussubti 1 is)XF-8,CCTCC NO :M2010182产生的中性植酸酶 酶活测定酶活定义为在pH 7.0时,每分钟释放1 μ M磷所需的酶的量。将样品用缓冲液做适当稀释后,取250 μ 1酶液加入Iml底物溶液,37°C水浴30min 后,加入1. 25ml终止液,终止酶反应;对照组250 μ 1酶液加入1. 25ml终止液终止酶反应, 37°C水浴30min后,加入Iml底物溶液,实验组和对照组均加入2. 5ml显色液,生成磷钼酸 盐在700nm下测定OD值。根据标准曲线所得方程及酶活定义代入酶活计算公式酶活性(U/ml)= (1. 8149x-0. 0166) X4Xn/tχ :0D700 的值;4 250 μ 1稀释酶液中的酶活换算成Iml酶液的酶活;η 酶液稀释倍数;t 反应时间计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subti lis) XF-8的中性植酸酶酶活为0. 32U/ml。实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subti lis) XF-8, CCTCC NO :M2010182 的产酶 培养实验1采用产酶培养基,具体步骤如下菌种接至LB培养基,30°C振荡培养过夜,以 2. 5%接种量接种于产酶培养基中,30°C,pH 6. 5,160rpm振荡培养3天,4°C,5000rpm,离心 15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活。磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例2。根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活为0. 51U/ml。实施例4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8, CCTCC NO :M2010182 的产酶
培养实验3采用产酶培养基,具体步骤如下菌种接至LB培养基,30°C振荡培养过夜,以 5.0%接种量接种于产酶培养基中,37°C,pH 7. 5,160rpm振荡培养4天。4°C,5000rpm,离 心15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活。磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例2。根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活为0. 40U/ml。
权利要求
1.一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subti 1 is) XF-8, CCTCC NO: M2010182。
2.利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubti lis) XF-8, CCTCC NO :M2010182产生中性植酸 酶的方法,其特征在于包括如下步骤菌种接至LB培养基,30°C振荡培养过夜,以1 5% 接种量接种于产酶培养基中,pH 5. 5 7. 5,25 37°C振荡培养2 4天;4°C,5000rpm,离 心15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活;其中产酶培养基 的碳源为麦麸,氮源为酪蛋白胨和(NH4)2S04。
全文摘要
本发明公开了一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用。涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8,CCTCC NOM2010182以及利用该菌产生中性植酸酶的方法。菌种接至LB培养基,30℃振荡培养过夜,以1~5%接种量接种于产酶培养基中,pH 5.5~7.5,25~37℃振荡培养2~4天;4℃,5000rpm,离心15min,取上清,得到中性植酸酶粗酶;稀释10倍后,测定发酵液的酶活;其中产酶培养基的碳源为麦麸,氮源为酪蛋白胨和(NH4)2SO4。该菌产生的中性植酸酶在pH 7.0时具有很高的酶活;能够应用于鱼类饲料开发,降低水体中磷的污染;还能用于研制生物菌肥,有效利用土壤中有机磷,减少磷肥施用量,改善土壤微环境,提高农产品的品质。
文档编号C12R1/125GK102061273SQ201010532768
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者孙秀梅, 宋存江, 张伟, 曹名锋, 李保宾, 李强, 王淑芳, 耿伟涛, 苏文萍 申请人:南开大学
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