专利名称：迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及减毒突变株技术领域，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗技术领域，具 体是指一种迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及其应用。
背景技术：
鉴于世界人口的不断增长及天然渔业资源的日益枯竭，水产业作为一种传统产 业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。据 统计，2002年我国水产品总量占全球总产量的71%和总产值的49.8%，居世界第一位。据 FAO统计，2004年我国的水产产品总量达4750万吨。然而，由于水土资源的有限性，从提高 养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度研制模式逐渐成为我国 鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对 养殖产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼 类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每 年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了 积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物 残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业 中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的 养殖水产品进入贸易市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害 的防治。作为世界上的水产养殖大国，我国的海水养殖品出口量只占到了养殖总量的6% 左右，一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标 严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年我国水产品出口因质量安全问题受到欧盟、日本等 国家和地区的限制。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收 获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争 力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个 主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展 趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验 (OrmondeP. Fisheries resources :trends in production, utilization and trade. In Nomura I (ed.).The State offforld Fishery and Agriculture2002. Rome:FA0 Information Division, 2002, p3 p45), fi ^ ^ it (System management approaches, SMA)养殖模式预防各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以 疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使 用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各 国研究和开发的主要前沿和应用领域。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病 原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效 手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺 陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能为水产养 殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病 害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来 了阻碍。水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产 品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活 疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广 谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫 苗研究和开发的热点和前沿领域。爱德华氏菌属是导致淡水、海水养殖鱼类细菌性疾病的一类常见的病原体，具体 分为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri) 和保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae) 0由其引起的鱼类出血性败血症统称为爱 德华氏菌病(Edwardsiellosis)。该病传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危 害的种类多，有鲤鱼，罗非鱼，鳗鲡，鲻鱼，鲑鱼，鳟鱼，鲆鲽等大多数具有较高经济价值的鱼 种。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德 华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前， 我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原 体向人体转移的巨大威胁。美国专利有利用利福平筛选得到野生毒株的自然减毒突变体作 为减毒活疫苗的报道(Evans J J，Klesius，P H and Shoemaker C A 2006 Modified live Edwardsiella tardavaccine for aquatic animals ；United States Patent 7067122)。 目前在我国尚无该病害的有效防治措施。使用转座子等基因重组构建技术开发的减毒活疫苗含有抗生素抗性标记和外源 基因片段，可能在使用时传播到其它病原体内，具有先天性的潜在环境危害风险。毒力易回 复和不可控的环境传播风险是该种疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗 被包括中国在内的各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风 险的生物制品而难以进入商业化开发进程。基因无标记缺失减毒疫苗构建技术是目前国际上新兴起的活疫苗开发领域，是疫 苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一，所开发的疫苗家具有可靠的产品和环境安全 性。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜 在价值，也成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。本发明涉及的迟钝爱德华氏菌野生毒株EIB202从我国东海海域养殖渔场 内爆发的爱德华氏菌病的病鱼体内分离得到，是一种强毒性的迟钝爱德华氏菌菌株 (Edwardsiella tarda EIB202,胃 tn /L "Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China”，《Aquaculture Research》Vol. 40，2009)。该野生毒株染色体含有芳香族氨基酸代谢途径中分支酸合成酶基因aroC， 该基因缺失突变株表现为芳香族氨基酸营养缺陷型表征。已证实，该毒株携带有编码毒力 效应元件的三型分泌系统(Type III secretion system，TTSS)。其毒力元件包括eseB， escA, eseC 及 eseD (王启要等，"Genome sequence of the versatile fish pathogen Edwardsiella tarda provides insights into its adaptation to broad host ranges and intracellular niches”，《PLoS One》Vol. 4，2009)。通过对该菌株全基因组测序发现 该菌具有一个43. 7kb的质粒，负责一套不完整的四型分泌系统的合成。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种迟钝爱德华氏菌野生毒 株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及其应用，该减毒突变株或相关制剂消除了传 统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的爱德华氏菌病的一 种安全、有效、经济的疫苗。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了 一种迟钝爱德华氏菌野生毒株 的无标记基因缺失减毒突变株，其特点是，它是迟钝爱德华氏菌毒株的减毒活疫苗，其中 缺失了所述迟钝爱德华氏菌毒株的分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应元件基因 eseB, escA, eseC和eseD，以及内源性质粒。因此，减毒突变株不携带任何抗生素抗性标记 和其它标记，无任何外源性基因片段，由于缺失分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应 元件基因eseB，escA, eseC和eseD，表现为芳香族氨基酸营养缺陷特征，不能分泌三型分 泌系统效应元件。较佳地，所述迟钝爱德华氏菌毒株是迟钝爱德华氏菌毒株EIB 202，其保藏号为 CCTCCN0 :M 208068，所述内源性质粒是质粒PEIB202。较佳地，所述迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株是减毒株 WED，其保藏号为=CCTCC NO :M 2010278。在本发明中，减毒疫苗株培养的培养基可选用LB培养基，其中的蛋白胨可以是酪 蛋白胨，胰蛋白胨或大豆蛋白胨，补加NaCl至0. 5%，同时补加下列氨基酸(20mg/L)苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸。本发明的具体实施例选用了胰蛋白 膝。在本发明的第二方面，还提供了一种迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失 减毒突变株的制剂，其特点是，包括上述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减 毒突变株和在药理上可接受的配体。较佳地，所述无标记基因缺失减毒突变株的菌体细胞浓度为IO2 109CFU/ml。较佳地，所述配体是无菌生理盐水。其配方可以是NaCl 9g/L，pH为7. 2。在本发明的第三方面，还提供了上述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺 失减毒突变株或上述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂在 防治养殖鱼类的迟钝爱德华氏菌病中的应用。较佳地，所述无标记基因缺失减毒突变株或所述制剂通过注射方式给药，其中菌 体细胞浓度为IO2 IO8CFU/尾。较佳地，所述无标记基因缺失减毒突变株或所述制剂通过浸泡方式给药，其中菌体细胞浓度为IO2 IO8CFU/尾，所述浸泡方式所需的时间为15 120分钟。本发明的有益效果在于1、本发明的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株缺失了迟钝 爱德华氏菌毒株的分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应元件基因eseB，escA, eseC 和eseD，以及内源性质粒，相对于其野生毒株EIB202具有明显的低毒性，可有效地保护试 验用鱼免受爱德华氏菌病致病株迟钝爱德华氏菌的侵害，后文实验表明，该活疫苗免疫效 果显著，具有非常好的水产养殖中爱德华氏菌病的防治效果；2、本发明的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株不携带任何 抗生素抗性标记和其它标记，对环境不存在传播抗生素抗性的潜在危险；不含任何外源基 因片段，采用基因缺失突变(特别是多基因缺失)手段，毒力相关基因大片段缺失，在理论 上认为毒力不可回复，极大地消除了向环境传播大量毒性病原体的可能性，具有技术上的 环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值；3、本发明的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的突变的遗 传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的 环境安全性和可控性；4、本发明的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株为无标记基 因缺失减毒活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。
图 1 是 Overlap PCR 方法扩增获得 WED (eseB，escA，eseC，eseD)基因缺失片段 Fl， F2。图2是利用自杀质粒pDMK构建筛选获得WED缺失菌株流程图。图3是利用自杀质粒pDMK筛选获得内源性质粒消除菌株流程图。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。实施例1 无标记基因缺失减毒突变株的构建( 一 ) eseB, escA, eseC, eseD 基因缺失菌株的构建1)PCR扩增获得所需基因片段如图1所示，以迟钝爱德华氏菌EIB202 (Edwardsiella tarda EIB 202)(保藏编 号CCTCCNO :M 208068，保藏地点为武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008 年5月1日)的基因组为模版，利用下列扩增引物Pl (GGAAGATCTCGCCTTTCACACGTTACAGCAAGAG)，P2 (GCTGGGCATCCGATTAGCCACCTGCTGGGA)，P3 (CAGGTGGCTAATCGGATGCCCAGCAAAAGA)，P4 (ACATGCATGCCCTGCGACTGACGCGACATGTCATT)，首先分别用Pl和P2、P3和P4扩增获得Overlap PCR所需的上下片段F1，F2。回 收各片段后，利用Overlap PCR技术采用Pl和P4获得eseB，escA，eseC，eseD基因缺失片 段 F1F2。
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2)回收各片段从所要研究的对象上回收目标基因片段，采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒。琼 脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管并 称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN，50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离 心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心(12，OOOrpm离心30sec)， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μ1漂洗液PW， 12，OOOrpm离心30sec，倒掉废液，再用500 μ 1漂洗液PW12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液。 将离心吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm离心2min，尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温 或50°C温箱数分钟，彻底地晾干后，将其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空 滴加不少于30 μ 1的洗脱缓冲液EB buffer,室温放置2min，12，OOOrpm离心Imin收集含目 的片段的DNA溶液，电泳检测回收DNA浓度。3)构建自杀工具质粒将pDMK载体多克隆位点的BglII位点和SphI位点切开后，将目的片段F1F2与切 割后的质粒用T4DNA连接酶16°C连接过夜。CaCl2转化法转化SM10，得到质粒载体pDMKWED。4)接合将携带有pDMKaroC质粒的SMlO按体积比4比1的比率与芳香族氨基酸合成酶基 因缺失菌株Aar0C混合离心，去除上清液，用10微升新鲜LB培养基重悬沉淀。将0. 22微 米灭菌后的水性滤膜平整铺放在新鲜半固体LB培养基上，取出全部菌悬液点置于水性膜 中央。37摄氏度培养24小时后，用0. 2M的MgCl2将水性膜上的菌落洗脱下，涂布于卡那霉 素，多粘菌素双重抗性平板。5)正向筛选eseB，escA，eseC，eseD基因插入失活克隆如图2所示，自杀质粒pDMKWED插入到基因组上eseB，escA, eseC, eseD基因中。 利用卡那霉素，多粘菌素双重抗性平板筛选，及以P1/P4为引物的PCR扩增可获得eseB， escA，eseC，eseD基因插入失活的克隆。6)筛选 eseB，escA, eseC, eseD 基因缺失菌株如图2所示，在20%蔗糖LB半固体培养基平板上，利用pDMK上SacB基因可反向 筛选获得发生第二次同源重组的菌株。以引物Pl，P4通过PCR验证可获得缺失突变菌株， 命名为TOF。(二)WEF基因缺失及质粒消除菌株的构建如图 3 所示，利用引物 P5 (GGAAGATCTTCTTTACCAAGCACAT)，P6 (CAGAAGGGATATGTT) 扩增获得相应的基因片段F1。并按照(一)中所描述，连接构建于pDMK上，获得质粒 pDMKplas。2)利用同源交换原理，将质粒pDMKplas通过SMlO接合的方法，插入到上述获得 的菌株TOD中的内源性质粒pET中对应的Fl片段上。利用SacB筛选标记，在20% (ν/ ν)的蔗糖LB平板上筛选获得SacB阴性的菌株，通过PCR验证，质粒抽提验证确定其为 质粒消除菌株Δ aroC/ Δ eseB/ Δ escA/ Δ eseC/ Δ eseD/ Aplas，命名为迟钝爱德华氏菌 WED (Edwardsiellatarda WED)，并保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉 大学)，保藏编号CCTCC NO =M 2010278，保藏日期为2010年10月24日。(三)减毒活疫苗制备
培养基与生理盐水组成1)LB 斜面培养基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L，NaCl 5g/L， 琼脂 18g/L，pH7. 5 ；2)种子培养基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L，NaCl 5g/L，苯 丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/ L, ρΗ7· 5 ；3)发酵培养基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L，NaCl 5g/L，苯 丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/ L, ρΗ6· 8 ；4)生理盐水=NaCl 9g/L，ρΗ7· 2，121°C灭菌 20 分钟。疫苗制备取一接种环保存于LB斜面培养基上的减毒疫苗株种子，接种于装有 IOOml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在30°C下振荡培养(转速200转/分钟)。12小 时后，取5ml生长旺盛的菌液(0. D = 4. 0左右)接种于IOOml新鲜发酵培养基，30°C培养 12小时。用无菌生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2000 X g，15分钟，15°C )，无菌生理盐 水稀释成一定浓度悬液(102-109CFU/ml)，保藏于15°C备用。实施例2 以大菱鲆(Scophthamus maximus (L.))为试验动物的半致死量LD50测 定试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔出不 正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中IOL 感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养10条(平均体长ll-12cm，体重30g)。试验水槽每 天使用无菌陈海水替换2/3体积养殖水，水温16°C，上下波动2°C。将试验用鱼随机分组，每组2个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼用一定 梯度剂量(102-109CFU/ml)的迟钝爱德华氏菌野生毒株和减毒疫苗株通过尾部肌肉注射进 行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定 LD50值(见表1)。表1迟钝爱德华氏菌毒株EIB202和减毒株对大菱鲆的LD5tl
感染菌株LD50备注EIB2024. 75X 102CFU/ml3天达到半数致死WED7. 0X108CFU/ml试验浓度(102-108CFU/ml)均未达到半数致死 注以上数据为2组独立平行试验平均值。上述结果表明，所有减毒株相对于迟钝爱德华氏菌野生毒株具有明显的减毒效 应，在所试验浓度范围内对大菱鲆基本无毒。实施例3 以大菱鲆为试验动物的注射给药免疫保护试验试验大菱鲆随机分为4组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采 用肌肉注射方式免疫。注射免疫剂量为IO2 IO8CFU/尾，肌肉注射试验大菱鲆。对照组注 射无菌生理盐水。免疫4周后将各组免疫大菱鲆用迟钝爱德华氏菌野生毒株活菌(肌肉注 射感染IO6CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫死亡数计算每 组的免疫保护率(见表2)。其中，按下列公式计算免疫保护率免疫保护率％=(对照组死亡率-免疫组死亡率％ )/对照组死亡率X 100%。表2迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗注射免疫大菱鲆4周后攻毒的免疫保护试验
权利要求
一种迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其特征在于，它是迟钝爱德华氏菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了所述迟钝爱德华氏菌毒株的分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应元件基因eseB，escA，eseC和eseD，以及内源性质粒。
2.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其 特征在于，所述迟钝爱德华氏菌毒株是迟钝爱德华氏菌毒株EIB 202，其保藏号为CCTCC NO =M 208068，所述内源性质粒是质粒pEIB202。
3.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其 特征在于，所述迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株是减毒株WED，其保 藏号为CCTCC NO :M 2010278。
4.一种迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，其特征在于， 包括根据权利要求1 3任一所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变 株和在药理上可接受的配体。
5.根据权利要求4所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的 制剂，其特征在于，所述无标记基因缺失减毒突变株的菌体细胞浓度为IO2 109CFU/ml。
6.根据权利要求4所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的 制剂，其特征在于，所述配体是无菌生理盐水。
7.根据权利要求1 3任一所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突 变株或根据权利要求4所述的迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的 制剂在防治养殖鱼类的迟钝爱德华氏菌病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述无标记基因缺失减毒突变株或所述 制剂通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度为IO2 IO8CFU/尾。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述无标记基因缺失减毒突变株或所述 制剂通过浸泡方式给药，其中菌体细胞浓度为IO2 IO8CFU/尾，所述浸泡方式所需的时间 为15 120分钟。
全文摘要
本发明涉及一种迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，它是迟钝爱德华氏菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了迟钝爱德华氏菌毒株的分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应元件基因eseB，escA，eseC和eseD，以及内源性质粒，较佳地，迟钝爱德华氏菌毒株是迟钝爱德华氏菌毒株EIB202，其保藏号为CCTCC NoM208068，内源性质粒是质粒pEIB202，迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株是减毒株WED，其保藏号为CCTCC NOM2010278，还提供了相关制剂及应用，本发明的减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的爱德华氏菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。
文档编号C12N1/20GK101974472SQ20101054164
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者刘琴, 张元兴, 王启要, 王鑫, 肖静凡, 陈涛 申请人:华东理工大学