专利名称：木糖葡萄球菌yg-27及其在制备鱼肉发酵香肠中的应用的制作方法
木糖葡萄球菌YG-27及其在制备鱼肉发酵香肠中的应用
(-)技术领域 本发明涉及一株分离自咸鱼的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus) YG-27及 其在制备鱼肉发酵香肠中的应用，属于生物发酵技术领域在水产品加工行业的应用。
背景技术：
发酵香肠是世界各国的传统肉类加工食品，在其加工过程中经过自然野生微生物 或接种有益微生物的发酵作用，将糖转化为各种有机酸和醇类物质，降低体系PH值有利于 延长产品的货架期；同时分解蛋白质和脂肪形成醛酮物质，使产品具有浓郁的发酵风味。目 前，发酵香肠的加工方式逐渐转为有益微生物定向接种发酵生产，其研究焦点主要在选育 和构建优良、安全的发酵微生物。葡萄球菌是发酵肉制品发酵剂中常用的细菌之一，在发酵肉质品的成熟过程中对 香气的形成、颜色的稳定、过氧化物的消除、蛋白质和脂肪的降解发挥着重要的作用，其关 系到最终产品的风味、香气和颜色的稳定性，此外葡萄球菌具有硝酸盐还原酶活性和触酶 活性，可抑制不良风味和提高产品的安全性。虽然有关发酵肉制品的葡萄球菌的研究较多， 现有葡萄球菌主要分离自传统畜禽肉制品，在鱼类加工产品中筛选获得优良性能的葡萄球 菌尚报道较少。
发明内容
本发明目的是提供一种分离自咸鱼的具有优良性能的木糖葡萄球菌 (Staphylococcus xylosus) YG-27及其在制备鱼肉发酵香肠中的应用。本发明采用的技术方案是木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus) YG-27，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所，100101，保藏编号=CGMCC No. 4225，保藏日期2010年10月12日。该菌株由咸鱼中分离获得，生长能力强，能耐受12-15%食盐溶液，具有蛋白酶活 性和脂肪酶活性。该菌株在MSA琼脂培养基(MSA液体培养基+18g/L琼脂制成的固体培养 基)上30°C培养48h，白色菌落，在普通显微镜下呈现球形，菌株表现为革兰氏阳性和过氧 化氢酶阳性。该菌株的16s rRNA序列如下TACGACTTCaCCCCAATCATTTGTCCCACCTTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTT CGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATC TACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATT TGCATGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGA TGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACCTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAAC TAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACC TGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAGGCTCTATCTCTAGAGTTTTCAAAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCG CGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCAT CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGAC CAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCT CTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAAC CGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGC。本发明还涉及所述木糖葡萄球菌YG-27在制备发酵鱼肉香肠中的应用。具体的，所述应用为将木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌加入鱼糜中，混合均勻，灌装于肠衣中，发酵制得所述鱼肉发酵香肠；所述木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌的菌体添加 量之比为1 0. 5 2，总添加量为IO6 109cfu/g鱼糜。所述乳酸菌为常规用于制备鱼肉发酵香肠的乳酸菌，优选为下列之一或其中 两种以上的混合植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、i青胃季Llf lif (Lactobacillus sake)。所述发酵可在常规适用于木糖葡萄球菌和乳酸菌的条件下进行，优选分二个阶段 进行第一阶段发酵在温度25 30°C、相对湿度90 95%下进行，发酵至pH5. O 5. 5 ； 第二阶段发酵在温度12 18°C、相对湿度75 85%下进行，发酵至pH4. 5 5. O。作为优选的技术方案，所述应用方法如下(1)鱼糜制备将原料鱼剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞碎，得鱼 糜；(2)斩拌在0 10°C下往鱼糜中加入质量为鱼糜质量2 8%的淀粉、1 5% 的蔗糖、1 5%的葡萄糖、2 3%的食盐斩拌10 20分钟；(3)菌株的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液体培养基中，在 温度20 40°C、转速100 200rpm下培养至对数生长晚期；将乳酸菌活化后接种于MRS 液体培养基中，在温度20 40°C、转速100 200rpm下培养至对数生长晚期；所述乳酸菌 为下列之一或其中两种以上的混合植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)0(4)接种在步骤⑵斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌，混合均 勻；所述木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌接种菌体量之比为1 0. 5 2，总接种量为IO6 109cfu/g鱼糜(指斩拌好的鱼糜)；(5)灌肠将步骤(4)混合均勻的鱼糜灌装于肠衣中；(6)发酵成熟第一阶段发酵在温度25 30°C、相对湿度90 95%下进行，发 酵至pH5. 0 5. 5 ；第二阶段发酵在温度12 18°C、相对湿度75 85%下进行，发酵至 PH4. 5 5. 0，即得鱼肉发酵香肠成品。本发明的有益效果主要体现在提供了一株分离自咸鱼的木糖葡萄球菌YG-27及 其在制备鱼肉发酵香肠中的应用，以该菌株和乳酸菌混合进行发酵生产的鱼肉发酵香肠 中，其产品风味明显优于同期生产的仅添加乳酸菌的产品。
图1木糖葡萄球菌的生长曲线；图2木糖葡萄球菌的耐盐性能。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 实施例1 菌株的筛选、鉴定和保藏(I)MSA液体培养基牛肉浸膏lg，蛋白胨10g，D-甘露醇10g，氯化钠75g，蒸馏水 1000ml, pH值7. 2 7. 6 ；调好pH值后加入酚红0. 025g。(2)菌株的分离在无菌条件下，咸鱼鱼肉加入已灭菌的生理盐水中进行勻浆，梯 度稀释后，采用倾注法倒平板，30°C培养48h。挑取单个菌落继续平板划线，直至纯化。革兰 氏阳性和触酶阳性的菌株为葡萄球菌疑似菌。(3)菌株的筛选对葡萄球菌疑似菌进行葡萄糖发酵产气、粘性物质形成、产过氧 化氢、产硫化氢、氨基酸脱羧酶、精氨酸产氨、耐盐性、蛋白酶活性、脂肪酶活性、凝固酶活 性、药敏性试验和生长性能等方面进行综合评价。(4)菌株的鉴定上述筛选得到一株性能优良的葡萄球菌疑似菌，经16s rRNA测 序分析，鉴定该菌株为木糖葡萄球菌，命名为木糖葡萄球菌YG-27。(5)菌株的保藏木糖葡萄球菌YG-27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，其保藏号为CGMCC No. 4225。(6)菌株生长性能测定制备木糖葡萄球菌种子发酵液，接种于MSA液体培养基 中，于30°C、150rpm下培养，每隔一定时间取样，于680nm下测定其培养液的光密度(即OD 值)，结果见图1。结果表明，木糖葡萄球菌YG-27可快速进入生长对数期，具有良好的生长 特性。(7)菌株耐盐性测定制备木糖葡萄球菌种子发酵液，分别接种于含有0%、3%、 6%、9%、12%和15% NaCl的MSA液体培养基中，于30°C、150rpm下培养24h，取样测定其 培养液的光密度(即OD值)，结果见图2。结果表明，木糖葡萄球菌对NaCl具有很强的耐 受性，在含12-15% NaCl的MSA液体培养基中仍有生长。实施例2 木糖葡萄球菌YG-27耦合植物乳杆菌制备鱼肉发酵香肠的方法加工工艺主要包括鱼糜制备一添加辅料，斩拌一接种一灌装一发酵成熟一包装具体操作如下(1)鱼糜制备将冰冻带鱼解冻后剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞 碎。(2)斩拌在低温(5 10°C)下加入质量为鱼糜质量3%的淀粉、1.5%的蔗糖、 2%的葡萄糖和2%的食盐，斩拌20分钟。(3)木糖葡萄球菌YG-27的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液 体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体 浓度。植物乳杆菌的液体培养将植物乳杆菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，CGMCC No. 4007)活化后接种于MRS液体培养基中，在温度20 40°C、转速 150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体浓度。
(4)接种在斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27和植物乳杆菌，接种比例为1 1(菌体量之比，下同)，总的接种量为IO7CfVg鱼糜(以斩拌后的鱼糜计，下同)，混合 均勻。(5)灌肠将混合均勻的鱼糜灌装于26_人造胶原蛋白肠衣中。(4)发酵成熟第一阶段发酵，温度30°C，相对湿度90%，发酵至pH5. 2 5. 5 ；第 二阶段发酵，温度15°C，相对湿度80 %，发酵至pH4. 6 4. 8 ；(5)包装真空包装。以本发明菌株耦合植物乳杆菌联合固态发酵生产的鱼肉发酵香肠中，其产品风味 明显优于同期生产的仅添加植物乳杆菌的产品。实施例3 木糖葡萄球菌YG-27耦合戊糖片球菌制备鱼肉发酵香肠的方法加工工艺主要包括鱼糜制备一添加辅料，斩拌一接种一灌装一发酵成熟一包装具体操作如下(1)鱼糜制备将冰冻草鱼解冻后剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞 碎。(2)斩拌在低温(5 10°C )下加入质量为鱼糜质量3%的淀粉、2%的蔗糖、 的葡萄糖和2. 5%的食盐，斩拌20分钟。(3)木糖葡萄球菌YG-27的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液 体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体 浓度。戊糖片球菌的液体培养将戊糖片球菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC22227)活化后接种于MRS液体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至 对数生长晚期，测定和调整其菌体浓度。(4)接种在斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27和戊糖片球菌，接种比例为 1 2，接种量为108cfu/g鱼糜，混合均勻。(5)灌肠将混合均勻的鱼糜灌装于26mm人造胶原蛋白肠衣中。(4)发酵成熟第一阶段发酵，温度28°C，相对湿度95%，发酵至pH5. 3 5. 5 ；第 二阶段发酵，温度16°C，相对湿度75%，发酵至pH4. 5 4. 7 ；(5)包装真空包装。以本发明菌株耦合戊糖片球菌联合固态发酵生产的鱼肉发酵香肠中，其产品风味 明显优于同期生产的仅添加戊糖片球菌的产品，且具有良好的发酵风味和凝胶结构，切片 性和咀嚼性好。实施例3 木糖葡萄球菌YG-27耦合清酒乳杆菌制备鱼肉发酵香肠的方法加工工艺主要包括鱼糜制备一添加辅料，斩拌一接种一灌装一发酵成熟一包装具体操作如下(1)鱼糜制备将冰冻草鱼解冻后剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞 碎。(2)斩拌在低温(5 10°C )下加入质量为鱼糜质量23%的淀粉、2. 5%的蔗糖、 1 %的葡萄糖和2%的食盐，斩拌20分钟。(3)木糖葡萄球菌YG-27的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体 浓度。清酒乳杆菌的液体培养将清酒乳杆菌(江南大学提供)活化后接种于MRS液体 培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体浓
度。 (4)接种在斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27和清酒乳杆菌，接种比例为 1 1，接种量为5X107cfu/g鱼糜，混合均勻。(5)灌肠将混合均勻的鱼糜灌装于26mm人造胶原蛋白肠衣中。(4)发酵成熟第一阶段发酵，温度26°C，相对湿度90%，发酵至pH5. 0 5. 2 ；第 二阶段发酵，温度14°C，相对湿度80%，发酵至pH4. 5 4. 6 ；(5)包装真空包装。以本发明菌株耦合清酒乳杆菌联合固态发酵生产的鱼肉发酵香肠中，其产品风味 明显优于同期生产的仅添加清酒乳杆菌的产品，且具有良好的发酵风味和凝胶结构，切片 性和咀嚼性好。实施例5 木糖葡萄球菌YG-27耦合植物乳杆菌、戊糖片球菌制备鱼肉发酵香肠的 方法加工工艺主要包括鱼糜制备一添加辅料，斩拌一接种一灌装一发酵成熟一包装具体操作如下(1)鱼糜制备将冰冻鳙鱼解冻后剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞 碎。(2)斩拌在低温(5 10°C )下加入质量为鱼糜质量的淀粉、3%的蔗糖、 的葡萄糖和3%的食盐，斩拌20分钟。(3)木糖葡萄球菌YG-27的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液 体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整其菌体 浓度。植物乳杆菌和戊糖片球菌的液体培养将植物乳杆菌和戊糖片球菌活化后接种于 MRS液体培养基中，在温度20 40°C、转速150rpm下下培养至对数生长晚期，测定和调整 其菌体浓度。(4)接种在斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27、植物乳杆菌和戊糖片球 菌，接种比例为1 1 1，接种量为109cfU/g鱼糜，混合均勻。(5)灌肠将混合均勻的鱼糜灌装于26_人造胶原蛋白肠衣中。(4)发酵成熟第一阶段发酵，温度26°C，相对湿度90%，发酵至pH5. 0 5. 2 ；第 二阶段发酵，温度18°C，相对湿度80%，发酵至pH4. 5 4. 6 ；(5)包装真空包装。以本发明菌株耦合植物乳杆菌、戊糖片球菌联合固态发酵生产的鱼肉发酵香肠 中，其产品风味明显优于同期生产的仅添加植物乳杆菌和戊糖片球菌的产品，且具有良好 的发酵风味和凝胶结构，切片性和咀嚼性好。
权利要求
木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)YG 27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号CGMCC No.4225，保藏日期2010年10月12日。
2.如权利要求1所述木糖葡萄球菌YG-27在制备发酵鱼肉香肠中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为将木糖葡萄球菌YG-27和乳酸 菌加入鱼糜中，混合均勻，灌装于肠衣中，发酵制得所述鱼肉发酵香肠；所述木糖葡萄球菌 YG-27和乳酸菌的菌体添加量之比为1 0. 5 2，总添加量为IO6 109cfu/g鱼糜。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述乳酸菌为下列之一或其中两种以上的混 iiS^^LIf lif (Lactobacillus ρIantarum)、戊H片 求胃(Pediococcus pentosaceus)、^青酒乳杆菌(Lactobacillus sake)。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵分二个阶段进行第一阶段发酵在 温度25 30°C、相对湿度90 95%下进行，发酵至pH5. O 5. 5 ；第二阶段发酵在温度 12 18°C、相对湿度75 85%下进行，发酵至pH4. 5 5. O。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法如下(1)鱼糜制备将原料鱼剖杀、去鳞去皮去头去尾去内脏，清洗，取肉绞碎，得鱼糜；(2)斩拌在O 10°C下往鱼糜中加入质量为鱼糜质量2 8%的淀粉、1 5%的蔗 糖、1 5%的葡萄糖、2 3%的食盐斩拌10 20分钟；(3)菌株的液体培养将木糖葡萄球菌YG-27活化后接种于MSA液体培养基中，在温 度20 40°C、转速100 200rpm下培养至对数生长晚期；将乳酸菌活化后接种于MRS液 体培养基中，在温度20 40°C、转速100 200rpm下培养至对数生长晚期；所述乳酸菌为 下列之一或其中两种以上的混合植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)(4)接种在步骤(2)斩拌好的鱼糜中加入木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌，混合均勻； 所述木糖葡萄球菌YG-27和乳酸菌接种菌体量之比为1 0.5 2，总接种量为IO6 109cfu/g 鱼糜；(5)灌肠将步骤(4)混合均勻的鱼糜灌装于肠衣中；(6)发酵成熟第一阶段发酵在温度25 30°C、相对湿度90 95%下进行，发酵至 PH5. 0 5. 5 ；第二阶段发酵在温度12 18°C、相对湿度75 85%下进行，发酵至pH4. 5 5.0，即得鱼肉发酵香肠成品。
全文摘要
本发明提供了一株分离自咸鱼的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)YG-27及其在制备鱼肉发酵香肠中的应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.XXXX，保藏日期2010年XX月XX日。本发明的有益效果主要体现在提供了一株分离自咸鱼的木糖葡萄球菌YG-27及其在制备鱼肉发酵香肠中的应用，以该菌株和乳酸菌混合进行发酵生产的鱼肉发酵香肠中，其产品风味明显优于同期生产的仅添加乳酸菌菌株的产品。
文档编号A23L1/317GK101979500SQ20101054174
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者聂小华 申请人:浙江工业大学