专利名称：一种哺乳动物rna标本反转录检测方法
技术领域：
本发明属RNA发转录领域，特别是涉及一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法。
背景技术：
现在，分子生物学领域中，RNA的检测技术，尤其是mRNA、miRNA及siRNA的检测， 在基因功能、基因表达方面占有举足轻重的作用。但是，现有的技术方法难以同时高效、低 成本地转录检测mRNA、miRNA，这也成为制约基因研究的因素之一。传统的技术是在使用Trizol等RNA抽提试剂从样本中提取总RNA，然后将其反转 录。然后将反转录的cDNA用特异性引物进行实时定量PCR，以检测目标基因的RNA表达状 况。一次抽提可检测多个指标。但这一技术有一个致命的缺陷是无法对miRNA等小分子量 RNA进行检测。原因有以下两条。首先，miRNA等小分子量RNA不含有Poly (A)等特殊结 构，而且随机引物结合率也较低，造成小分子量RNA难以被反转录。其次，即便是成功反转 录，小分量RNA的PCR产物也极易与引物二聚体混同难以分析鉴于以上原因，有两家美国公司曾提出过解决方案，但是都存在的缺陷。首先是美国应用生物技术有限公司。它提出采取特异性的探针引物来引领反转录 和检测，灵敏度高。但是其主要问题是一次实验只能检测一个指标，如需检测多个基因或指 标则需购买多个价格不菲但内容相似的试剂盒，不仅成本较高且对样品的消耗量较大。其次是美国QIAGEN生物技术有限公司。它采用的方法是在所有RNA分子的尾端 聚合一个特殊的尾端序列，并以此序列进行反转录和检测。但是由于该反应的酶效率较低， 所以必须用特殊的抽提试剂盒去除大部分大分子量RNA，以保证对小分子量RNA的检测。结 果就是该体系只能检测miRNA等小分子量RNA，如需检测mRNA等大分子量RNA则需用传统 方法重新抽提，不仅费时费力，而且误差也会增大。此外，现有方法的普遍问题是成本较高，上述两家公司的解决方案虽然有缺陷但 由于缺乏更实用技术，所以居于垄断地位。其单次检测的成本大约是传统方法的5 10倍。Abi 公司与 Qiagen 公司的专利号为:ABI :US :5，538，848，5，723，591，5，876，930， 6，030，787，6，258，569，and 5，804，375 ；Qiagen :U. S. · 5，035，996 ；5，945，313 ；6，287，823 ；or 6，518，026。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，该方 法简单，成本低，同时反转录大分子与小分子RNA，进行多个指标的检测。本发明的一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，包括(1)用传统方法提取样本RNA，然后用大肠杆菌Poly (A)聚合酶在RNA的尾端加上 Poly(A)结构；(2)上述酶反应结束后，用转换缓冲液将反应体系转换成反转录的缓冲液条件，然 后以Poly(A)为结合位点，结合上包含有特异性序列的反转录引物，并进行反转录，最后根据目的RNA的序列及结合上去的反转录引物的特异性序列设计特异性的引物(首先抄写 miRNA序列作为正义链，然后根据正义链的Tm值抄写一段接头序列作为反义链)，对样本中 的各类RNA进行检测。所述步骤(1)采用Trizol —步法或酚-氯仿法抽提RNA。所述步骤(I)IXPoly(A)聚合酶反应缓冲液[50mMTris_HCl (pH 7. 9@25 V )， 250mMNaCl, IOmMMgCl2]禾Π ImMATP，在 37 °C温育。所述步骤(2)中的转换缓冲液的制备方法，如下分别配置反应液A和反应液BC)反应液 A i. PAP buffer 1. 5ulii. ATP(IOmM) 1. 5uliii. Poly A 聚合酶1Uiv. RNA :3ugv.补足水至15uld)反应液Bi. Replenish buffer 3. 5ulii. dNTP(NEB，货号 N0446S) :2uliii. MMLV 反转录酶(NEB，货号 MO253L) :1Uiv.补足水至 35ul其中PAP buffer 0. 5M Tris-HCl (pH 7.9025 "C )，2· 5M NaCl，IOOmMMgCl2 ； Replenish buffer :0·5Μ Tris-HCl(pH 7. 9i25°C )，143mM DTT ；将反应液A放入37°C孵育30min，然后加入反应液B反应90min，最后85°C 5min 变性，得到转换缓冲液。所述步骤(2)中的结合条件为当前缓冲体系下37°C退火。所述步骤(2)中的特异性序列为GCTGTCAACGATACGCTACCTAACGGCATGACAGTG。所述步骤(2)中的包含有特异性序列的反转录引物由三部分组成，即任意核苷 酸、Oligo-dT和特异性序列。Oligo-dT用来识别并结合Poly(A)结构，单核苷酸用来将引物锚定在Poly (A)结 构的起始位置，特异性序列⑶用来合成下游引物，以弥补小分子RNA反转录后无法PCR的 缺陷，主要用作后续的PCR检测。所述步骤(2)中的包含有特异性序列的反转录引物为GCTGTCAACGATACGCTACCTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTN,其中 TTTTTTTTTTTTTTT表示Oligo-dT, N表示任意核苷酸。该特异性序列采用取自中华绒螯蟹的基因组DNA片段，与所有的脊椎动物的DNA 序列均无同源性，可有效避免非特异性扩增。特异性序列共计40bp，可满足各种Tm值、GC含量等引物设计要求，且不用担心发 夹结构、引物二聚体等结构。可以使用目标序列的一条特异地引物，与此特异序列合成的引 物相配合，即可特异地扩增目的序列，而不必去购买专用的探针。对于大分子的RNA，也可以使用任何现成或用其他方法设计的RNA检测引物，而不必重新设计合成。在检测时，可以根 据样品情况或检测指标任意选择GAPDH、U6、β -actin.c-Myc.rRNA等各类来源的各种设计 的引物。本发明先在抽提出的RNA样品中加入Poly(A)聚合酶，使其在ATP的作用下在 RNA分子的末端加上Poly(A)尾，然后使用转换缓冲液将反应环境转换为适合MLV的缓冲 液环境。在新的反应环境中，加入特殊引物、M-MLV反转录酶和dNTP，利用Poly(A)结构和 特殊引物上的Oligo-dT结构的亲和性，使特殊引物和反转录酶结合到RNA分子上，然后在 dNTP的作用下，M-MLV反转录酶将RNA分子转换为cDNA，最后，反转录而成的cDNA可以使 用SYBR-Green法检测各类RNA。检测引物可以使用一条特异引物与特殊序列合成的引物相 配合，也可使用任意其他方法设计的检测引物。各类内参引物均可作为参照。有益效果本发明的方法简单，成本低，单次实验就可以测试包括mRNA，miRNA，siRNA在内 的各类RNA指标，理论上标准反应体系单次反应可测试200个指标，而传统的方法只能测 20 50个，国外公司同类产品只能测1 5个；但即便这样，对于实验者来说，操作与常规 方法相同，不需额外培训，只需在传统技术的基础上进行少许改进；而且与国外同类产品动 辄上万的价格相比，本方案的试剂成本只比常规方法多出10%的成本；此外，本方法与所 有现有的RNA检测方法完美兼容，可以直接使用任意现有方法的检测引物及参照引物。
图1本发明的操作流程图；①为样品中的RNA分子，②为Poly(A)聚合酶，③为 ATP，④为特殊设计的引物，⑤为M-MLV反转录酶，⑥为dNTP，⑦为反转录而成的cDNA分子；图2 Δ Rn随循环变化图；图3RNA检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1(1)取新鲜的组织或细胞标本；(2)用Trizol —步法或酚-氯仿法抽提RNA，然后用大肠杆菌Poly㈧聚合 酶在RNA的尾端加上Poly(A)结构，IX Poly(A)聚合酶反应缓冲液[50mMTris-HCl (ρΗ 7. 9i25°C ), 250mM NaCl，IOmMMgCl2]禾Π ImM ΑΤΡ，在 37°C温育；(3)配制转换缓冲液分别配置反应液A和反应液Ba)反应液 A i. PAP buffer 1. 5ulii. ATP(IOmM) 1. 5ul
iii. Poly A 聚合酶1Uiv. RNA :3ugv.补足水至15ulb)反应液Bi. Replenish buffer 3. 5ulii. dNTP :2uliii. MMLV 反转录酶IUiv.补足水至 35ul其中PAP buffer 0. 5M Tris-HCl(pH 7.9025 "C )，2· 5M NaCl，IOOmMMgCl2 ； Replenish buffer :0·5Μ Tris-HCl(ρΗ 7. 9i25°C )，143mM DTT ；将反应液A放入37°C孵育30min，然后加入反应液B反应90min，最后85°C 5min 变性，得到转换缓冲液；(4)上述步骤(2)酶反应结束后，用转换缓冲液将反应体系转换成反转录的缓冲 液条件，然后以Poly(A)为结合位点，当前缓冲体系下37°C退火，结合上包含有特异性序列 的反转录引物GCTGTCAACGATACGCTACCTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTN,并进行反转录，最 后根据目的RNA的序列及结合上去的反转录引物的特异性序列设计特异性的引物，对样本 中的各类RNA进行检测。
权利要求
1.一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，包括(1)用传统方法提取样本RNA，然后用大肠杆菌Poly(A)聚合酶在RNA的尾端加上 Poly(A)结构；(2)上述酶反应结束后，用转换缓冲液将反应体系转换成反转录的缓冲液条件，然后以 Poly(A)为结合位点，结合上包含有特异性序列的反转录引物，并进行反转录，最后根据目 的RNA的序列及结合上去的反转录引物的特异性序列设计特异性的引物，对样本中的各类 RNA进行检测。
2.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(1)采用Trizol —步法或酚-氯仿法抽提RNA。
3.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(I)IX Poly(A)聚合酶反应缓冲液 50mMTriS-HCl pH 7. 9i25°C,250mM NaCl, IOmMMgCl2 和ImM ATP，在37 °C温育。
4.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(2)中的转换缓冲液的制备方法，如下分别配置反应液A和反应液Ba)反应液Ai.PAP buffer 1. 5ulii.ATP IOmM 1. 5uliii.Poly A 聚合酶:1Uiv.RNA :3ugv.补足水至15ulb)反应液Bi.Replenish buffer :3.5ulii.dNTP :2uliii.MMLV反转录酶1Uiv.补足水至35ul其中 PAP buffer 0. 5M pH 7. 9i25°C Tris-HCl，2· 5M NaCl，IOOmMMgCl2 ;R印lenish buffer :0.5M pH 7. 9i25°C Tris-HCl,143mM DTT ；将反应液A放入37°C孵育30min，然后加入反应液B反应90min，最后85°C 5min变性， 得到转换缓冲液。
5.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(2)中的结合条件为当前缓冲体系下37°C退火。
6.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(2)中的特异性序列为 GCTGTCAACGATACGCTACCTAACGGCATGACAGTG。
7.根据权利要求1所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所述步 骤(2)中的包含有特异性序列的反转录引物由三部分组成，即任意核苷酸、Oligo-dT和特 异性序列。
8.根据权利要求1或7所述一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，其特征在于所 述的包含有特异性序列的反转录引物为GCTGTCAACGATACGCTACCTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTN,其中 TTTTTTTTTTTTTTT 表示Oligo-dT，N表示任意核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种哺乳动物RNA标本反转录检测方法，包括(1)用传统方法提取样本RNA，然后用Poly(A)聚合酶在RNA的尾端加上Poly(A)结构；(2)酶反应结束后，用转换缓冲液将反应体系转换成反转录的缓冲液条件，然后以Poly(A)为结合位点，结合上包含有特异性序列的反转录引物，并进行反转录，对RNA进行检测。本发明的方法简单，成本低，同时反转录大分子与小分子RNA，进行多个指标的检测。
文档编号C12Q1/68GK102002525SQ201010541770
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者周光迪, 张丹丹, 张燕, 汪佳祺, 王伟, 王俊, 胡晶晶, 蔡在龙 申请人:中国人民解放军第二军医大学