专利名称：具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有给予对三氟羧草醚(ACIFLUORFEN)的抗性的活性的原卟啉原 氧化酶，尤其是蓝藻的原卟啉原氧化酶及其基因以及整合了该基因的转化体等。
背景技术：
原卟啉原氧化酶是催化血红素和叶绿素合成的最终阶段反应，即从原卟啉原IX 夺得6个电子合成原卟啉IX的反应的酶。血红素作为血红蛋白、细胞色素等血红素蛋白 质的辅助因子，是对于呼吸、能量代谢、氧紧张的防御不可缺少的分子。血红素合成途 径在微生物、植物、动物中共通存在，是以S-氨基乙酰丙酸作为前体合成血红素的途 径。而且，认为植物中的血红素和叶绿素，是以S-氨基乙酰丙酸作为前体直至原卟啉 IX的共通的途径来合成的，原卟啉原氧化酶担当着这两种合成途径的调节作用。陆生植 物中承担叶绿素代谢系统的这种原卟啉原氧化酶成为了二苯醚(以下有时简称为DPE)系 除草剂的目的酶。如果原卟啉原氧化酶的活性受到DPE系除草剂的抑制，作为该酶的底 物的原卟啉原IX就渐渐积累于叶绿体中，最终原卟啉原IX漏到细胞质浆液中，于是过氧 化酶对其进行氧化生成原卟啉IX。原卟啉IX如果与光和氧作用，原卟啉IX就可生成单 线态氧以及其它反应性氧种类。脂质的过氧化以及必然伴随其的膜损伤的结果是植物细 胞急速死亡(Leeet al，1993，Plant Physiol., 102，881)。另一方面，已经知道在蓝藻中 即使在DPE系除草剂存在下，也可以生长，但是其原因和机制还完全不知道。原卟啉原氧化酶基因已经在一些生物中获得了分离。例如，已知的有烟草 的 PPXl 基因(Genbank 登录号 Y13465)、PPX2 基因(Genbank 登录号 Yl3466)、拟南 芥的PPOX基因(Genbank登录号D83139)、枯草杆菌的HemY基因(Genbank登录号 M97208)、小鼠的PPX基因(Genbank登录号D45185)、人的PPX基因(Genbank登录号 D38537)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的 PPX 基因(Genbank 登录号 Z71381)、 大肠杆菌的hemG基因(Genbank登录号X68660)等。作为原卟啉原氧化酶的利用方法，例如，专利文献1公开了在植物体内使给予 对DPE系除草剂的抵抗性的来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的原卟啉原氧化酶表达的 方法，以及表达该原卟啉原氧化酶的转基因植物。此外，例如专利文献2，公开了原卟啉 原氧化酶基因，作为适于植物育种的卟啉生物合成系统的酶蛋白质的基因，其是从拟南 芥(Arabidopsisthaliana)植物中获得的具有1.7kbp长度的基因，其特征在于，其自5’端 起1.3kbp的部位存在限制性内切酶EcoRI识别碱基序列5’ -GAATTC-3’。而且，例如 专利文献3公开了一种用于评价大鼠或衣藻属(Chlamydomonas)来源的原卟啉原氧化酶活性抑制能力的简便方法，其特征在于，包括(1)在被验化合物存在或不存在下，在基 本不含补充基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力的缺失的化合物的培养基中培养表达存 在于DNA片段中的原卟啉原氧化酶基因的转化体，在各条件下测定该转化体的增殖度的 工序，所述转化体是通过将可以在宿主细胞中起作用的启动子以可以发挥功能的形式与 原卟啉原氧化酶基因结合而构成的DNA片段导入到基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力 发生缺失的宿主细胞中而成的；(2)基于该增殖度的差异求出由于被验化合物的接触而 造成的前述转化体的增殖抑制度，判断被验化合物对原卟啉原氧化酶活性的抑制能力的 过程。另一方面，在蓝藻中，根据其基因数据库的分析，曾推定大肠杆菌hemK类似基因为原卟啉原氧化酶，然而此后渐渐清楚蓝藻的该hemK类似基因不是原卟啉原氧化酶。 但是，在蓝藻中还没有发现蓝藻的基因数据库中与目前所鉴定的其它生物种类的原卟啉 原氧化酶同源的蛋白质，还没有分离出蓝藻的原卟啉原氧化酶(例如，参照非专利文献 1)。专利文献1 特愿平9-107833号公报专利文献2 特开平9-140381号公报专利文献3 特愿平11-346787号公报__专禾Il文献 1 Dmitrii V.Vavilin, Wim F.J.Vermaas "Regulation of the tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll in plants and cyanobacteria (植物禾口蓝藻
中导向为血红素和叶绿素的四吡咯生物合成途径的调节)” Physiologia Plantarum第115 卷，第9页，2002年
发明内容
如上所述，无法在蓝藻的基因数据库中发现与来源于其它生物种类的已知的原 卟啉原氧化酶同源的蛋白质，至今为止还没有分离出蓝藻的原卟啉原氧化酶。本发明的 课题在于提供具有给予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因，以及整合了 该基因的转化体等。本发明人，以分离蓝藻来源的原卟啉原氧化酶为目的，尝试了采用原卟啉原氧 化酶缺损的大肠杆菌的互补筛选。该方法是在原卟啉原氧化酶发生缺损的大肠杆菌中导 入蓝藻基因组片段来寻找互补的基因，鉴定与蓝藻的原卟啉原IX的氧化相关的基因的方 法。使用的载体不同，使用相同的方法分离拟南芥或烟草来源的原卟啉原氧化酶基因。 以下公开了前述互补筛选的概况。首先，从蓝藻(集胞藻属(Synechocystis) PCC6803)中获得了 DNA。在制备DNA 文库时，使用λZAPII载体(STRATEGENE公司制)作为噬菌体载体。由于该蓝藻的全 碱基序列已经被报道(约3,500kb)，因而研究了该蓝藻的基因组序列，结果认为对于包含 于载体的多克隆位点的6种限制性内切酶序列而言，Xbal、SpeK EcoRI这3种适于制备 文库。因此，以这三种限制性内切酶处理为基础制备出噬菌体文库。通过将制备的文库 导入到原卟啉原氧化酶缺损的大肠杆菌中，研究该转化体的原卟啉原氧化酶活性，进行 互补试验，却没有发现显示出明显的互补性。根据该结果，认为可能是该蓝藻的原卟啉 原氧化酶不幸恰好带有这3种限制性内切酶序列，或者该蓝藻的启动子没有很好地发生作用等几种可能性。因此，通过 使用限制性内切酶Tsp5091的限定分解重新制备文库，重新进行了 研究。Tsp5091是识别4碱基的限制性内切酶。前次文库制备中使用的3种限制性内切 酶(EcoRI、SpeK XbaI)为6碱基识别，必然会产生尺寸过大的片段。而且，蓝藻原卟 啉原氧化酶的基因序列内存在这些限制性内切酶识别序列时，无法克隆全长的原卟啉原 氧化酶基因。另一方面，如果使用4碱基识别的限制性内切酶完全切断DNA，就会获得 大量的数百bp的细小的片段。为了解决该问题，使用通过4碱基识别的限制性内切酶不 完全切断DNA的方法(限定分解)制备了文库。使用了该文库，却无法与大肠杆菌的原 卟啉原氧化酶缺失能力互补。然后，考虑如果是质粒的状态则可能出现生长恢复，对Tsp5091蓝藻基因组噬 菌体文库，切出了大量的质粒，制备出Tsp5091蓝藻基因组质粒文库，然后进行了研 究，没有发现生长显著恢复的克隆。由此，认为可能是蓝藻原卟啉原氧化酶没有与大肠 杆菌的原卟啉原氧化酶缺损互补，或者即使发生了互补也是非常轻微的。因此，本发明人为了解决上述问题，进行了积极的研究，结果发现，基于蓝藻 对三氟羧草醚具有抗性的认识，通过采用利用转座子的蓝藻变异体筛选，首次分离出源 于蓝藻(集胞藻属PCC6803)的卟啉原氧化酶，该卟啉原氧化酶具有给予三氟羧草醚抗性 的活性，并且通过鉴定该基因，而完成了本发明。而且，得到了如下认识上述利用转 座子的基因筛选法，作为在其它生物种类的基因数据库中无法发现蓝藻来源的卟啉原氧 化酶等与已知的蛋白质同源的其它生物种类来源的蛋白质时的基因分离方法是有效的， 从而完成了本发明。也就是说，本发明涉及(1)原卟啉原氧化酶，其特征在于，具有给予生物对 三氟羧草醚的抗性的活性并且来源于蓝藻；(2)根据上述(1)记载的原卟啉原氧化酶，其 特征在于，所述蓝藻为属于集胞藻属的蓝藻；(3)根据上述(1)或(2)记载的原卟啉原氧 化酶，其特征在于，所述生物为植物。而且本发明还涉及(4)下述(a) (c)中任一所示的蛋白质(a)由序列号2所 示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，其特征在于， 由序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构 成，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性；(C)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白 质，其特征在于，与序列号2所示的氨基酸序列的同源性为20%以上，并且具有给予生 物对三氟羧草醚的抗性的活性；(5)根据上述(4)记载的蛋白质，其特征在于，来源于蓝 藻。而且本发明还涉及(6)编码上述(1) (3)中任一项记载的原卟啉原氧化酶或 上述⑷或(5)记载的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，(7)下述(d)或(e)所示的 原卟啉原氧化酶基因DNA: (d)由序列号1所示的碱基序列构成的原卟啉原氧化酶基因 DNA ； (e)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧 化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由序列号1所示的碱基序列中缺失、 取代或添加了 1个或多个碱基的碱基序列构成；(8)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的 抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA， 其在严谨条件下与由与序列号1所示的碱基序列互补的序列构成的DNA杂交；(9)上述(7)或(8)任一项记载的原卟啉原氧化酶基因DNA，其特征在于，具有原卟啉原氧化酶活 性的蛋白质来源于蓝藻。而且本发明还涉及(10)整合了上述(6) (9)中任一项记载的原卟啉原氧化酶 基因DNA的重组载体。而且本发明还涉及(11)转化体，其特征在于，导入了上述(10)记载的重组载 体；(12)上述(11)记载的转化体，其特征在于，具有对三氟羧草醚的抗性；(13)上述 (11)或(12)记载的转化体，其特征在于，所述转化体为微生物；(14)上述(11)或(12) 记载的转化体，其特征在于，所述转化体为植物；(15)上述(14)记载的转化体，其特征 在于，光合作用能力提高了。而且本发明还涉及(16)使用上述(11) (15)中任一项记载的转化体的评价 原卟啉原氧化酶抑制活性能力的方法；(17)使用上述(11) (16)中任一项记载的转化 体的筛选原卟啉原氧化酶抑制剂的方法。而且本发明还涉及(18)包括以下(f) (j)工序的蓝藻的原卟啉原氧化酶基因的 分离方法(f)在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(g)使用转座子破坏 蓝藻的基因的工序；(h)选择原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株；ω确定被破坏的原卟 啉原氧化酶基因的工序；(j)分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序。而且本发明还涉及(19)上述(4)或(5)记载的蛋白质作为原卟啉原氧化酶的 使用方法；(20)人为地使上述(4)或(5)记载的蛋白质与原卟啉原IX接触转换成原卟啉 IX的方法；(21)上述(6) (9)中任一项记载的DNA作为原卟啉原氧化酶基因的使用 方法；(22)人为地使上述(6) (9)中任一项记载的DNA表达，使其表达产物与原卟啉 原IX接触转换成原卟啉IX的方法。而且本发明还涉及(23)包括以下的1) 5)工序的分离特定生物中编码具有 规定功能的蛋白质的基因的方法1)在特定生物中导入来源于特定生物以外的其它生物 的编码互补规定功能的蛋白质的基因来制备转化体的工序；2)通过变异处理等随机破坏 转化体的基因从而制备转化体的变异株的工序；3)通过使用作用于互补规定功能的蛋白 质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂，或者改变培养条件，从而选择编码具有规 定功能的蛋白质的基因被破坏的变异株的工序；4)确定被破坏的编码具有规定功能的蛋 白质的基因的工序；5)分离被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序。而且本发明还涉及(24)上述(23)记载的基因的分离方法，其特征在于，变异 处理为使用转座子的变异处理；(25)上述(23)或(24)记载的基因的分离方法，其特征 在于，所述来源于特定生物以外的其它生物的互补规定功能的蛋白质为拟南芥的原卟啉 原氧化酶；(26)上述(25)记载的基因的分离方法，其特征在于，所述作用于互补规定功 能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂为三氟羧草醚；(27)上述(25)或
(26)记载的基因的分离方法，其特征在于，特定生物中的具有规定功能的蛋白质为蓝藻 的原卟啉原氧化酶。
图1 序列号2所示的氨基酸序列和蓝藻来源的功能未知的基因编码的氨基酸序 列的比对。
图2 序列号2所示的氨基酸序列和其它生物来源的功能未知的基因编码的氨基 酸序列的比对。图3:表示破坏集胞藻属(Synechocystis)的sir 1790基因用的构建体 (pslrl790SKM 6.4kb)。图4 表示原卟啉IX的试样(A)、slrl790基因缺损株的提取液(C)和野生株的 提取液(B)中涉及的原卟啉IX的色谱图。图5 表示pBI121的概略。图6 表示 pBIslrl790 的概略。
具体实施例方式本发明的原卟啉原氧化酶具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性。其中，所 谓“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶”是指在适当的生物中 导入该原卟啉原氧化酶，使该酶在该生物中适当表达时，该生物的对三氟羧草醚的抗性 提高了的原卟啉原氧化酶。该生物对三氟羧草醚的抗性是否获得提高，可以通过例如确 认与导入该酶前相比，导入该酶后，三氟羧草醚的对该生物的48小时后的LC50值是否 提高来研究。而且，尤其是生物为植物时，例如将特定量的三氟羧草醚施用于植物的栽 培土壤中时，通过确认与使前述酶在植物中适当表达前的植物相比，使前述酶在植物中 适当表达的植物的黄化、褐变或枯化的程度降低，或者确认与使前述酶在植物中适当表 达前的植物相比，在使前述酶在植物中适当表达的植物中发生同程度的黄化、褐变或枯 化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量增加等，可以研究该植物对三氟羧草醚的抗 性是否提高。对三氟羧草醚的抗性的提高程度没有特别的限制，三氟羧草醚对生物的48 小时后的LC50值，或者发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积 的施用量，与在该生物中导入该酶前相比，优选提高到1.1倍以上，更优选提高到1.5倍 以上，更为优选提高到2倍以上，最优选提高到3倍以上。而且，本发明的“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化 酶”中，也包括该原卟啉原氧化酶自身具有对三氟羧草醚的抗性的情况，其中，所谓
“原卟啉原氧化酶自身具有对三氟羧草醚的抗性”是指，在含有ι μ M的三氟羧草醚的适 当溶剂中的原卟啉原氧化酶的比活性为三氟羧草醚不存在时的原卟啉原氧化酶的比活性 的五十分之一以上，优选二十分之一以上，更优选十分之一以上。其中“原卟啉原氧化 酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质的原卟啉原氧化酶 比活性，可以通过在适当的缓冲液或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原IX接触，研究原卟 啉IX的生成量等而容易地进行确认。而且，“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活 性”中的“生物”没有特别的限制，可以是植物也可以是微生物，但优选植物，其中优 选拟南芥、烟草、玉米、稻、麦类(小麦、大麦等)、薯类(马铃薯等)。本发明的原卟啉原氧化酶，只要具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，可 以不来源于蓝藻，也可以来源于蓝藻。蓝藻没有特别的限制，可以例举，例如属于集 胞藻属、鱼腥藻(Anabaena)属、粘杆菌(Gloeobacter)属、原绿球藻(Prochlorococcus) 属、聚球藻(Synechococcus)属、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属的蓝藻、更具体可 以列举集胞藻属PCC6803、鱼腥藻属PCC7120、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)PCC7421、海洋原绿球藻(Prochlorococcusmarinus) SS120、海洋原绿球藻 MIT9313、海洋 原绿球藻MED4、聚球藻WH8102、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)等。
这其中，优选属于集胞藻属的蓝藻，更优选集胞藻属PCC6803。
本发明中，所谓“来源于蓝藻的原卟啉原氧化酶”是指除了包括实际存在于蓝 藻中的原卟啉原氧化酶，只要是与该原卟啉原氧化酶一致，使用转化等方法由蓝藻以外 的微生物表达的原卟啉原氧化酶也包括在其中。本发明的蛋白质为以下任一项所示的蛋白质(1)由序列号2所示的氨基酸序列 构成的蛋白质；(2)含有在序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1 34 和48 176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1 34和48 193中记载 的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序 列，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白 质；(3)与序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1 34和48 176中记 载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1 34和48 193中记载的氨基酸序列中的 任一氨基酸序列的同源性为20%以上并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且 具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。以下，也将这些本发明的蛋白质总称为“本案蛋白 质”。本发明的上述蛋白质(2)如果是含有序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨 基酸编号1 34和48 176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1 34和 48 193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨 基酸的氨基酸序列，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧 化酶活性的蛋白质，则没有特别的限制。但可以优选列举在序列号2所示的氨基酸序列 中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有给予生物对三 氟羧草醚的抗性的活性，并且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质；由含有在序列号2的 氨基酸编号1 34和48 176中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨 基酸的氨基酸序列，并且在对应于该氨基酸编号1 34的氨基酸序列的氨基酸序列和对 应于该氨基酸编号48 176的氨基酸序列的氨基酸序列之间具有10 16个、优选12 14个、更优选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列构成的，而且具有给予生物对三氟羧 草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质；由含有在序列号2的氨基酸 编号1 34和48 193中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的 氨基酸序列，并且在对应于该氨基酸编号1 34的氨基酸序列的氨基酸序列和对应于该 氨基酸编号48 193的氨基酸序列的氨基酸序列之间具有10 16个、优选12 14个、 更优选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列构成的，而且具有给予生物对三氟羧草醚的 抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。其中，所谓对应于氨基酸编号m η的氨基酸序列的氨基酸序列是指在氨基酸编号m η的氨基酸序列中缺失、取代或添加 了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。上述所谓“缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、 取代或添加了例如1 20个、优选1 15个、更优选1 10个、更优选1 5个、最 优选1 3个任意个数的氨基酸的氨基酸序列。本发明中，所谓“具有原卟啉原氧化酶活性”是指具有氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质是否具有原卟啉原氧化酶活性，可以通过在适当的缓冲液 或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原IX接触，研究原卟啉IX的生成而容易地进行确认。而且，所谓“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”是指在适当的生物中导入该蛋白质，使该蛋白质在该生物中适当表达时，该生物对三氟羧草醚的抗 性提高的蛋白质。该生物对三氟羧草醚的抗性是否提高可以通过例如确认与导入该蛋白 质前相比，导入该蛋白质后，三氟羧草醚的对该生物的48小时后的LC50值是否提高来 研究。并且，尤其是生物为植物时，例如在植物的栽培土壤中施用特定量的三氟羧草醚 时，通过确认与在植物中使前述蛋白质适当表达前的植物相比，使前述蛋白质在植物中 适当表达的植物黄化、褐变或枯化的程度降低，或者确认与在植物中使前述蛋白质适当 表达前的植物相比，在使前述蛋白质在植物中适当表达的植物中发生同程度的黄化、褐 变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量增加等，可以研究该植物对三氟羧草 醚的抗性是否提高。对三氟羧草醚的抗性的提高程度没有特别的限制，三氟羧草醚对该 生物的48小时后的LC50值，或者发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚 的单位面积的施用量，优选与在该生物中导入该蛋白质前相比，提高到1.1倍以上，更优 选提高到1.5倍以上，更为优选提高到2倍以上，最优选提高到3倍以上。而且，本发明的“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”中，也 包括该蛋白质自身具有对三氟羧草醚的抗性的情况。其中，所谓“该蛋白质自身具有对 三氟羧草醚的抗性”是指，在含有 μΜ的三氟羧草醚的适当溶剂中的该蛋白质的比活 性(与原卟啉原氧化酶活性相关)为三氟羧草醚不存在时的比活性(与原卟啉原氧化酶活 性相关)的五十分之一以上，优选二十分之一以上，更优选十分之一以上。其中“原卟 啉原氧化酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质的比活性 (与原卟啉原氧化酶活性相关)，可以在适当的缓冲液或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原 IX接触，研究原卟啉IX的生成量等来容易地进行确认。而且，“具有给予生物对三氟 羧草醚的抗性的活性”中的“生物”没有特别的限制，优选是植物和微生物，特别优选 植物。本发明的上述蛋白质(3)如果是与序列号2所示的氨基酸序列(slrl790)、序列号 2的氨基酸编号1 34和48 176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1 34和48 193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性为20%，并且具有给予 生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，则没有特别的 限制，但优选与序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1 34和48 176 记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1 34和48 193中记载的氨基酸序列中 的任一氨基酸序列的同源性为45%以上，更优选54%以上，更为优选65%以上，更优选 80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上。其中，本发明中所谓“与氨基酸编号 ο ρ和q r中记载的氨基酸序列的同源性在以上”是指与按顺序依次具有氨基酸 编号ο ρ的氨基酸序列和氨基酸编号q r的氨基酸序列，并且氨基酸编号ο ρ的氨 基酸序列和氨基酸编号q r的氨基酸序列之间具有10 16个、优选12 14个、更优 选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列的同源性为以上。上述蛋白质(3)中“具有 给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”和它们的优选方式与上述蛋白质(2)中的 那些蛋白质含义相同。
用BLAST检索与本发明的序列号2所示的氨基酸序列同源性高的蛋白质，结果 发现了几个编码与序列号2所示的氨基酸同源性高的氨基酸序列的功能未知的基因。其 中，蓝藻来源的功能未知的基因示于表1。而且，该基因编码的氨基酸序列与本发明的序 列号2所示的氨基酸序列的同源性(％)也示于表1。它们也包含于本案蛋白质中。本 发明人清楚了本发明的序列号2所示的氨基酸序列，如后述的实施例中所记载的，为由 来源于集胞藻属PCC6803的slrl790基因编码的氨基酸序列。[表1]
「0046]
权利要求
1.包括以下(a) (e)工序的蓝藻的原卟啉原氧化酶基因的分离方法(a)在蓝藻中 导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(b)使用转座子破坏蓝藻的基因的工序；(c)选择原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株的工序；(d)确定被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序；(e)分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序。
全文摘要
提供了具有给予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶，及其基因等。通过在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因，用转座子破坏蓝藻的基因，选择出原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株，确定被破坏的原卟啉原氧化酶基因，分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因，从而鉴定蓝藻的原卟啉原氧化酶基因。该方法，作为在其它生物种类的基因数据库中无法发现蓝藻来源的原卟啉原氧化酶等与已知蛋白质同源的来源于其它生物种类的蛋白质时的基因的分离方法是有效的。
文档编号C12N15/53GK102021189SQ20101054187
公开日2011年4月20日 申请日期2006年9月25日 优先权日2005年9月26日
发明者加登一成, 深川尊子, 田中亮一, 田中步 申请人:国立大学法人北海道大学, 日本曹达株式会社