一种c_ot-1DNA、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种c_ot-1DNA、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种C。t-1DNA、其制备方法及用途。本发明还涉及一种核酸杂交的方法、含有本发明的c。t-lDNA的组合物、一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒、以及本发明的c。t-lDNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
背景技术：
在分子生物学中，将C。t = 1的一类DNA定义为C。t-1DNA。其中，C。t是DNA复性动力学中的一个单位，表示的是单位浓度(C。，mol/L)下DNA单链的复性时间(t，sec)，Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度(C。)和反应时间(t)的乘积。在相同的条件下，DNA重复序列的C。t值小，而非重复序列具有较大的C。t值。C。t-1DNA通常作为DNA竞争性阻断剂，在基因组杂交中阻断可能引起非特异性杂交的重复序列。例如，当用含有重复序列的探针来进行Northern杂交、Southern杂交、FISH 定位和体细胞原位杂交等实验时，存在于探针中的重复序列将会产生广泛的非特异性强杂交背景信号，从而将那些要检测的低拷贝或单拷贝序列的杂交信号掩盖掉。所以，在进行以上实验操作时，应首先考虑去掉探针中的这些重复序列避免非特异性杂交信号。从而达到捕获单拷贝或低拷贝序列外显子，增强外显子的检测信号的目的。最理想的方法是采用过量的基因组重复序列DNA，如c。t-lDNA来预先对这类探针进行封闭杂交，去掉存在于探针中的那些重复序列DNA(革文新等，人c。t-lDNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3 期，(127))。序列捕获(exon capture)将全基因组中感兴趣的目标序列和区域分离出来进行后续研究的技术。序列捕获技术的兴起能更好的将测序这种方法应用到分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领域。但是，如果要快速、大规模地实施序列捕获技术，获取大量的基因组重复序列就显得十分必要了。目前查到的c。t_lDNA的制备方法主要是采用羟基磷石灰柱层析法(HAP柱分离法)分离制备c。t-lDNA。该方法是将获得的基因组DNA用超声波打断到需要大小，根据HAP 的吸附能力和分离柱所装的HAP的量计算出所需要用的打断的DNA的量，100°C变性lOmin， 冰浴骤冷，按照公式c。t = 1 = mol/LXTs计算DNA复性时间t，于60°C c。t_lDNA复性t 秒，复性结束后，立即置于冰浴中lOmin，加入等体积的水溶液，将样品加入到HAP分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱c。t-lDNA 洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的c。t-lDNA，8000r/min室温离心20min， 用适当的水溶解所得到的盐和c。t-lDNA所得到的共沉淀混合物，然后用kphadex G_50脱盐，收集DNA峰，加入1/10体积3M的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4°C离心20min， 收集沉淀得到c。t-lDNA(革文新等，人c。t-lDNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第 3 期(127))。但是，上述的C。t-1DNA的制备方法——HAP柱分离法，虽然制的产品效果可以满足杂交的需要，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。
目前，hvitrogen公司的商品c。t_lDNA是常见的商品化的c。t_lDNA，但是价格较
为昂贵。

发明内容
本发明的一个方面涉及一种制备c。t_lDNA的方法，包括下述步骤1)将基因组DNA打断成IOObp-IOOObp的DNA片段；2)将打断的DNA片段进行纯化；3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；4)去除经过步骤3)所得DNA产物中的单链DNA ；5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到c。t_lDNA。关于步骤1)，所述基因组并不特别限定，本领域技术人员可以理解，所述基因组最好与待杂交或待封闭的样本来源于同一物种。并且用于提取基因组的组织部位或者细胞类型并不特别限定，由于不同部位组织的基因组的丰度不同，通过调整组织或者细胞的用量， 可以得到适当量的基因组DNA。可以使用人的基因组。提取基因组的样本可以是人的组织或者细胞。所述基因组可以是现成的，也可以是从组织或者细胞进行提取得到。因此，可选地，在步骤1)之前还可以包括提取基因组DNA的步骤。基因组DNA的提取可以使用本领域的现有技术，包括使用商品化的基因组提取试剂盒。也可以，例如采用下面的步骤提取基因组DNA的时候加入核裂解液，蛋白酶K，SDS使组织能够充分裂解， 370C _56°C消化12-16小时，优选56°C。由于给予充分的消化时间，此时的DNA已经得到很好的消化，因此只需3000-10000rpm离心5-15min即可将DNA与蛋白等杂质成功分离，因为延长了消化的时间使DNA裂解更充分，因此不必要特意配置高速离心机，例如经过4700rpm 离心IOmin即可使DNA和蛋白等杂质分离，因此可免去对DNA进行纯化的步骤，不仅节约了一部分对DNA进行纯化的试剂，还可避免在纯化过程中减少提出的DNA的损失。可以使用本领域已知的技术进行打断，例如超声波、氮气、机械打断等。优选的是超声波打断。具体地，可以采用下面的步骤将提取得到的基因组DNA用超声波细胞粉碎仪，按照说明书通过设置参数，将DNA 打断为100bp-1000bp的DNA片段。如果DNA片段大于IOOObp，扩散速度低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少，对后面的变性复性不利；如果DNA片段小于lOObp，扩散速度又会太快，在变性复性的时候难以把握时间。超声波细胞粉碎仪一次可打断40ml DNA, 比起现有的打断设备可快速的获得大批量的打断完成的DNA。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为200bp_800bp的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为200bp-600bp的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为250bp-600bp的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为 300bp-500bp 的 DNA 片段，例如:300、350、400、450、或 500bp。关于步骤2)和步骤5)，DNA的纯化上可以采用本领域的现有技术，例如采用市售的DNA纯化试剂盒也可以采用酚氯仿纯化(例如，可以参考Herrmann BG, Frischauf AM Isolation of genomic DNA. Methods Enzymol 1987,152:180-183)。并且步骤 3)和步骤 6)中的纯化方法可以相同或者不同。具体地，例如可以采用下面的方法
采用酚氯仿纯化，并用一倍体积的异丙醇沉淀DNA。此方法不仅可以进行DNA的大规模的纯化，且还能够节约试剂，一倍异丙醇沉淀的效果和乙醇沉淀的效果一样可以满足生产的需求。关于步骤3)，可以采用本领域已知的技术进行DNA的变性和复性，例如加热和冷却。具体地，可以采用下面的步骤采用沸水浴的方法对DNA进行变性后将DNA快速降温，以达到DNA的复性温度，从而确保按照公式c。t = 1 = mol/LXTs计算DNA复性时间t的精确性。对DNA进行复性时，将变性后的DNA放于65°C水浴锅中让其缓慢降温至65°C，才开始对DNA进行复性，复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，可能导致DNA不能复性，如图1所示。而按照公式c。t = 1 = mol/LXTs (此处mol/L是指进行变性反应时所有DNA的初始浓度)计算出的复性时间。由于序列的重复性越高，其复性的速度就会越快，因此在该复性时间T，复性得到的双链重复序列只能是高度重复或者是少量的中度重复序列。此外，在这个过程中还有一些没有来得及复性的DNA单链，可以通过步骤5)中的Slnuclease来降解。具体地，按照公式T = 330/c X 1000 (DNA平均分子量M = 330，起始浓度C。= ng/ μ 1 = g/LXl(T3，则 C。= mol/L = c/MXl(T3 = c/330X10_3 ；由 c。t_lDNA 的定义可得 C。X Ts =1 = mol/LXs ；则Ts = 1/C。= 330/c X 1000)计算每一管的DNA复性时间T (单位为秒)， 其中c为DNA的浓度(指DNA[包括单链和双链]的浓度，单位是ng/ μ 1)。例如测得第N 管的DNA浓度为550ng/ μ 1，则这一管所需的复性时间Tn = 330/550X1000 = 600秒。本发明人通过实验发现，复性时间采用上面计算的T时，复性的效果最佳。实施例 2中对此进行了验证。关于步骤4)，可以采用本领域已知的技术除去溶液中的单链DNA以及未复性的 DNA分子。具体地，采用下面的方法复性完后采用Sl nuclease消化的方法，去除溶液中的单链DNA以及未复性的DNA 分子。具体地，所用Sl nuclease的量=cX20/320 μ 1，其中c为DNA的浓度(指DNA[包括单链和双链]的浓度，单位是ng/ μ 1)。本发明的另一个方面涉及一种c。t_lDNA，其由本发明的制备方法制得。本发明的又一方面涉及一种核酸杂交的方法，包括使用本发明的c。t_lDNA进行封闭的步骤。具体地，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交、或原位杂交；具体地， 所述原位杂交为组织原位杂交、体细胞原位杂交、或荧光原位杂交。对于原位杂交，样品是指组织；对于核酸杂交，样品是指核酸。不管是那种杂交，计算用量都是按核酸的量计算； 总的来说，c。t-lDNA都是过量使用的，一般是样品核酸量的20-30倍左右。本发明的又一方面涉及一种序列捕获方法，包括使用本发明的c。t_lDNA进行封闭的步骤。本发明的又一方面涉及一种组合物，其包含本发明的c。t_lDNA。本发明的又一方面涉及一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其包含本发明的 c0t-lDNA。本发明的又一方面涉及本发明的c。t_lDNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
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在本发明中，术语“中度重复序列”是指10到几百拷贝的DNA序列，复性时间以分计。中等重复序列通常是非编码序列，重复单元的平均长度300bp，往往构成序列家族，用单一序列相隔排列，分散在基因组中。可能在基因调控中起作用。术语“高度重复序列”是指在一个基因组中有几百份甚至几百万份拷贝的DNA序列，重复单元的平均长度300bp，复性时间以秒计。发明的有益效果本发明的c。t_lDNA制备方法能够简洁、高效、高通量地制备c。t_lDNA，并且制得的c。t-lDNA效果良好。相对于目前较为昂贵的商品化的c。t-lDNA产品，本发明制备的 c0t-lDNA成本较低，从而提供了一种良好的可替代的选择。


图1 热变性过程和两种冷却过程示意图。图2:打断的基因组DNA片段的电泳检测。3个样品是相同的平行样品。左侧为 IOObp ladder marker，右侧为 DL2000 marker。图 3 :mixer 禾口芯片。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 :C::t-lDNA样品1的制备一、仪器设备和试剂耗材分别如下面的表1和表2所示。表1 仪器设备
权利要求
1.一种制备c。t-lDNA的方法，包括下述步骤1)将基因组DNA打断成IOObp-IOOObp的DNA片段；2)将打断的DNA片段进行纯化；3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；4)去除经过步骤3)中复性后得到的DNA产物中的单链DNA;5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到c。t-lDNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)为将基因组DNA打断成200bp-600bp的 DNA片段；具体地，所述打断为通过超声波进行打断。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤幻和步骤幻中的纯化为酚氯仿法纯化，其中使用一倍体积的异丙醇沉淀DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤幻中的所述复性的时间按照T= 330/ cX 1000计算，其中，c为DNA的浓度，单位是ng/μ 1 ；具体地，步骤4)中使用Sl nuclease 去除单链DNA。
5.一种c。t-lDNA，其由权利要求1至4中任一项所述的方法制得。
6.一种核酸杂交的方法，包括使用权利要求5所述的c。t-lDNA进行封闭的步骤；具体地，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交、或原位杂交；更具体地，所述原位杂交为组织原位杂交、体细胞原位杂交、或荧光原位杂交。
7.—种序列捕获方法，包括使用权利要求5所述的c。t-lDNA进行封闭的步骤。
8.一种组合物，其包含权利要求5所述的c。t-lDNA。
9.一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其包含权利要求5所述的c。t-lDNA。
10.权利要求5所述的c。t-lDNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种cot-1DNA、其制备方法及用途。具体地，所述制备方法包括下述步骤1)将基因组DNA打断成100bp-1000bp的DNA片段；2)将打断的DNA片段进行纯化；3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；4)去除经过步骤3)中复性后DNA产物中的单链DNA；5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到cot-1DNA。本发明还涉及根据该制备方法制得的cot-1DNA。本发明还涉及一种核酸杂交的方法、含有所述cot-1DNA的组合物、一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒、以及所述cot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
文档编号C12Q1/68GK102465178SQ20101054187
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者孔淑娟, 张俊青, 张秀清, 杨焕明, 程玲, 聂超 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司