专利名称：适用降血压肽工程菌的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵工程领域，更具体涉及到制备一种适用于降血压肽工程菌高效表 达的麦胚培养基。
背景技术：
降血压肽(antihypertensive peptide,ΑΗΡ)是一类能够降低人体血压的活 性生物多肽的总称。它是血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)的 抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的(参见殷晓峰.等人， 中国药理学通报，19:971-975(2003)。)。由于降血压肽具有低毒副作用、降血压效果明显、 来源广泛等特点，已成为目前研究的热点。现阶段研究者主要致力于研究从各种天然蛋白质中获取各种降血压肽，分析获得 新结构的降血压肽。由于从天然蛋白中提取降血压肽步骤繁多，后期处理困难，而化学合成 成本太高，这都限制了降血压肽的研究和开发。近年来基因工程技术的发展为降血压肽的 开发利用带来了机遇，但是有关技术还鲜有报导。在江苏大学食品与生物工程学院近几年的研究中，利用工程菌(大肠杆菌 BL21-MF3A3)发酵生产降血压肽取得了成功，获得了高活性的降血压肽CEI-12和CEI-7混 合肽。但是由于常规LB培养基(见表二)所用的进口牛肉膏蛋白胨成本太高，故为了扩大生 产，降低成本，进行工业化生产，需要对发酵培养基的国产化进行研究。降血压肽一般含有较多的疏水性氨基酸，大肠杆菌BL21-MF3A3所要表达的降血 压肽CEI-12和CEI-7疏水性氨基酸含量也很高，其中苯丙氨酸占21%左右，因此培养基中 各种氨基酸的组成对工程菌的表达有很大的影响。小麦是我国主要粮食作物之一，年产量在1亿吨以上。麦胚是小麦加工的廉价的 副产品，长期以来没有得到有效地开发和利用。麦胚含有丰富的大肠杆菌培养所需要的营 养物质，其蛋白质含量达30%左右，并且麦胚蛋白质中含有较多疏水性氨基酸，其中苯丙 氨酸等疏水性氨基酸的含量与牛肉相当(参见Grewe E.等人，CerealChemistry，20 423-434 (1943)。)。因此研究利用麦胚蛋白水解物代替利用牛肉膏蛋白胨作为工程菌培 养基中的氮源，对降低降血压肽生产成本，提高降血压肽表达效率以及有效的利用麦胚资 源都有着重要的意义。
发明内容
本发明提供一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，以重量计其组成如下葡萄 糖0%_1%，麦胚蛋白酶解物1%- ，酵母粉0%_1%，氯化钠0. 5%，其余为蒸馏水。本发明中所述的麦胚蛋白酶解物按照下述方法制备得到
1、脱脂麦胚加水，搅拌混勻，其中所述脱脂麦胚与水的质量体积比为18%-25%；
2、超声处理时间为15-30min，超声功率为400-800W/100mL，脉冲超声处理的工作与间 歇时间分别为2s和2s ；3、加入中温淀粉酶，在40-50°C下酶解4- ，其中所述中温淀粉酶占脱脂麦胚总质量 的 2%-6% ；
4、调pH至8.0，加入胰蛋白酶，在50°C下酶解2-池，调pH至9. 0，其中所述胰蛋白酶与 脱脂麦胚的体积质量比为2%-6% ；
5、加入碱性蛋白酶，45-55°C下酶解l_6h，其中所述碱性蛋白酶占脱脂麦胚总质量的 1%-3% ；调pH至6. 5-7. 5，100 °C灭酶lOmin，离心取上清液，喷雾干燥得麦胚蛋白酶解物。本发明的优点
本培养原料麦胚廉价易得，制备麦胚蛋白酶解物过程中极大保留和利用了麦胚的营养 成分，工艺简单方便，用此培养基培养大肠杆菌BL21-MF3A3的表达重组蛋白产率高于常规 培养基。
具体实施例方式本发明使用的脱脂麦胚购自河南漫天雪面粉厂，中温淀粉酶(活力4000u/mg)购自 Novo公司，胰蛋白酶(活力2500u/mg)购自国药集团，碱性蛋白酶为诺维信食品级碱性蛋白 酶Alcalase2. 4L购自诺维信公司，其他试剂为国药分析纯。本发明所涉及的大肠杆菌BL21-MF3A3，已经另行申请专利，在“一种多活性肽的 串联DNA构建、表达及其应用”专利中有详述，该菌种于2010年8月19日在中国武汉的 中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为fecAericAai coli BL21-MF3A3 CCTCC NO: M 2010204。本发明实施例所使用的麦胚蛋白酶解物由如下方法制备取25g脱脂麦胚，加 水IOOmL搅拌混勻，超声处理30min (600W，2s/k)，加入Ig的中温淀粉酶，在50°C下水解 6h，调pH至8. 0，加入Ig的胰蛋白酶，在50°C下酶解2h，调pH至9. 0，加入碱性蛋白酶液 0. 5mL,在50°C下酶解池，调pH至7. 0，100°C灭酶，离心取上清，喷雾干燥得得麦胚蛋白酶解 物。实施例1
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖0g，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉lg，氯化钠0. 5g， 其余为蒸馏水。实施例2
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖0. 5g，麦胚蛋白酶解物lg，酵母粉0. 5g，氯化 钠0. 5g，其余为蒸馏水。实施例3
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖0. 5g，麦胚蛋白酶解物1.5g，酵母粉lg，氯化钠 0. 5g，其余为蒸馏水。实施例4
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖0. 5g，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉0g，氯化钠 0. 5g，其余为蒸馏水。实施例5
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖lg，麦胚蛋白酶解物lg，酵母粉lg，氯化钠 0. 5g，其余为蒸馏水。
实施例6
以重量计IOOmL培养基含有葡萄糖lg，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉0. 5g，氯化钠 0. 5g，其余为蒸馏水。大肠杆菌的培养和蛋白含量测定
将上述降血压肽工程菌即大肠杆菌BL21-MF3A3按体积比为1%接种量接种于50 mL 含卡那霉素(50yg/L)的麦胚培养基(其中不同培养基的组成如表一所示)中，37°C，200 r · miiT1恒温摇床培养至0D600为2. 0时，添加异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终 浓度1 mm0l*L _ 1JSO诱导12h，5000 r ·mirT1离心收集菌体，将菌体反复冻溶3次，在 PBS (ρΗ7· 0)缓冲溶液进行超声破碎(300W，k/2s，anin)，8000 r · min—1离心取沉淀，将沉 淀溶于进行8 mL上柱缓冲溶液，进行活化的Ni-柱(Novagen，美国)纯化His标记的重组 蛋白，纯化步骤均按Ni-柱纯化说明。纯化的重组蛋白采用考马斯亮蓝法测定。利用麦胚 培养基培养表达的重组蛋白量明显高于LB培养基的，见表一和表二。表一麦胚培养基的成分(IOOmL)与表达的重组蛋白量
权利要求
1.一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，以重量计其组成如下葡萄糖0%-1%，麦胚 蛋白酶解物1%- ，酵母粉0%-1%，氯化钠0. 5%，其余为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，其特征在于其中所 述的麦胚蛋白酶解物按照下述方法制备得到(1)脱脂麦胚加水，搅拌混勻，其中所述脱脂麦胚与水的质量体积比为18%_25%；(2)超声处理时间为15-30min，超声功率为400_800W/100mL，脉冲超声处理的工作与 间歇时间分别为 和2s;(3)加入中温淀粉酶，在40-50°C下酶解4- ，其中所述中温淀粉酶占脱脂麦胚总质量 的 2%-6% ；(4)调pH至8.0，加入胰蛋白酶，在50°C下酶解2-池，调pH至9. 0，其中所述胰蛋白酶 与脱脂麦胚的体积质量比为2%-6% ；(5)加入碱性蛋白酶，45-55°C下酶解1-他，其中所述碱性蛋白酶占脱脂麦胚总质量的 1%-3% ；调pH至6. 5-7. 5，100 °C灭酶lOmin，离心取上清液，喷雾干燥得麦胚蛋白酶解物。
全文摘要
本发明公开了一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，涉及发酵工程领域。以重量计培养基组成如下葡萄糖0%-1%，麦胚蛋白酶解物1%-2%，酵母粉0%-1%，氯化钠0.5%，其余为蒸馏水。本发明的培养基原料麦胚廉价易得，制备麦胚蛋白酶解物过程中极大保留和利用了麦胚的营养成分，工艺简单方便，用此培养基培养大肠杆菌BL21-MF3A3的表达重组蛋白产率高于常规培养基。
文档编号C12P21/00GK102102117SQ20101054700
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者任晓锋, 曲文娟, 李云亮, 马海乐, 黄六容 申请人:江苏大学