专利名称：一种杂合酶P450sca2-BMR及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂合酶P450sca2-BMR及其编码基因与应用。
背景技术：
随着冠心病成为当今社会的主要致命病症之一，研究高效的调血脂药物成为制药 工业的一个重要的目标和责任。利用化学法羟基化美伐他汀生产普法他汀在经济上是不可 行的，生物法简单易行逐渐发展成普法他汀的主要生产方法。普法他汀的生物法工业生产 是两步发酵过程，首先由橘青霉(Penicillium citrinum)发酵生产美伐他汀，由浓碱处理 为钠盐形式，再利用微生物转化的方法将美伐他汀钠羟基化生成普法他汀钠。野生型细胞色素P450SCa-2是含有410个氨基酸的蛋白，存在于澳大利亚 土样中发现的嗜碳链霉菌 Sti^ptomyces Carbophilus 中(Matsuoka T, Miyakoshi S. PureCytochrome P_450Enzyme are Obtained from Streptomyces CarbophiIus and Used forHydroxylation especially ofMacrolide Antibiotics :Japan, US5179013A. 1993-01-12.)。该菌株对美伐他汀具有强羟基化作用并且副产物很少，因而用 于普法他汀的生物法工业生产，其中其主要催化作用的是细胞色素P450sCa-2。生物法发酵 美伐他汀生产普伐他汀的过程具有低效高成本等劣势，因此通过重组表达和改造细胞色素 P450sca-2实现酶法生产普伐他汀具有重要的现实意义。细胞色素P450sca-2催化美伐他汀羟基化生成普伐他汀的过程是典型的细胞色 素P450催化小分子有机物单加氧反应的过程。野生型细胞色素P450sCa-2催化体系属于 双组分细胞色素P450催化体系，需要氧化还原辅酶的协助将来自NAD (P) H的电子传递到细 胞色素P450的活性中心。不同于其他双组分细胞色素P450催化体系，细胞色素P450sca-2 的催化体系不是结合在膜结合锚点上而是存在于细胞液中。电子在不同蛋白分子间的传递 影响了体系的电子传递效率和利用率，也影响了细胞色素P450sca酶的催化活性。因此希 望通过构建细胞色素P450sca-2杂合酶实现电子的自给自足，设计出满足酶法生产普伐他 汀工业需求的蛋白。细胞色素P450BM3是人们发现的第一个单组分体系细胞色素P450酶，最早 由 Fulco 等在 Bacillus megaterium 中获取(Narhi L 0, Fulco A J. Phenobarbital Induction of aSoluble Cytochrome P-450-dependent Fatty Acid Monooxygenase in Bacillus megaterium. The Journal ofBiological Chemistry. 1982,257 (5) 2147-2150.)。细胞色素P450BM3电子传递效率高于大部分其它细胞色素P450酶，其结构 和空间折叠为酶体系提供了有效的自给自足的电子传递系统，可将NAD(P)H产生的电子 100%用于产物生成，催化效率也远高于许多其它酶系统，为研究细胞色素P450单加氧催 化体系的电子传递机制和进行杂合酶设计提供了良好的参照。
发明内容
本发明目的是提供一种具有羟基化美伐他汀的催化活性的蛋白。
本发明提供的蛋白，命名为P450sca2-BMR，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；幻将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有羟基化美伐他汀的催化活性的由1)衍生的蛋白质。序列表中序列2所示的蛋白有1010个氨基酸残基，第1-410位为P450sca的酶功 能域(HEME功能域)、第411-432位为连接肽、第433-1010位为P450BM3的天然氧化还原 域。蛋白P450sca2-BMR的具体示意图如图1所示。为了使1)中的P450sca2_BMR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述幻中的P450sca2-BMR可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述2)中的P450sca2-BMR的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中 缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在 其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述蛋白P450sca2_BMR的编码基因(命名为P450sca2_BMR)也属于本发明的保 护范围之内。进一步，上述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1 ；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中的序列1由3033个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为第1-3033位碱 基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白。其中第1-1230位碱基编码P450sca的 酶功能域；第U97-3033位碱基编码P450BM3的天然氧化还原域。上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。含有上述基因(P450sca2-BMR)的重组载体或转基因细胞系也属于本发明的保护 范围之内。
进一步讲，上述重组载体为在pET30a(+)载体的多克隆位点间插入权利要求2或 3所述基因得到的重组表达载体。含有上述基因(P450sca2-BMR)的重组菌也属于本发明的保护范围之内。进一步讲，上述重组菌是含有上述重组载体的重组菌。具体地讲，上述重组菌是含有上述重组载体的重组大肠杆菌。上述蛋白(P450sca2_BMR)、上述基因(P450sca2_BMR)、上述的重组菌在催化美伐 他汀羟基化生成普伐他汀中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述蛋白(P450sca2_BMR)、上述基因(P450sca2_BMR)、上述的重组菌在制备调血 脂药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明细胞色素杂合酶P450sca2-BMR表达活性高，可在大肠杆菌细胞内高 活性表达，并提高了野生型细胞色素的可溶性；( 本发明细胞色素杂合酶P450sca2-BMR 稳定性好，成功实现了细胞外纯化；C3)本发明细胞色素杂合酶P450sca2-BMR保留了野 生型细胞色素P450sca-2的催化活性并且有的12. 7%提高；(4)本发明细胞色素杂合酶 P450sca2-BMR具有催化美伐他汀生产高效降血脂药物普伐他汀的活性，为进一步提高酶活 和实现工业酶法生产普伐他汀的应用奠定了基础。
图1为本发明提供的细胞色素杂合酶蛋白P450sca2-BMR构成示意图；其中，1为HEME功能域；2为连接肽段，包含P450BM3上449-470位的22个氨基酸 残基；3为还原域，包含P450BM3上471-1048位的氨基酸残基。图2为细胞色素P450Sca2-BMR催化美伐他汀羟基化生成普伐他汀的反应式。图3为细胞色素杂合酶P450Sca2-BMR催化美伐他汀生成普法他汀的机理示意 图；其中，M为美伐他汀，P为普法他汀。图4为细胞色素杂合酶P450sca2_BMR在大肠杆菌E. coli BL 21(DE3)中的表达
结果；其中，S代表不可溶蛋白，P代表不可溶蛋白。1为阴性对照空白实验，2为野生型 细胞色素P450sca-2表达结果，3为野生型细胞色素P450sca_2与细胞色素P450BM3的还原 域直接相连不含连接肽段的细胞色素P450sCa-2杂合酶表达结果，4为本发明提供的细胞 色素杂合酶P450sca2-BMR表达结果；图5为本发明提供的细胞色素杂合酶P450sca2-BMR的SDS凝胶电泳检验纯化结 果；其中，1为细胞色素杂合酶P450Sca2-BMR表达粗提液的穿透峰组分，0. 02mM IPTG诱导； 2为本发明提供的细胞色素P450sca-2杂合酶纯酶，0. 02mM IPTG诱导；3为蛋白Marker。图6为HPLC检测细胞色素杂合酶P450Sca2-BMR全细胞催化美伐他汀钠生成普伐 他汀钠色谱图；其中，1为空载体pET30a的阴性空白实验；2为野生型细胞色素P450sca-2 全细胞催化美伐他汀钠生成普伐他汀钠的峰图；3为本发明提供的杂合酶P450sca2-BMR全 细胞催化美伐他汀钠生成普伐他汀钠的峰图。图7为本发明提供的细胞色素P450sca-2杂合酶全细胞催化活性测试结果；
其中，1为阴性对照空白实验；2为野生型细胞色素P450sca-2 ；3为本发明提供的 细胞色素杂合酶P450sca2-BMR。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。生物材料的获得重组质粒pET30a_P450sca2 制备序列表中序列1的第1-1230位的DNA片段，将 该DNA片段插入pET30a(+)的XbaI和Xho I位点间，构成重组质粒pET30a_P450sca2。重组质粒pET28a_BM3 制备序列表中序列1的第1231-3033位的DNA片段，将该 DNA片段插入pET28a(+)的XbaI和XhoI位点间，构成重组质粒pET28a_BM3。实施例1、杂合酶(P450sca2_BMR)的制备纯化一、杂合酶编码基因的获得以重组质粒 pET30a-P450sca2 为模板，利用引物 P450scaGFPF(5，-ACAATTCCCCT CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGG-3’, XbaI)和弓丨物 hyE fl-rev(5' -CCAAGCGGAATTT TTTTCGATTT CCAGGTCACC GGTAATTCGT-3，)扩增 P450sca2 基因。以重组质粒pEI^8a_BM3为模板，利用引物hyE f2-for (5，- ACGAATTACCGGTGACCTGG AAATCGAAAAAAATTCCGCTTGG _3，)和 P450BM3_rev (5， -GATCTCTCGAGTTACCCAGCCCACACGTCTTTT-3 ’，XhoI)扩增细胞色素 P450BM3 的连接肽段 (449-470aa)和还原酶结构域 BMR (471-1，048aa)。二、重组表达载体pET30a-P450sca2_BMR的构建以上述扩增的P450sca2基因和BMR基因为模板，利用引物P450scaGFPF和 P450BM3-rev,通过Overlapping PCR扩增出本发明中的P450sca2_BMR基因(序列 见列表1)。利用)(ba I和BioI双酶切，纯化后，与用同样内切酶进行双切的表达载 体pET30a(+)过夜连接，随后转入化转感受态细胞BL21(DE3)中，即获得重组表达质粒 pET30a-P450sca2-BMR。经测序，pET30a-P450sca2-BMR结构正确。三、重组菌的获得将步骤二获得的pET30a-P450sca2_BMR 转化大肠杆菌 BL21 (DE3) (Novagen 公司)， 得到重组菌 E. coli BL21 (DE3)/pET30a-P450sca2_BMR。然后在含卡那霉素(50yg/mL)的LB平板上划线，37 °C过夜培养，再挑取生 长良好的的单菌落接种于ImL LB液体培养基(含50yg/mL卡那霉素)中，同时以 E. coliBL21(DE3)/pET30a为空白对照，37°C，250rpm过夜培养，以1 50的接种量进行步 骤四的实验。四、杂合酶的获得1、杂合酶的表达以上述1 50的接种量转接于IOmL新鲜的液体LB培养基(含50 μ g/mL卡那 霉素)中，1 50的继续培养至OD6tltl为0. 6 0. 8。加入终浓度为ImM的5-氨基酮戊酸 (5-aminolevulinic acid，5-ALA，购于百灵威化学技术有限公司)和终浓度为0. 5mM的I^eCl3(购于北京益利精细化学品有限公司)，在23°C，250rpm条件下继续培养20min。
然后加入终浓度为0. 02mM的IPTG，在23°C，250rpm条件下培养4h 他，诱导细胞 色素P450sca2-BMR杂合酶的表达。诱导表达结束后，取30ml OD6tltl菌液，于4°C，3，500rpm 条件下离心lOmin，菌体沉淀用ImL细菌裂解缓冲液重悬(IOOmMTris-HCl，pH 7. 5，其中含 有20% glycerol v/v,2mM EDTA和1.5mM DTT)。重悬液用超声破碎方法提取可溶蛋白(超 声时间4s，间隔时间3s，超声30次)，超声前向重悬液中加入终浓度为ImM的苯甲基磺酰氟 (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF, Amresco 分装)，以防止细胞色素 P450sca2_BMR 杂合酶蛋白被蛋白酶分解。将裂解液13，OOOrpm条件下离心lOmin，取上清即为蛋白可溶部 分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀，再用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(10%丙烯酰 胺凝胶)。结果如图4所示，0. 02mM IPTG诱导条件下，野生型P450sca-2相比于阴性对照 pET30a有明显的可溶表达，但多以包涵体形式存在；本发明提供的杂合酶P450sca2-BMR几 乎完全可溶表达，分子量大致均在1 IOkDa左右，与目标蛋白的理论计算值相近，相比野生 型P450sca-2的单独表达，本发明的杂合酶P450可溶性因为BMR的融合而大大提高，可知 BMR具有一定的增溶作用。2、杂合酶的纯化使用安玛西亚(AmershamBiosciences)公司的 Hitrap Chelating HP 柱，以镍离 子作为亲和离子，依靠不同咪唑浓度梯度洗脱目的蛋白。在0.02mM IPTG诱导条件下，表达 杂合酶His-P450sca2-BMR。离心后，用buffer A重悬菌体沉淀，并超声99次破碎并再次离 心，得到目标蛋白的粗提液。取出离心后的上清液，用0.22μπι低蛋白质结合的滤膜过滤后，上样至已结合Ni2+ 的HiTrap Chelating HP柱(体积ImL)，再用30_330mM的咪唑浓度梯度洗脱蛋白。由于 P450酶比较容易失活，故实验所有操作都要在4°C进行，并保证预冷所有相关缓冲液。此 外，P450酶在420nm都有特定吸收峰，故在纯化过程中，用420nm检测蛋白峰可以有效防止 杂蛋白干扰。纯化得到的蛋白保存于20%的甘油中，分装后在-70°C冷冻保存。蛋白纯度 由SDS-PAGE(10%丙烯酰胺凝胶)检验，结果如图5所示，纯化时穿透峰组分中几乎没有杂 合酶P450Sca2-BMR，大部分结合在镍柱上被纯化出来，分子量大致均在IlOkDa左右，与目 标蛋白的理论计算值相近，收集的蛋白纯度大于90%。实施例2、杂合酶的催化活性检测将重组菌E. coli BL21(DE3)/pET30a-P450sca2-BMR 在 0. 02mM IPTG 诱导下表达 4h后，取30ml OD600菌液，于4°C，3，500rpm条件下离心lOmin，菌体沉淀用ImL细菌裂解缓 冲液重悬(IOOmM Tris-HCl,pH 7. 5, 20% glycerol v/v,2mM EDTA，1. 5mMDTT)，加入底物美 伐他汀钠(浙江海正药业股份有限公司赠送)(终浓度为0. 05mg/mL)，随后在30°C下进行 美伐他汀钠的羟基化反应(羟基化反应式如图2所示，催化机理示意图如图3所示)。反 应结束后，利用HPLC分析转化产物。HPLC图谱如图6所示，野生型P450sca-2和本发明提 供的杂合酶P450sca2-BMR在保留时间tK 4. 5min处出现普伐他汀钠色谱峰，在保留时间tK 16min处出现美伐他汀钠色谱峰，且杂合酶P450sca2-BMR的普伐他汀钠产物峰略高于野生 型 P450sca-2。转化产物普伐他汀钠色谱峰的面积如图7所示，其中本发明提供的杂合酶 P450sca2-BMR通过全细胞转化，催化美伐他汀钠生成普伐他汀钠的量比野生型细胞色素P450sca-2提高约12. 7%，说明P450sca2-BMR在提高可溶性的基础上，保留了野生型细胞 色素P450sca-2的催化活性并有约12. 7%的提高。
权利要求
1.一种蛋白，是如下1)或幻的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有羟基化美伐他汀催化活性的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-3) 中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；3)与1)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体或转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pET30a(+)载体 的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求4或5所 述重组载体的重组菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求4或5所 述重组载体的重组大肠杆菌。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求6-8中任一所述的重组菌 在催化美伐他汀羟基化生成普伐他汀中的应用。
10.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求6-8中任一所述的重组 菌在制备调血脂药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种杂合酶P450sca2-BMR及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羟基化美伐他汀的催化活性的由1)衍生的蛋白质。本发明的P450sca2-BMR保留了野生型细胞色素P450sca-2的催化活性并且有的12.7％提高，具有催化美伐他汀生产高效降血脂药物普伐他汀的活性，为进一步提高酶活和实现工业酶法生产普伐他汀的应用奠定了基础。
文档编号C12N1/21GK102093984SQ20101056117
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者巴丽娜, 张玲玲, 朱玉山, 林章凛 申请人:清华大学