一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白的制作方法

文档序号:587366阅读:256来源:国知局
专利名称:一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,涉及链霉菌柠檬酸合酶基因、该基因编码的蛋白 以及该基因的应用。
背景技术
柠檬酸合酶(citrate synthase,CS,EC 4. 1. 3. 7)几乎存在于所有的生物体中,是 细胞内多种代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶。CS可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A 之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。根据其在真核细胞中的定位不同,CS可分为线粒体 CS (mCS)、乙醛酸循环体CS (gCS)、过氧化物酶体CS (pCS)。CS具有多种同工酶,这些同工酶 参与多种生理过程,如线粒体能量代谢、种子萌发和抗逆等。近年来,由于其在农业、医学上 的应用价值,CS受关注的程度日益升高。CS的同工酶存在于不同的亚细胞结构中,参与细胞内多个重要的生理代谢途径。 由于柠檬酸在植物代谢中起重要作用,近年来关于利用CS基因进行转基因植物的研究逐 渐成为热点。已有研究表明植物可以通过分泌柠檬酸活化土壤中难溶性无机磷来提高土壤 磷的可利用性。将CS基因导入粳稻和籼稻中,通过筛选获得转基因阳性植株,使CS在水稻 植株内超表达,以加速根系大量合成和分泌柠檬酸,可培育出耐低磷胁迫的转基因水稻植 株,直接用于生产。另外,CS等有机酸可与Al3+络合形成稳定的复合物,这些复合物对植物 的毒性较低甚至是无毒的,所以提高有机酸合成酶基因的表达活性,增加有机酸的合成与 分泌,有利于增强植物的抗铝毒耐性。研究发现,在紫花苜蓿中超表达CS基因,转基因苜蓿 对酸性土壤以及铝毒的耐受力明显增强,植株的产量显著提高。此外,在果实的成熟过程 中,有机酸的积累与CS的表达有关。在菠萝成熟过程中,果实中有机酸(主要是柠檬酸) 的含量与CS活性成极显著的正相关。这可为提高水果品质提供了理论依据。CS基因能够 显著改变植物生长状态,提高植物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力,因此具有较高 的应用价值。链霉菌(Sti^ptomyces)是一种重要的原核生物,属于放线菌目革兰氏阳性土壤 细菌。菌丝呈分枝状,好气腐生。链霉菌有“大自然最全能的抗生素生产者”的美誉。目前, 医学应用的抗生素中,约有三分之二来源于链霉菌属。同时,链霉菌次级代谢物的种类繁多 且功能多样,不仅有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗癌等作用,而且代谢物具有免疫抑制剂、降 血压和抗高胆固醇的性质。因此,链霉菌是工业上获得次级代谢产物的重要来源。另外,链 霉菌还可以产生多种可分解蛋白质、木质素、几丁质及纤维素的酵素,分解自然界不易被其 它微生物分解的物质,如促进废弃物的分解,可以生产有机肥,解决环境污染问题并提高废 弃物的价值等,工业用途十分广泛。近年来,随着有效的链霉菌表达系统的构建,链霉菌分 子生物学研究发展迅速,越来越引起人们重视。

发明内容
本发明所要解决的第一个问题是提供一个目前尚未完成全基因组测序的链霉菌一淀粉酶链霉菌柠檬酸合酶基因(SdCS)。其具有如序列表SEQ ID NO :1所示的基因 序列。本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质SdCS及其制备方 法,其具有如序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明所要解决的第三个问题是提供含有淀粉酶链霉菌SdCS基因的重组质粒及 其构建方法。本发明所要解决的第四个问题是提供淀粉酶链霉菌SdCS基因在转基因植物中的 应用。


图1淀粉酶链霉菌基因组第一次克隆PCR结果电泳图。M :DL-2000Marker ;1,2 :PCR 扩增产物,1563bp。图2SdCS基因ORF保守片段电泳图。M :DL-2000Marker ;1 :PCR 扩增产物,1290bpo图 3Hi%-SdCS 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 分析图(A) SDS-PAGE 电泳(12% gel)。M :protein molecular mass marker ; lane 1,纯 化的SdCS融合蛋白;lane 2,pET-SdCS重组质粒转化Rosetta(DEIB)菌,经IPTG诱导表达 后的上清蛋白,SdCS本身分子量约为45kDa ; lane 3,pET-SdCS重组质粒转化Rosetta (DE3) 菌,未经IPTG诱导表达的上清蛋白;lane 4,pET-28b (+)空载质粒转化Rosetta(DE3)菌, 诱导表达后的上清蛋白。(B) Western-blot 分析。lane 1,纯化的 SdCS 融合蛋白;lane 2,阴性对照, pET-28b (+)空载质粒转化Rosetta(DEIB)菌,经IPTG诱导表达后的上清蛋白。箭头所示 SdCS蛋白亚基条带所处的位置。
具体实施例方式5. 1链霉菌DNA的提取、同源引物的设计及PCR扩增用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega 公司)抽提链霉菌 M1033(山东省食品发酵工业研究院设计院)基因组DNA。依据链霉菌属CS基因之间的 同源性,设计一对引物P1 (5 ‘ -AAGTGGGGGATGGTAGAGACAGT-3 ‘)和 P2 (5 ‘ -CCTCACAGA CGCCCGGCCGGATC-3'),以淀粉酶链霉菌基因组DNA为模板,Pl和P2为引物,使用高保真 Prime STAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增,扩增反应条件94°C预变性!Min ;94°C 30sec, 60°C 45sec,72°C 2min,30 个循环;72°C延伸 5min。引物P1/P2扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。使用DNA GelExtraction Kit(Axygen)回收 PCR 产物。将该 DNA 片段连接到 pMD19_T 载体(TaKaRa), 阳性克隆送到上海生工生物工程公司进行测序,得到一个1563bp的DNA片段。5. 2全长SdCS基因片段的获得将所得的序列进行核苷酸BLAST同源性比对发现,该片段内包含一个完整的0RF, 全长1290bp,如序列表SEQ ID N0:1所示。该ORF编码一个似9个氨基酸的多肽,如序列 表SEQ ID NO :2所示。所得ORF与该属已知的柠檬酸合酶基因的核苷酸序列同源性可达到90%以上;氨基酸序列同源性也在90%以上。因此,引物P1/P2扩增片段中包含的这个ORF 应该是编码淀粉酶链霉菌CS的全基因。根据已经获得的SdCS基因的保守片段序列设计两个基因特异性引物P3(5' -CT CCTGCCATATGAGCGACAACTCTGTAGTACTGC-3 ‘,下划线位置为限制性内切酶Nde I酶切位点) 和 P4(5' -ATTAGTATGCGGCCGCTCAGCGCTCCTCGACGGGCACG-3',下划线位置为 Not I 酶切位 点),PCR扩增淀粉酶链霉菌CS的完整0RF,扩增反应条件94°C预变性^iin ;94°C 30sec, 56°C 45sec,72°C 1. 5min,30 个循环;72°C延伸 5min。引物 P3/P4 的 PCR 扩增产物经 的 琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。5. 3pET-SdCS原核表达载体的构建及融合蛋白的诱导表达弓I物P3/P4的PCR扩增产物与载体pET_28b (+)分别经Nde I和Not I双酶 切4小时候后进行连接,获得原核表达质粒pET-SdCS。将pET-SdCS重组质粒转化至 E.coli Rosetta (DE3)感受态细胞,挑取单克隆于5ml LB液体培养基中,37°C,225rpm,培 养12h。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养,37°C,225rpm,振荡培养至 OD600 ^ 0. 6-0. 8,加入 IPTG 至终浓度 0. 5mM,20°C诱导表达 18h。将诱导后的菌液于4°C,5,OOOrpm,离心5min,收集菌体,超声波破碎后SDS-PAGE 检测,发现重组蛋白His6-SdCS存在于可溶性的上清蛋白中(图3A)。Co2+离子亲和层析 (TALON purification Kit,Clontech)纯化后的蛋白质用 12% SDS-PAGE 分离鉴定,在 分子量略大于45kDa的位置有一特异性的条带(如图3A),与通过氨基酸序列推测的SdCS 的分子量大小(47.8kDa)基本一致;另外,Western blot结果显示,也在略大于45kDa处有 一条特异性很强的条带,说明纯化收集的蛋白质就是带有Hk6-tag的SdCS (图3B)。柠檬 酸合酶基因在转基因植物中具有较高的应用价值,可用于植物的基因改良。通过转入SdCS 基因,可提高农作物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力。SEQUENCE LISTING
<110>安徽师范大学
<120> 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白
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<170>PatentIn version 3. 3
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<212>DNA
<213>淀粉酶链霉菌(Sti^ptomycesdiastaticus)
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gacggcgagg ccggcatcct ccggtaccgcggctacccga tcgagcagctggccgagcgc240
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42042权利要求
1.一种链霉菌柠檬酸合酶基因,其特征在于,具有SEQ ID NO :1所示的基因序列。
2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白,其特征在于具有SEQ ID NO :2所示的氨 基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述基因的重组质粒及其构建方法。
4.权利要求1所述链霉菌柠檬酸合酶基因在植物基因工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白,所述的基因具有SEQ ID NO1所示的基因序列。该基因的完整ORF长为1290bp,编码一个429个氨基酸的多肽。将SdCS与表达载体pET-28b(+)连接,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经诱导表达、纯化,获得了可溶性融合蛋白His6-SdCS。柠檬酸合酶基因在转基因植物中具有较高的应用价值,可用于植物的基因改良。通过转入SdCS基因,可提高农作物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力。
文档编号C12N15/63GK102061300SQ20101056267
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月27日 优先权日2010年11月27日
发明者宋平, 曹正宇, 朱国萍, 王鹏, 葛亚东 申请人:安徽师范大学
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