黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法

文档序号:587731阅读:375来源:国知局
专利名称:黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,属于植物生物技 术领域。
背景技术
黄瓜细菌性角斑病(Pseudomopnas syringae pv. lachrymans)是一种重要的细菌 性病害。致病菌为丁香假单孢杆菌黄瓜致病变种,属薄壁菌门假单孢菌属。发病初始产生 水渍状小斑点,扩大后受叶脉限制,病斑呈多角形,淡黄色至褐色,边缘有黄色晕环,发病严 重时,病斑布满叶片,使叶片干枯卷曲脱落。该病在保护地及露地生产中均有发生,且以露 地危害最重,造成严重减产。近年来随着黄瓜种植面积的不断扩大,此病已成为黄瓜生产中 亟待解决的问题。关于黄瓜细菌性角斑病生物防治主要集中在选用优良抗病品种、种子消 毒、培育无病苗、加强栽培管理、生态防治和化学药剂防治等几个方面。目前对于黄瓜与细 菌性角斑病相互作用的分子机理仍不清楚,许多关于病原菌基因和黄瓜抗病基因的结构和 功能作用方式仍不清晰,因此寻找与黄瓜抗细菌性角斑病基因紧密连锁的分子标记,对于 加快黄瓜育种进程具有重要的实际应用价值。

发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子 标记鉴定方法,能够更好地利用上述黄瓜抗病基因分子标记,并将黄瓜抗细菌性角斑病分 子标记应用于黄瓜育种的辅助选择。上述的目的通过以下的技术方案实现黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,该方法包括如下步骤以细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系的DNA为模板,以CSWCT24A为引物进 行PCR扩增,对扩增产物进行3 %琼脂糖凝胶电泳检测或者对扩增产物进行7.5%的变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测,如果扩增得到的带型与已知的抗细菌性角斑病的黄瓜东农803带 型一致,则该细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系为抗细菌性角斑病品种或品系,所 述PCR扩增的程序为94°C预变性5min,94°C变性30s,57°C退火lmin,35个循环,72°C延伸 lmin,72°C延伸lOmin,最后4°C保存,所述的CSWCT24A为引物 1 5,-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3,,引物 2 5,-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3,。所述的黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,所述PCR扩增中,每 20μ 1 的 PCR 反应体系如下10 X buffer :2μ l,2mM dNTP :2 μ 1,lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1,ddH20 :10. 7μ 1。黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法在辅助选择抗病黄瓜材料中的应用。
有益效果1.本发明直接以DNA的形式表现,在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测 到,不受季节、环境限制,不存在表达与否等问题,因此,本发明能够克服黄瓜细菌性角斑病 抗性鉴定易受环境影响的缺点,在苗期就能够通过分子标记对黄瓜品种和品系的细菌性角 斑病抗性进行鉴定和筛选,淘汰感病植株,减少人力和物力的浪费,提高育种效率。同时, DNA分子标记技术操作简单,成本低廉,用时短,在一天内即可完成全部的检测过程。通过高 效率的分子标记检测,还能够减少农民的农药用量,降低生产成本,提高其经济收入,也可 以有效减轻农药对环境产生的污染和危害。2.所需样本数量少,操作比较简便,效率高,成本低廉。3.本发明易于掌握,不受环境条件影响,重复性高。


图1黄瓜抗细菌性角斑病基因分子标记的琼脂糖电泳检测结果(东农804),图中 M :DL2000DNA Marker ;1,抗病对照东农 803 ;2-3,东农 804 单株。图2黄瓜抗细菌性角斑病基因分子标记的琼脂糖电泳检测结果(东农80 ,图中 M :DL2000 DNA Marker ;1,抗病对照东农803 ;2 8 东农805单株。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试 验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有引物合成均由生工生物 工程(上海)有限公司完成。以下实施例中所有用到的黄瓜材料均为公知的。实施例1 黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,该方法包括如下步骤以细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系的DNA为模板,以CSWCT24A为引物进 行PCR扩增,对扩增产物进行3 %琼脂糖凝胶电泳检测或者对扩增产物进行7.5%的变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测,如果扩增得到的带型与已知的抗细菌性角斑病的黄瓜东农803带 型一致,则该细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系为抗细菌性角斑病品种或品系,所 述PCR扩增的程序为94°C预变性5min,94°C变性30s,57°C退火Imin,35个循环,72°C延伸 lmin,72°C延伸lOmin,最后4°C保存,所述的CSWCT24A为 引物 1 5,-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3,,引物 2 5,-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3,。实施例2 所述的黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,所述PCR扩增中,每 20μ 1 的 PCR 反应体系如下10 X buffer :2μ l,2mM dNTP :2 μ 1,lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1,ddH20 :10. 7μ 1。实施例3 黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法在辅助选择抗病黄瓜材料中的应用。
以东北农业大学园艺学院黄瓜课题组培育出的黄瓜杂交新品种东农804和东农 805为材料;提取其单个植株DNA为模板,以本发明提供的1个黄瓜抗细菌性角斑病特异分 子标记CSWCT24A为引物进行PCR扩增,结果表明,东农804和东农805单株的PCR扩增带型 与抗病对照东农803扩增带型完全一致,且PCR检测结果与田间细菌性角斑病抗性鉴定的 吻合率为100%,证明了 CSWCT24A是一个实用的黄瓜细菌性角斑病抗性检测的分子标记。
权利要求
1.一种黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,其特征是该方法包括如下步 骤以细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系的DNA为模板,以CSWCT24A为引物进行 PCR扩增,对扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测或者对扩增产物进行7. 5%的变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测,如果扩增得到的带型与已知的抗细菌性角斑病的黄瓜东农803带型 一致,则该细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系为抗细菌性角斑病品种或品系,所述 PCR扩增的程序为94°C预变性5min,94°C变性30s,57°C退火Imin, 35个循环,72°C延伸 lmin,72°C延伸lOmin,最后4°C保存,所述的CSWCT24A为引物 1 :5’ -AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3,,引物 2 :5,-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3,。
2.根据权利要求1所述的黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法,其特征 是所述PCR扩增中,每20 μ 1的PCR反应体系如下=IOXbuffer :2μ l,2mM dNTP :2 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 1 :0. 8 μ 1,IOpmol/μ 1 的 Primer 2 0. 8μ l,25mM MgCl2 :2. 5 μ 1, 5U/ μ 1 的 TaqDNA 聚合酶0. 2 μ 1,60ng/ μ 1 的模板 DNA 1 μ 1,ddH20 10. 7 μ 1。
3.—种上述黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法在辅助选择抗病黄瓜材料 中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种黄瓜抗细菌性角斑病基因的分子标记鉴定方法。本发明的方法包括以细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系的DNA为模板,以CSWCT24A为引物进行PCR扩增,对扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测或者对扩增产物进行7.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,如果扩增得到的带型与已知的抗细菌性角斑病的黄瓜东农803带型一致,则该细菌性角斑病抗性未知的黄瓜品种或品系为抗细菌性角斑病品种或品系,所述PCR扩增的程序为94℃预变性5min,94℃变性30s,57℃退火1min,35个循环,72℃延伸1min,72℃延伸10min,最后4℃保存。本发明用于鉴定黄瓜抗细菌性角斑病基因。
文档编号C12Q1/68GK102102128SQ201010575818
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者周秀艳, 武涛, 王丽莉, 秦智伟, 辛明 申请人:东北农业大学
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