专利名称：杀菌通透性增强蛋白基因作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于猪遗传育种及分子标记辅助选择技术领域，具体涉及猪大肠杆菌病抗 性遗传标记的筛选和应用。
背景技术：
随着我国规模化养猪业的迅猛发展，猪病对规模化养猪生产的危害也日趋加重， 并成为当前我国养猪业健康发展的主要瓶颈。疾病给养猪业造成的直接经济损失约占总产 值的12% 15%。仔猪腹泻和水肿病是规模化猪场最常见的一类疾病，对哺乳仔猪的危害 尤为严重。据有关资料的统计数字表明，许多猪群仔猪腹泻性疾病发病率高达50%以上，病 死率高达15% 20%左右，由腹泻和水肿引起的仔猪死亡数占仔猪死亡总数39. 8%。(何维 明等，2001 ；单玉平，2005)。产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是初生仔猪和断奶仔猪腹泻和水 肿病最常见和最重要的病原菌，是养猪业中的重要威胁因素(Boldin B，2008)。尽管当前 对仔猪腹泻和水肿病的一些预防性措施(如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚 单位疫苗接种等)，在一定程度上减少了该病的发生，但并没有从根本上消除断奶仔猪腹泻 和水肿病的发生与流行，从长远发展考虑，寻求一种全新的预防与控制策略，采用遗传学方 法，培育出抗病新品种(品系)，从遗传素质上永久性地提高仔猪对大肠杆菌病的抵抗能力， 是现代育种学家共同追求的目标。ETEC定居在小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的宿主特异性肠吸附菌毛介导的， 这种特异性菌毛通称定居因子抗原或黏附素，确切地说，黏附素存在于菌毛顶端。ETEC中的 大肠杆菌FlSab和FlSac菌毛在猪体内、外均可黏附小肠上皮细胞微绒毛和刷状缘，产F18 菌毛的大肠杆菌可利用F18菌毛介导的细菌在肠道内定居而大量繁殖，产生肠毒素和志贺 氏样毒素，从而出现腹泻、水肿和神经症状。F18大肠杆菌是目前在养猪业中发生最普遍、危 害最大的大肠杆菌病原之一(Van den Broeck W, et al. 2000)。鉴于ETEC F18是引起断 奶仔猪腹泻的主要病原菌之一，而ETEC F18受体基因又是决定病原菌配体分子特异结合吸 附到宿主组织细胞上的功能基因，ETEC F18受体基因的突变会引起其编码的菌毛受体蛋白 结构和功能的改变或丧失，从而使病原菌和配体分子不能结合上去，表现对病原菌的遗传 抗性。因此，对ETEC F18受体基因等抗性相关基因的筛选及功能的深入研究将成为抗病育 种的重要基础储备。杀菌通透个生±曾强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI )是人和哺乳动物的内源性阳离子蛋白质，主要存在于多形核白细胞(Ploymorphneclear leukocytes, PMNs)的嗜苯胺蓝颗粒中。BPI除了能杀灭G-菌，中和内毒素或脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)的活性外，还有调理功能、促进补体活化，增强吞噬的调理功 能、抑制血管生成、抑制炎性介质释放、抗真菌和原虫等一系列生物学功能，在动物机体天 然防御中起到了很重要的作用。国内外关于猪BPI基因的多态性及其对疾病的抗性/易感性相关的研究鲜见报道，在美国专利网中有一段关于猪BPI基因的序列，长1 452 bp，没有清楚的注释， 现将其命名为专利 BPI 序列(United States, Kind Code: Al, Patent Application: 20040234980)。在此专利的公开信息中，Christopher等在约克、汉普夏、杜洛克、长白、大 白、野猪和眉山猪中，检测到BPI基因外显子4和10分别存在Jva II和II酶切多态性， 通过攻毒试验表明其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关，并把BPI基因确立为抗病育种候 选基因。肠毒素性大肠杆菌为猪肠道中主要的革兰氏阴性菌，本发明利用课题组前期在苏 太猪群体中建立了 F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体以及大白猪作为试验材料， 利用PCR-RFLP技术分析BPI基因第10外显子Hpa II多态性，通过仔猪小肠上皮细胞分别 与表达FlSab菌毛的野生型大肠杆菌、表达FlSac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆 菌及表面分泌表达FlSab菌毛!^edF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附试验，分析BPI基 因第10外显子///7a II多态性F18大肠杆菌感染间的关系，探讨猪BPI基因对肠毒素性大 肠杆菌F18(ECF18)菌株的作用机理，发现本发明BPI基因外显子IWpa II酶切位点的遗 传标记与肠毒素性大肠杆菌菌株的抗性有关。
发明内容
本发明是用BPI基因外显子\Mpei II酶切位点作为猪肠毒素性大肠杆菌菌株抗 性的分子标记及其检测方法与应用，检测该分子标记的方法包括待测样品的猪基因组DNA 的提取及其PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶Hpa II的酶切，当待测猪个体基因型为AA 型045 bp)，则为抗大肠杆菌病个体。本发明为从遗传素质上永久性地提高仔猪对大肠杆 菌病的抵抗能力提供了有效的分子标记。本发明的优点
1)本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确、简便易行 的分子遗传标记，为提高仔猪对大肠杆菌病的抵抗能力提供了一种有效的分子标记育种手 段。用该遗传标记对猪的大肠杆菌抗性进行标记辅助选择，可有效地缓解实际生产中的仔 猪腹泻和水肿病问题，提高经济效益，并为加速改善仔猪抗病能力的分子育种奠定了基础， 将加快育种进程。2)本发明的检测方法操作简单，费用较为低廉，准确度高，并可实现自动化的直接 检测，本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。所述的杀菌通透性增强蛋白(BPI )基因作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记及应 用包括
1.猪基因组DNA的提取
2.猪BPI基因第10外显子的引物设计和PCR扩增
3.PCR- RFLP 分析
4.仔猪小肠上皮细胞的黏附试验确定个体大肠杆菌F18菌株抗性/易感性
5.BPI基因第10外显子Hpa II多态性与F18大肠杆菌抗性间的关系分析，确定抗性 遗传标记。
图1为BPI基因第10外显子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为BPI基因第10外显子酶切后3种基因型的聚丙烯酰胺凝胶电泳图， 其中 M 为 pUC19 mk/Msp I Qbp II ) marker，第 2、6、8、11、12 泳道为 AA 基因型；第
4、10泳道为BB基因型，第1、3、5、7、10泳道为AB基因型。图3为断奶仔猪小肠上皮细胞黏附能力的照片
A 标准菌株107/86 ；B :rE. colil534 ；C :pnirBMisL-fedF (照片均使用油镜镜头，以 1000倍放大比例拍摄)。图4为断奶仔猪小肠上皮细胞黏附能力丧失的照片
A 标准菌株107/86 ；B :rE. colil534 ；C :pnirBMisL-fedF (照片均使用油镜镜头，以 1000倍放大比例拍摄)。
具体实施例方式本发明中所涉及的生物材料，由申请人实验室构建和保存的，均自申请日起向公 众提供20年。一、利用BPI基因第10外显子汉识II酶切位点标记对苏太猪和大白猪核心群全面 检测基因型。每个个体采耳组织块约1. 0 g,放入1. 5 mL的Eppendoff管内于冰盒中取回扬州 大学动物遗传育种与繁殖重点学科实验室备用。按常规酚-氯仿法提取DNA。提取的DNA 用核酸蛋白测定仪测定其含量和纯度，-20 °C保存备用。根据已公布的猪专利BPI基因序 列并参考人(Genebank 登录号NM_ 001725 )、牛(Genebank 登录号NM_ 173895)BPI 基因 序列的注释，设计引物扩增BPI基因第10外显子，上游引物为5' -CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3' (SEQ ID NO. 1)，下游引物为5'-CAATGAATCAATGAGCACACC -3' (SEQ ID NO. 2), PCR 产物大小为44^p (图1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，7 ^ DNA polymerase、dNTP购自大连宝生物公司。PCR 反应体系为10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ L,2. 5 mmol/L dNTP 1. 5 μ L, 10 μ mol/ L 弓丨物(上游)1 μ L，10 μ mol/L 引物(下游)1 μ L，T^ 酶(5 U/μ L) 0. 2 μ L，100 ng/ μ L DNA模板1 μ L，ddH20 17. 8 μ L，总体积25 μ L。PCR扩增程序为94 °C预变性4 min ；94 "C 变性 30 s，57°C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，32 个循环；72 "C 延伸 7 min ；4°C保存。酶切反应体系为10 μ L，包括PCR产物3 μ L，限制性内切酶汉识II (5 U/ μ L) 0. 2 μ L, IOXbuffer 1 μ L，ddH20 5. 8 μ L，置 37°C恒温反应 3 h 后，经 10% 的聚丙烯酰胺 凝胶电泳银染分析，BPI基因第10外显子经限制性内切酶/fe/7 II消化后能被完全酶切，产生 AA 型(445 bp)，BB 型(304bp /142bp)，AB 型(445 bp/304 bp/142 bp) 3 种条带(图 2)。二、仔猪小肠上皮细胞的黏附试验确定个体大肠杆菌F18菌株抗性/易感性。1)仔猪小肠上皮细胞的制备
在仔猪断奶前后，也是最易感染大肠杆菌F18菌株而表现出腹泻症状的35日龄阶段屠 宰取十二指肠、空肠肠段15cm用于小肠上皮细胞的制备。将仔猪剖杀后，各取十二指肠、空 肠肠段15cm立即放入预冷的PBR溶液中，每段肠管用PBR溶液轻柔冲洗三遍后，再用30ml预冷IPBR冲洗一遍，将肠道外翻后短暂地在IPBR溶液中清洗一下，然后转移到盛有200ml IPBR溶液的烧杯中，于室温下以lOOr/min的速度勻速搅拌lOmin。弃肠段，将烧杯中液体 转移至离心管，在0°C下，200g，离心lOmin。沉淀重新悬浮在PBR溶液中轻轻洗涤一次，再 次离心，用预冷的MEM重新悬浮沉淀的细胞，将细胞浓度调整到IO6— IO7个细胞/mL。2)细菌的准备
产FlSab菌毛标准菌株107/86 (0139:K12:H1)由美国宾夕法尼亚大学兽医学院微生 物实验室惠赠。能诱导表达FlSac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠菌rE. colil534 由本实验室构建并保存(吴圣龙，原志伟，鞠慧萍，黄雪根，华金弟，沈家林，周冠月，王建业， 谢恺舟，陈国宏，朱国强.苏太仔猪FUTl基因M307位点多态性与大肠杆菌F18抗病相关 性的体外鉴定.中国预防兽医学报，2007, 29(10): 783 - 787.)，能表面分泌表达FlSab 菌毛!^edF亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF也由本实验室构建(吴圣龙，原志伟，鞠 慧萍，黄雪根，华金弟，沈家林，周冠月，王建业，谢恺舟，陈国宏，朱国强.苏太仔猪FUTl基 因M307位点多态性与大肠杆菌F18抗病相关性的体外鉴定.中国预防兽医学报，2007， 29(10) 783 - 787.)。将107/86标准株大肠杆菌的单个菌落分别接种到3 5ml LB培养基，37°C振荡培 养过夜(16 18h)，次日将细菌用PBS反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约IX 109CFU/ml。将重组菌rE. colil534的单个菌落首先接种于含lOOPg/ml氨苄青霉素的3飞ml LB培养基，37°C振荡培养过夜，次日取出50μ1再接种于5ml含lOOPg/ml氨苄青霉素的LB 培养基，37°C振荡培养约2h，使细菌处于大约对数生长中期，OD600=O. 5-0. 7时，加入诱导剂 100mmol/L IPTG至终浓度为0. 2mmol/L，37°C继续培养汕后终止诱导，然后将细菌用PBS 反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约1 X 109CFU/ml。将重组菌pnirBMisL-fedF的单个菌落接种于含lOOPg/ml氨苄青霉素的5ml LB 培养基，于37°C首先在有氧的环境中振荡培养过夜，再置于厌氧罐中诱导表达6h，然后将 细菌用PBS反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约IX 109CFU/ml。上述培养的野生型大肠杆菌及诱导表达后的重组菌与相应单克隆抗体或抗血清 作玻板凝集试验，在确认凝集试验阳性，而阴性对照不凝集后，将上述细菌用于黏附试验。3)仔猪小肠上皮细胞的黏附试验
分别取上述野生菌或诱导表达的重组菌菌液0. 5ml，在其中添加终浓度为1%甘露糖于 37°C作用30min后和0. 5ml小肠上皮细胞混合，再于37°C孵育30min，1000r/min离心5min， 用PBR溶液悬浮后取50μ1滴于洁净玻片上，自然干燥，火焰固定，用美兰染色3-5min，油镜 观察结果。4)抗性型和敏感型的判定
断奶仔猪的小肠上皮细胞如均能与表达FlSab菌毛标准菌株107/86、诱导表达的重组 大肠杆菌rE. colil534及诱导表达的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF发生黏附作用(图3)， 将其定义为大肠杆菌F18菌株敏感型；而如果仔猪小肠上皮细胞对上述3株大肠杆菌的黏 附能力几乎为零(图4)，则将其定义为抗性型。三、BPI基因第10外显子II多态性及其与F18大肠杆菌感染间的关系分析 及抗性标记的确定
对BPI基因第10外显子///7a II的3种基因型个体大肠杆菌F18菌株抗性/易感性进行分析，3种基因型个体大肠杆菌F18菌株抗性/易感性的频率见表1 ；对抗性/易感性的 频率进行独立性χ 2检验，结果见表2，由表2，3可见，AA基因型中大肠杆菌F18菌株抗性型 个体的频率为90%，显著或极显著地高于AB基因型(57. 1%)和BB基因型(17. 4%)的个体。 可以将BPI基因第10外显子II AA基因型确定为抗大肠杆菌的分子遗传标记。
表1 BPI基因第10外显子Hpa 113种基因型个体大肠杆菌F18菌株抗性/
易感性的频率表
权利要求
1.杀菌通透性增强蛋白基因第10外显子作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于具体包括以下步骤(1)提取待测样本的组织DNA，备用；(2)PCR扩增以步骤(1)的DNA为模板，用下述引物进行PCR扩增，上游弓I 物为5'-CCCAACATGGAGATGCAGTTC _3'，下游弓| 物为 5'-CAATGAATCAATGAGCACACC -3'；(3 )PCR扩增产物用限制性内切酶/fe/7 #酶切后经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析，只出 现445 bp条带的样本为猪大肠杆菌病抗性。
全文摘要
本发明涉及筛选一种猪大肠杆菌病抗性BPI基因第10外显子HpaII多态位点的遗传标记。本发明是用BPI基因外显子10HpaII酶切位点作为猪肠毒素性大肠杆菌菌株抗性的分子标记及其检测方法与应用，检测该分子标记的方法包括待测样品的猪基因组DNA的提取及其PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶HpaII的酶切，当待测猪个体基因型为AA型(445bp)，则为抗大肠杆菌病个体。本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确、简便易行的分子遗传标记，可有效地缓解实际生产中的仔猪腹泻和水肿病问题，提高经济效益，加快育种进程。本发明的检测方法操作简单，费用较为低廉，准确度高。
文档编号C12N15/65GK102071252SQ201010578028
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者侯小亮, 刘璐, 包文斌, 华金第, 叶兰, 吴圣龙, 孙寿永, 曹永忠, 朱国强, 朱璟, 潘章源, 訾臣, 黄小国, 黄雪根 申请人:扬州大学