检测粪便中microRNA表达水平的方法和内参基因的选择方法

专利名称：检测粪便中microRNA表达水平的方法和内参基因的选择方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种检测粪便中microRNA表达水平的 方法和内参基因的选择方法。
背景技术：
microRNA (miRNA)分子是近几年来分子生物学和遗传学领域的研究热点。miRNA 是一类新发现的非编码小RNA分子，通常在转录后水平调控基因表达。miRNA基因先转录产 生几百至几千个核苷酸的初级产物(pri-miRNA)，在核内被RNaseIII内切酶家族的Drosha 酶切割成70个核苷酸左右的发夹状前体(pre-miRNA)，pre-miRNA在转运蛋Exortin = 5 的作用下转运出核，然后经Dicer酶切割成约22nt的成熟miRNA (Gregory RI，Shlekhattar R. MicroRNA biogenesisand cancer. Cancer Res, 2005,65 (9) :3509-3512.)。成熟的miRNA 通过形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，与靶mRNA完全或 不完全匹配结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译，从而调节细胞增殖、分化与凋亡， 参与个体发育、机体代谢以及肿瘤发生、发展等过程。以往的研究发现蛋白编码基因的异常会导致肿瘤的发生发展，自2002年11月 Croce研究组首次报道miRNA异常与肿瘤相关，越来越多的证据显示miRNA在肿瘤的发生 发展中起着重要的作用。有一些实验和临床分析指出miRNAs可能是作为癌基因或抑癌 基因的一个新的分类而发挥作用。那些在肿瘤中表达升高的可认为是癌基因，这些癌基 因miRNAs，通常通过负向调节肿瘤抑制基因或控制细胞分化或凋亡的基因而促进肿瘤的发 展。已发现有许多miRNAs在不同肿瘤中明显过表达。目前检测mi croRNA表达水平的方法主要包括mi croarray、RT-PCR/Northern blot>Ribonulease protection assay (RPA)、Bead_based flow cytometric assay (磁珠流 式检测)、原位杂交等。由于miRNA序列很短，增加了检测难度。本研究所用的St印-loop 实时定量RT-PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎 环(stem-loop)结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 2个 关键步骤° Shi (Shi R, ChiangVL. Facile means for quantifying microRNA expression by real time PCR[J]. Biotechniques, 2005, 39 (4) :519-525 等把 RNA 加尾和引物延伸用 于实时定量RT-PCR，成功检测了植物中miRNA表达。张旗(张旗，何湘君，潘秀英.RNA加尾 和引物延伸RT-PCR法实时定量检测microRNALJ].北京大学学报，2007，39 (1) :87-91)等 用同样的方法对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的表达进行检测，验证了该技术的可 靠性。目前粪便中基因检测由于其广泛应用前景，已引起人们重视，，但其所用检测方法 不同，相互间可比性较差。因此需要一方面寻找新的分子标志物，另一方面改进检测方法和 技术，提高检测敏感性，可为无创性胰腺癌筛查和诊断提供新的选择。基于上述研究表明，有关microRNA的研究大多局限于血液病，肺癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌，对胰腺癌的研究甚少，在胰腺癌的研究中也仅仅限于组织、血液等样本，并 未曾报道在粪便中的microRNA检测。放之四海而皆准的看家基因其实是不存在的，找出合 适的看家基因作为内参对于基因表达分析的准确定量至关重要，目前大多通过使用geNorm 程序，从一系列不同功能的候选看家基因中选择出最适数目的看家基因用于目标基因的标 准化，从而可以达到准确定量的实验目的.

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测粪便中microRNA表达水平的方法，该 方法通过选择合适内参的内参基因，制定一种计算方法呈现不同microRNA在粪便中的差 异表达。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现一种检测粪便中microRNA表达水平的方法，主要包括以下步骤(1)将收集的粪便标本用粪便抽提试剂盒进行提取，提取后用NanoDrop鉴定RNA 的浓度；(2)将鉴定好的RNA进行逆转录生成cDNA，通过Real-time RT-PCR检测目的 microRNA的表达；(3)通过Real Time PCR得到各个microRNA的CT值，再通过-Δ Δ Ct方法计算各 microRNA 的表达丰度，计算公式为-Δ ACt = - {(Sample Cttarget-Sample CtmiR-16)-(C ontroICttarget-Contro1 CtmiR-16)}；(4)选取内参基因，挑选出目的差异基因。本发明的另一需要解决的技术问题是提供一种用于检测胰腺癌的内参基因的选 择方法。解决上述技术问题的技术方案如下一种用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，主要包括以下步骤(1)将收集的胰腺癌患者的粪便标本用粪便抽提试剂盒进行提取，提取后用 NanoDrop鉴定RNA的浓度；(2)将鉴定好的RNA进行逆转录生成cDNA，通过Real-time RT-PCR检测目的 microRNA的表达；(3)得到各个microRNA的CT值，再通过-Δ Δ Ct方法计算各microRNA的表达丰
度，计算公式为-Δ Δ Ct = ~ (Cttarget microENAs~CtmiE_16)；(4)选取合适的内参基因。本发明通过实时定量方法检测粪便中microRNA表达水平，发现粪便中抽提 RNA(包括microRNA)方法稳定可靠，可以用于实时定量检测。实时定量的检测结果通过数 据输入Genorm软件，选取稳定表达的内参基因，最终通过-Δ Δ Ct方法，挑选出目的差异基 因。本发明所述的检测粪便中microRNA表达水平的方法可克服现有的方法操作不稳 定的缺点，从而可用于简单、稳定地粪便中检测到microRNAs的表达及差异，所得结果稳定
可靠，可重复性高。本发明所述的一种用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，从粪便中抽提总microRNAs，然后经过实时定量PCR方法检测，筛选获得内参miRNA16，其适宜胰腺疾病患者 相关粪便microRNA相对含量的检测。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图IA是本发明实施例ltotal RNA抽提可重复性比较结果示意图，图IB是实施例1部分样本microRNA检测可重复性结果示意图；图2是本发明胰腺癌内参基因的选择；图3是本发明实施例1中差异表达的microRNAs图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行。实施例1现以胰腺癌患者粪便microRNAs的检测为例，对发明做详细描述。该实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。选取长海医院2008年至2010年收住的四例胰腺癌，22例慢性胰腺炎患者，并收 集本实验室健康对照13例。1、标本收集于冻存管后即时置于冰盒中，在6小时内转移至-80°C的超低温冰箱 保存。粪便的RNA抽提时需从冻存管中称取200mg粪便，总RNA(其中包括microRNA)的抽 提通过Ε. Ζ. N. A粪便抽提试剂盒(美国，OMEGA公司)提取总microRNAs，具体步骤
如下
称取200mg粪便样本至装有200mg玻璃珠子的2ml离心管
I
权利要求
1.一种检测粪便中microRNA表达水平的方法，其特征在于，主要包括以下步骤(1)将收集的粪便标本用粪便抽提试剂盒进行提取，提取后用NanoDrop鉴定RNA的浓度；(2)将鉴定好的RNA进行逆转录生成cDNA，通过Real-timeRT-PCR检测目的microRNA 的表达；(3)得到各个microRNA的CT值，再通过-ΔΔ Ct方法计算各microRNA的表 达丰度，计算公式为- AACt = - {(Sample Cttarget-Sample CtmiR-16) - (Control Cttarget-ControlCtmiR-16)}；(4)选取合适的内参基因，挑选出目的差异基因。
2.根据权利要求1所述的检测粪便中microRNA表达水平的方法，其特征在于，所述粪 便抽提试剂盒抽提取总microRNAs。
3.根据权利要求1所述的检测粪便中microRNA表达水平的方法，其特征在于，用 Genorm软件选择合适的内参基因。
4.一种用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，其特征在于，主要包括以下步骤(1)将收集的胰腺癌患者的粪便标本用粪便抽提试剂盒进行提取，提取后用NanoDrop 鉴定RNA的浓度；(2)将鉴定好的RNA进行逆转录生成cDNA，通过Real-timeRT-PCR检测目的microRNA 的表达；(3)得到各个microRNA的CT值，再通过-ΔΔ Ct方法计算各microRNA的表达丰度，计算公式为 _Δ Δ Ct 一 ~ (Cttarget microENAs_CtmiE_16)；(4)选取合适的内参基因。
5.根据权利要求4所述的用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，其特征在于，步骤 (1)为标本收集于冻存管后即时置于冰盒中，在6小时内转移至-80°C的超低温冰箱保存； 粪便的RNA抽提时需从冻存管中称取粪便，用粪便抽提试剂盒提取到总microRNAs，提取后 用NanoDrop鉴定RNA的浓度。
6.根据权利要求4所述的用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，其特征在于，用 Genorm软件选择合适的内参基因在Excel中设定不同样本中某一看家基因Ct值最小者 的表达量为1，其他样本与上述看家基因的相对表达量则为，其中，ACt =各样本Ct 值-最小Ct值；将得到的相对表达量数据导入Genorm程序；利用该程序计算基因表达稳定 度的平均值，对看家基因的表达稳定度进行排序，值越小，表达越稳定，并通过看家基因标 准化因子的配对差异分析来判定看家基因的最适数目。
7.根据权利要求4-6任一项所述的用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法，其特征在 于，所述内参基因为miR-16。
全文摘要
本发明公开了一种检测粪便中microRNA表达水平的方法，该方法主要包括以下步骤将收集的粪便标本用粪便抽提试剂盒进行提取，用NanoDrop鉴定RNA的浓度；逆转录生成cDNA，通过Real-time RT-PCR检测目的microRNA的表达；通过Real Time PCR得到各个microRNA的CT值，再通过-ΔΔCt方法计算各microRNA的表达丰度，选取内参基因。本发明还提供了一种用于检测胰腺癌的内参基因的选择方法。本发明提供的检测方法结果可靠，稳定性好。
文档编号C12Q1/68GK102071253SQ20101057942
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者任艳, 刘建强, 李兆申, 王小玮, 顾骏俊, 高军 申请人:中国人民解放军第二军医大学