一种种子特异型表达载体及其构建方法与应用的制作方法

专利名称：一种种子特异型表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种种子特异型表达载体及其构建方法与应用，特别是涉及一种种子 特异型表达载体及其构建方法和利用该载体在油葵中制备阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的 方法。
背景技术：
心血管疾病是全球范围导致人类死亡最主要的原因，预计到2015年，约有2000万 人死于心血管疾病。诸多的心血管疾病(如心肌梗塞和中风)为动脉粥样硬化的主要合并 症。动脉粥样硬化的发病机制目前尚不完全清楚，血脂代谢异常是造成该疾病的主要危险 因素之一，其中高水平的低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)和低水平的高 密度脂蛋白(highdensity lipoproteins, HDL)是两个最重要的危险因素。传统的治疗策 略是降低血浆中总胆固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteins cholesterol,LDL-C)的含量，他汀类是目前首选的降脂药物，但该类药物不 能清除已沉积在动脉壁上的斑块，也不能达到根本治疗动脉粥样硬化症的目的。各国学者 越来越多地把目光转向另一个危险因素-低水平的高密度脂蛋白，流行病学研究表明血 浆中高密度脂蛋白的水平与冠心病的发病率成负相关，认为高密度脂蛋白能起到防止动脉 粥样硬化形成的作用。通过提升高密度脂蛋白的水平来治疗动脉粥样硬化症-这是世界医 药行业正在浮现的一种新的针对急性冠状动脉粥样硬化疾病治疗的新方法，被称为高密度 脂蛋白靶向治疗。阿朴脂蛋白A-KapolipoproteinA-LapoA-I)是高密度脂蛋白主要的蛋 白成分。阿朴脂蛋白A-I在肝脏和小肠内合成，其原始翻译产物是含有267个氨基酸残基 的前原蛋白形式(preproapoA-I)。前原蛋白被信号肽酶加工切除18肽前片段转变成原阿 朴脂蛋白形式(ProapoA-I)，原阿朴脂蛋白分泌出胞外后，在细胞外特异性转化酶作用下切 除6肽原片段(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln)，转变成血浆成熟阿朴脂蛋白A-I。阿朴脂蛋白 A-I的作用机理主要是促进胆固醇的外溢、抗氧化和抗血小板聚合等。阿朴脂蛋白A-I米兰突变体(apolipoproteinA-IM，apoA-IM)是阿朴脂蛋白A-I 的自然突变体(Argl73--Cys)，与阿朴脂蛋白A-I相比，173位精氨酸的丢失导致其α螺 旋含量降低，加大了与脂质结合的能力。阿朴脂蛋白A-I米兰突变体易形成二聚体(Α-ΙΜ/ Α-ΙΜ)，此二聚体激发胆固醇逆向转运的效率要比阿朴脂蛋白A-I高，从而更高效地加速胆 固醇的排出；同时阿朴脂蛋白A-I米兰突变体比阿朴脂蛋白A-I能更好地削弱低密度脂蛋 白的氧化。目前，阿朴脂蛋白A-I米兰突变体是世界上唯一被证实的能够清除已经沉积在 动脉壁上血栓的药用蛋白，具有十分广阔的应用前景。最近《美国医学会杂志》报道阿朴脂蛋白A-I米兰突变体对动脉粥样病变改变的 速度和幅度前所未有，并且几乎没有副作用，应用前景十分广阔，已成为世界医药研发领域 工作的重点和竞争的焦点。全球最大的医药公司辉瑞(Pfizer)预测任何能够逆转冠状动 脉斑块的药物都有可能取得10亿美元的销售业绩，所以阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的开发 必然可以带来巨大的经济效益和社会效益，同时也会增强我国在心血管疾病和动脉粥样硬化疾病药物开发领域的世界影响力。此外，基于小样本临床结果显示阿朴脂蛋白A-I的临床需要量是每个疗程 5_6g，阿朴脂蛋白A-I的高治疗剂量以及动脉粥样硬化的高患病率均预示了一个强大的 市场需求，这也为阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的开发提供了一个契机。目前，美国爱普隆 (Esperion)公司生产实验试剂用途的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，但其采用的是生物合成 的方法，生产的成本高，产量小，不适合规模化生产。细菌系统内蛋白质的重组体表达一般 具有吸引力，但是此方法产率低，并且大肠杆菌内毒素与阿朴脂蛋白A-I米兰突变体易形 成强的复合体，蛋白纯化方法昂贵且安全性较差。因此，开发高产、高效生产阿朴脂蛋白A-I 米兰突变体的方法势在必行。植物生物反应器(plant bioreactor)也被称为分子药田(Molecular medicine farming)是指利用植物生物系统大规模生产具有重要应用和商业价值的外源蛋白质，特别 是用于医疗和诊断的药用蛋白。1989年哺乳动物抗体在转基因植物中首次获得成功表达， 其重链和轻链在转基因烟草中表达并正确组装，首次证实了植物作为生物反应器的可行 性。此后，转基因植物研究逐渐兴起。许多其它的药用蛋白陆续在各种不同的植物中实现 了表达，如水蛭素、干扰素、人血清蛋白、功能抗体，已用于植物生物反应器研究的植物有 烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯和番茄等。目前，加拿大针对代谢及心血管疾病研制蛋白质药物组合的生物科技公司 SemBioSysGenetics公司在中国申请了转基因红花和拟南芥生产阿朴脂蛋白A-I和阿朴脂 蛋白A-I米兰突变体方法的专利(CN1906^6A)，把嵌合核酸构建体导入拟南芥或红花中， 结籽后在种子中表达阿朴脂蛋白A-I及阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。拟南芥是一年生或 两年生草本植物，其基因组是目前已知植物基因组中最小的，并且因为其基因高度纯合，用 理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型，成为了遗传学研究的好材料， 被科学家誉为“植物中的果蝇”。但是，拟南芥目前广泛被用于实验途径，并未有大规模的 普遍种植形成。红花属一年生草本植物，种子可以榨油，是一种重要的油料作物，分布在温 带，我国多产于西北，尤以新疆、西藏为多，其次是华北和东北地区。但红花亩产量比较低 (120-150kg)，瘦果含油率不是很高(34 55% )，导致最终产物蛋白的量少，成本较高。因此，现有技术仍然需要一种方法稳定、产率高、成本低、步骤简单的制备阿朴脂 蛋白A-I和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的方法。

发明内容
本发明的申请人通过长期研究，付出大量的创造性劳动，通过构建一种特异型的 表达载体，并选择油葵作为生物反应器，稳定、高效地生产出阿朴脂蛋白A-I和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体，从而完成了本发明。本发明涉及以重组DNA技术生产阿朴脂蛋白A-I或阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的 方法，特别涉及以油葵作为宿主生产阿朴脂蛋白A-I或阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的方法。 具体的说，本发明涉及利用花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I或阿朴脂蛋白A-I米兰突变体 的融合蛋白基因在油葵油体中表达从而可以大量生产制备治疗动脉粥样硬化极其所造成 的心血管疾病的重要药物阿朴脂蛋白A-I和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，优选制备阿朴脂 蛋白A-I米兰突变体。
首先，本发明提供了一种种子特异型表达载体，含有阿朴脂蛋白A-I米兰突变体 与花生油体蛋白融合基因或含有阿朴脂蛋白A-I与花生油体蛋白融合基因，优选含有阿朴 脂蛋白A-I米兰突变体与花生油体蛋白融合基因，其中，该载体的启动子为油菜油体蛋白 基因启动子。以上载体用以在油葵中制备阿朴脂蛋白A-I或阿朴脂蛋白A-I米兰突变体， 优选阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。另外，本发明还提供了一种构建上述高效种子特异型表达载体的方法，包括如下 步骤1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因；2)按照植物偏爱的密码子设计合成阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋 白A-I基因；3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体或阿朴脂蛋白A-I基因融合表达的植物表达载体。具体步骤包括1)躺雄舊舰口靴舰舰用PCR方法自油菜 (Brassica campestris)基因组DNA中扩增20kD油体蛋白基因的启动子，并将该启动子克 隆到pUC19 (购自MBI公司)上得到重组质粒pUCN，以花生基因组DNA为模板PCR方法扩增 终止密码子缺失的花生油体蛋白基因。其中，油菜品种可以是目前现有技术中已经公开或 使用的油菜品种，例如，可以是青油14品种、互丰101、耐寒高油王、早油100天和秦油2号 等，优选青油14品种。以上油菜油体蛋白启动子可以克隆到PUC19的适合位点之间，优选 克隆到pUC19的HindIII和BamHI位点之间。所述的花生品种可以是目前现有技术中已经 公开或使用的花生品种，例如，可以是冀花4号、冀油7号、白沙、鲁花11、海花和丰花1号 等，优选冀花4号。2)勿偏爱的密石马子设i十合成阿朴)^ 白A-I或阿朴)^ 白A-I米兰突变 体基因桉照油葵密码子使用频率优化阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I基因， 优选优化的基因为阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因。频率小于10%的密码子一律认为 是稀有密码子被排除，其余的各密码子按油葵密码子使用频率优化，优化前基因的分子量 为451. 4，优化前后序列的一致性为大于60%，优选大于65%，最优选为72%，优化后基因 的分子量优选为451. 3。油葵密码子使用频率可参考http://VWW. kazusa. or. jp/codon/ cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 42323)丰射聿似油菜油体蛋白基因启云力子gR云力的花牛油体蛋白与阿朴)^ 白A-I米兰 突变体基因或阿朴脂蛋白A-I基因融合表汰的棺物表汰载体利用重眷PCR技术将花生油体 蛋白基因和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白A-I基因构建成融合基因，优选 将花生油体蛋白基因和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因构建成融合基因01e/apOA-IM，将 该融合基因连入PUCN得到重组质粒pUCNOA，优选连入的位点为pUCN的BamHI和^icI酶 切位点之间，双酶切重组质粒pUCNOA，优选HindIII和Sac工双酶切重组质粒pUCNOA，回收 2202bp的外源片段，并将该外源片段连入植物表达载体pBI 121 (植物转基因工程中常用的 植物双元表达载体)的HindIII和McI位点之间获得pBINOA，即油菜油体蛋白基因启动子 驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I米兰突变体融合基因的植物表达载体或油菜油体 蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I融合基因的植物表达载体。
最后，本发明还提供了利用以上种子特异型植物表达载体制备阿朴脂蛋白A-I米 兰突变体或阿朴脂蛋白A-I的方法，包括如下步骤1)将上述构建表达载体导入受体植物外植体内；2)将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子；3)从上述种子中分离纯化得到阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I0其中，所述的受体植物优选为油葵，优选分离纯化得到的是阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体。具体步骤包括1)将携带阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白A-I基因的种子特异型植 物表达载体导入油葵恢复系外植体。将种子特异型植物表达载体导入油葵恢复系的方法可 以是本领域常规的导入方法，包括但不限于基因枪法、花粉管通道法、子房注射法和农杆 菌介导法，优选的是农杆菌介导法。农杆菌介导法中，将携带阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基 因或阿朴脂蛋白A-I基因的种子特异型植物表达载体导入农杆菌，由农杆菌介导转化油葵 恢复系外植体。所述外植体包括无菌苗茎尖、子叶、子叶节、去掉一片子叶的实生株四种形 式，其中优选去掉一片子叶的实生株；2)转基因后获得的再生植株经抗性筛选得到抗性苗，待抗性苗生根后移栽入温室 进行培养，直至成熟收获种子。其中，抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和营养土混合物培 养，在幼苗期进行PCR检测和Southern blotting检测，收获籽粒后进行油体蛋白和阿朴脂 蛋白A-I米兰突变体融合蛋白的Wfestern blotting检测；3)将含阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I的种子在缓冲液中研磨，离 心将油体和种子的其他成分分离，洗涤油体，通过酶切反应将阿朴脂蛋白A-I米兰突变体 或阿朴脂蛋白A-I自油体表面释放，经HPLC纯化获得阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，并对其 进行鉴定。在本发明的载体和方法中，选择了油菜油体蛋白基因启动子。经实验研究表明， 该启动子可大大提高阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因的表达效率。优选地，在油体蛋白基 因起始密码子周围还可以设计Kozak序列表达控制元件，可以更加进一步提高基因表达效率。在本发明的载体和方法中，还选择了油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿 朴脂蛋白A-I的融合表达。目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式与油体蛋白共同 在油体中特异表达，利用油体亲脂疏水的特性，将转基因植物种子粉碎，液体抽提，离心处 理，回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开，可去除90%以上的种子蛋白。优 选地，在油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I之间设计了凝血酶识别 位点，用以从油体上释放阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，简化了表达产物的纯化工艺，提高了 纯化效率。其中，优选的油体蛋白为花生油体蛋白。花生油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体或阿朴脂蛋白A-I的融合表达，表达效率高，效果好。在本发明公开的载体和方法中，为了提高阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因或阿朴 脂蛋白A-I基因的表达效率，根据阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因序列或阿朴脂蛋白A-I 基因序列和油葵偏爱的密码子、GC含量对阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I基因的密码子进行了优化和全基因的人工合成。
在本发明公开的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I的生产方法中，优 选的植物生物反应器为油葵。油葵作为我国一种重要的油料作物，在我国具有悠久的种植 历史，具有其它作物不可替代的优势。油葵产量高，作为耐旱作物，可以在盐碱地、干旱地区 甚至沙漠等恶劣环境下种植，因此适于大面积推广种植，不仅不会与粮食“争地”，而且还 有利于提高我国山岭薄地、干旱贫瘠之地的利用率，缓解国家耕地紧张的压力。因此，选择 油葵作为生物反应器，大规模地生产阿朴脂蛋白A-I米兰突变体是适合我国国情的生产药 用蛋白的方式。最有优势的是，采用油葵作为生物反应器，与目前已作为阿朴脂蛋白A-I米 兰突变体或阿朴脂蛋白A-I生产反应器的红花相比，具有显著的生产效率提高，产率增加 的效果。采用此发明方法生产人阿朴脂蛋白A-I米兰突变体具有以下优点1、植物表达的外源蛋白，类似于哺乳动物表达的蛋白，能进行正确的折叠，这对于 必须具有体内活性的药用蛋白的生产尤为重要。2、采用植物生物反应器生产的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体更安全，因为避免了大 肠杆菌中的内毒素和动物病原菌的的污染。3、利用转基因植物的油体表达系统表达阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，大大简化了 纯化工艺，降低了成本，有利于将来的产业化。较之已经被kmBioSys Genetics公司采用 的拟南芥以及红花具有很大的优势。4、采用本发明的种子特异型植物表达载体和制备方法，大大提高了阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I的表达量，能达到种子总蛋白含量的1. 5%。5、采用农杆菌介导法转化植物，不仅可以降低成本、提高转化效率，还提高了转基 因植株的遗传稳定性。本发明是利用转基因技术开发高效表达的植物生物反应器，所生产阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I是治疗心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的特效药物。术语及解释除有特殊说明，在本发明中出现术语均具有本领域通常的含义，其中的缩写代表 的内容如下LDL:low density lipoproteins,低密度月旨蛋白HDL :high density lipoproteins,高密度月旨蛋白TC :total cholesterol，血浆中总胆固醇LDL-C:low density lipoproteins cholesterol，低密度月旨蛋白胆固醇apoA-I :apolipoprotein A-I 阿朴月旨蛋白 A-IapoA-IM :apolipoprotein A-I Milano 阿朴脂蛋白 A-I 米兰突变体A-IM/A-IM 阿朴脂蛋白A-I米兰突变体二聚体pUC19 常用的大肠杆菌克隆载体，购自MBI公司pBI121 植物转基因工程中常用的植物表达载体pUCN:携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)的pUC19载体，插入位点为HindIII和 BamHI01eosin/apoA-IM 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的融合基因pUCNOA 携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)、花生油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体融合基因的PUC19载体，插入位点为HindIII和McIpBINOA 携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)、花生油体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米 兰突变体融合基因的PBI121载体，插入位点为HindIII和McI


图1种子特异型植物表达载体pBINOA结构示意图；图2种子特异型植物表达载体pBINOA构建流程示意图；图3pUCN载体的酶切鉴定及PCR检测；图401eosin/apoA_IM融合基因的构建；图5pUCN0A载体的酶切鉴定；图6种子特异型植物表达载体pBINOA的酶切鉴定；图7转基因油葵nptll基因的PCR检测；图8转基因油葵的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因的PCR检测；图9转基因油葵PCR-Southern杂交结果；图10转基因油葵籽粒油体中油体蛋白-阿朴脂蛋白A-I米兰突变体融合蛋白的 Western 检测；图11油葵作为生物反应器和红花作为生物反应器制备阿朴脂蛋白A-I米兰突变 体的比较。
具体实施例方式以下具体实施方式
仅是对于本发明进行进一步说明，并不用于限定本发明的范 围。在了解本发明的内容后，本领域技术人员在不背离本发明精神的前提下对本发明进行 改变，这些技术方案均落在本发明的保护范围之内。除有特殊说明外，下列实施例中所述的方法均为本领域的常规方法。实施例1 种子特异型植物表达载体本发明中首先采用PCR方法扩增了油菜油体蛋白基因启动子(Ν0Ρ)，将该启动子 插入pUC19的HindIII和BamHI酶切位点之间得到pUCN。同时依据阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体基因序列和油葵偏爱的密码子设计并人工合成了阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因， 并将该合成的基因插入花生油体蛋白基因(Ole)的3’末端，获得花生油体蛋白和阿朴脂蛋 白A-I米兰突变体融合基因，同时在花生油体蛋白基因和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因 之间添加了凝血酶酶切位点。进而将该融合基因插入PUCN的BamHI和McI酶切位点之间 得到pUCNOA，HindIII和McI双酶切pUCNOA，琼脂糖凝胶回收2202bp的外源片段，并将该 外源片段插入植物双元表达载体PBI121的HindIII和McI酶切位点之间，获得本发明提 供的植物表达载体pBINOA，pBINOA的表达盒为以油菜油体蛋白基因启动子(NOP)驱动的 01e/apOA-IM融合基因，pBINOA结构如图1所示，1 油菜油体蛋白基因启动子，2 花生油体 蛋白基因，3 凝血酶酶切位点，4 阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因。将pBINOA进行测序获 得表达盒的序列如SEQ ID NO 15所示，长度为2202bp。实施例2 种子特异型植物表达载体pBINOA的构建 植物表达载体pBINOA构建流程如图2所示，具体步骤如下 油菜油体蛋白基因启动子的克隆，油菜是重要的油料作物，含油量高02 45% )，而且油菜油体中20kD油体蛋白的量为MkD油体蛋白量的10倍。根据油菜油体蛋白 基因启动子核苷酸序列(Genbank No. AF134411)设计正向引物pBINOA-1 =CCC AAG CTT TTC AACGTG GTC GGA TCA TGA CG (SEQ ID NO 1)和反向引物 pBINOA-2 CGC-GGA TCC GAATTG AGA GAG ATC GAA GAG (SEQ ID NO :2)，用于PCR扩增油菜20kD油体蛋白基因的启动子，在 引物上分别引入了 HindIII和BamHI酶切位点(下划线表示酶切位点)。以油菜(Brassica campestris)青油14品种基因组DNA为模板，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2为引物，PCR的条件 为:94°C lmin、63-73°C lmin、68°C lmin，30个循环后，68°C延伸lOmin，扩增油菜油体蛋白 基因启动子。琼脂糖凝胶电泳并回收扩增产物，进而用HindIII和BamHI双酶切回收所得 产物，并将其与HindIII和BamHI双酶切的pUC19连接，将连接产物与200 μ LDH5 α感受 态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C热激1.5min，冰浴 3min，加入800 μ L LB培养基37°C培养45min，涂布含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板，37 °C 培养过夜。PCR方法筛选转化子，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2为引物，PCR的条件为94°C lmin、 60-73°C lmin、72°C lmin，30个循环后，72°C延伸lOmin，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测 筛选结果，将阳性转化子命名为PUCN，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂解法提取质 粒，将质粒进行HindIII单酶切鉴定和Hindlll、BamHI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示 鉴定结果如图 3 所示，M =DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, Ll =HindIII 酶切 pUCN质粒的产物为3565bp的片段，L2 =HindIII和BamHI双酶切pUCN质粒的产物为^62bp 的载体片段和90;3bp的启动子，L3 =PCR检测pUCN质粒得到90!3bp的启动子。将pUCN质粒 进行测序，测序步骤如下⑴以PUCN为模板，pUC19通用测序引物进行PCR反应，得到PCR 产物；(2)纯化PCR产物，以去除酶、荧光染料、引物和其他离子；(3)纯化后的PCR产物经 变性和冰浴处理后上3730测序仪(ABI公司)进行测序；(4)仪器自动分析并打印出彩色 测序图谱和DNA序列。pUCN中外源片段长度为90!3bp，序列如SEQ ID NO :3所示，分子量 为556.7kDa。酶切结果和测序结果表明已将油菜油体蛋白基因启动子成功克隆到pUC19 上。阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因的人工合成，依据阿朴脂蛋白A-I基因序列 (SEQ IDNO :4，NM000039)，氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示，同时参照油葵密码子使用频率 (http://www. kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 4232)禾口油葵基 因组中的GC含量重新设计并合成了阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因，同时第517为的碱基 C突变为碱基T，并在基因的5’端添加了凝血酶酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示 CTGGTCCCAAGGGGTAGC，氨基酸序列为SEQ ID N0:7所示L VPRG S，人工合成后的阿朴脂 蛋白A-I米兰突变体基因750bp，分子量为462.4kDa，序列如SEQ ID N0:8所示。该基因编 码的蛋白由249个氨基酸残基组成，分子量为28. 585kDa。01e/apoA-IM融合蛋白基因的扩增，依据花生油体蛋白基因序列(Genbank No. AF325917)和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因序列SEQ ID NO 8设计了两对特异性引 物 pBIN0A-3/pBIN0A-4 和 pBIN0A-5/pBIN0A-6(序列分别如 SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12)pBIN0A_3 和 pBINOA-6 中分别引入 BamHI 和 SacI 酶切位点 (带下划线的碱基为酶切位点)，且pBINOA-3引物中在油体蛋白基因起始密码子周围设计 了 Kozak序列(序列中加粗部分，功能是提高转录和表达效率)；pBINOA-4和pBIN0A_5互 为反向互补序列。
pBINOA-3 CGC-GGA TCC AGC AAA GCC GCC ACC ATG GCT ACT GCT ACT GAT CGpBINOA-4 :GCT ACC CCT TGG GAC CAG TGA TGA TGA CCT CTT AACpBINOA-5 :GTT AAG AGG TCA TCA TCA CTG GTC CCA AGG GGT AGCpBINOA-6 :C GAG CTC TTA TTG TGT GTT AAG TTT CTT TG以pBIN0A-3/pBIN0A_4为引物，花生(品种冀花4号)基因组DNA为模板扩增终 止密码子缺失的花生油体蛋白基因，PCR的条件为94°C lmin、50-55°C lmin、68°C lmin， 30个循环后，68 °C延伸IOmin ；以pBIN0A-5/pBIN0A-6为引物，优化后的阿朴脂蛋白A-I 米兰突变体基因为模板扩增阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因，PCR的条件为94°C lmin、 63-73°C lmin、68°C lmin, 30个循环后，68°C延伸IOmin ；琼脂糖凝胶电泳并回收两种PCR扩 增产物，将两种产物摩尔比1 1混合作为模板，以pBIN0A-3/pBIN0A-6为引物进行重叠 PCR, PCR 的条件为94°C lmin,50-55°C lmin,68°C 2min,30 个循环后，68°C延伸 IOminJlC 脂糖凝胶电泳并回收扩增产物获得01e/apOA-IM融合基因。01e/apOA-IM融合基因的构建 如图 4 所示，M =DNA Molecular Weight Marker DL2000, Ll :pBIN0A-3/pBIN0A_4 为引物， 花生(品种冀花4号)基因组DNA为模板扩增终止密码子缺失的花生油体蛋白基因
的片段，L2 以pBIN0A-5/pBIN0A-6为引物，优化后的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因为模 板扩增阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因750bp (含编码凝血酶酶切位点的核苷酸序列)， L3 以pBIN0A-3/pBIN0A-6为引物进行重叠PCR，获得的01e/apoA_IM融合基因。将Ole/ apoA-IM融合基因进行测序，测序结果显示01e/apOA-IM融合基因序列如SEQ ID NO 13所 示，长1278bp，分子量787. 9kDa。预测的氨基酸残基序列如SEQ ID NO 14所示，由425个 氨基酸残基组成，分子量46.994kDa。0le0Sin-ap0A-IM融合基因的构建结果和测序结果表 明我们已得到0le0Sin-ap0A-IM融合基因。中间载体pUCNOA的构建，将01e/apoA_IM融合基因进行BamHI和McI双酶切后 与同样双酶切的PUCN连接，将连接产物与200 μ L DH5a感受态细胞(购自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C热激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培养基 37°C培养45min，涂布含100 μ g/mL氨苄霉素的LB平板，37°C培养过夜。PCR方法筛选转化 子，pBINOA-3 和 pBINOA-6 为引物，PCR 的条件为-MV lmin、60_73°C lmin、72°C 1.5min，30 个循环后，72°C延伸lOmin，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测筛选结果，将阳性转化子 命名为pUCNOA，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂解法提取质粒，将质粒进行HindIII 单酶切鉴定、HindIII和BamHI双酶切鉴定以及BamHI和McI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶 电泳显示鉴定结果如图 5 所示，M :DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT 141, Ll HindIII单酶切pUCNOA质粒的产物为4849bp的片段，L2 =HindIII和SacI双酶切pUCNOA 质粒的产物为2647bp的载体片段和2202bp的外源片段(包含油菜油体蛋白基因启动子和 oleosin-apoA-IM融合基因)L3 =BamHI和SacI双酶切pUCNOA质粒的产物为3571bp的载 体片段和1278bp的外源片段(oleosin-apoA-IM融合基因)。将pUCNOA质粒进行测序，测 序结果SEQ ID N0:15，全长2202bp，分子量为1357. 5kDa，包括油菜油体蛋白基因启动子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。酶切结果(如图5所示)和测序结果(如序列表中)SEQ ID N0 15表明已获得了油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I米 兰突变体融合基因的表达盒，并已将该表达盒成功克隆到载体PUC19上。
种子特异型植物表达载体pBINOA的构建，碱裂解法提取pUCNOA质粒DNA，用 HindIII和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收2202bp的外源片段，将其与经HindIII和 SacI双酶切的pBI121连接，将连接产物与200 μ L DH5 α感受态细胞(购自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C热激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培养基 37°C培养45min，涂布含100 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C培养过夜。PCR方法筛选转化 子，pBINOA-1 和 pBINOA-6 为引物，PCR 的条件为-MV lmin,60-73°C Imin,72°C 2min，30 个循环后，72°C延伸lOmin，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测筛选结果，将阳性转化子 命名为pBINOA，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂解法提取质粒，将质粒进行HindIII 单酶切鉴定以及HindIII和McI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果如图6所示， M =DNA Molecularffeight Marker λ DNA/EcoT 141，Ll :HindIII 酶切 pBINOA 质粒的产物为 14205bp的片段，L2 =HindIII和SacI双酶切pBINOA质粒的产物为12003bp的载体片段 和2202bp的外源片段(包含油菜油体蛋白基因启动子和oleosin-apoA-lM融合基因)。 将pBINOA质粒进行测序，测序结果SEQ ID NO 15，载体的全长核苷酸序列如SEQ ID N0: 16所示。整个表达盒长2202bp，分子量为1357. 5kDa，包括油菜油体蛋白基因启动子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。油菜油体蛋白基因启动子是种子特异型的强启动子，在转基因 植物的种子中驱动阿朴脂蛋白A-I米兰突变体以融合蛋白的形式与花生油体蛋白共同在 油体中特异表达，花生油体蛋白携带阿朴脂蛋白A-I米兰突变体锚定在油体表面。利用油 体亲脂疏水的特性，将转基因植物种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相即可将融 合蛋白与细胞内其它组分分开，可去除90%以上的种子蛋白。并在花生油体蛋白和阿朴脂 蛋白A-I米兰突变体之间设计了凝血酶识别位点，用以从油体上释放阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体。实施例3利用该载体制备阿朴脂蛋白A-I米兰突变体3. 1上述构建的种子特异型表达载体导入受体植物外植体内；3. 1. 1农杆菌感受态细胞的制备(1)挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3mL的YEB液体培养基(含链霉素 Sml25yg/mL)中，28°C振荡培养过夜；(2)取过夜培养菌液500 μ L接种于50mL YEB (Sm 125 μ g/mL)液体培养基中，28 °C 振荡培养至OD6tltl为0. 5 ；(3) 5，OOOrpm,离心 5min ；(4)加 IOmL 0. 15M NaCl 悬浮农杆菌细胞，5，OOOrpm,离心 5min ；(5) ImL预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，Mh内使用，或分装成每管200 μ L，液 氮中速冻Imin，置_70°C保存备用。3. 1. 2种子特异型植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化取200 μ L感受态细胞，加入Iyg构建好的质粒DNA，液氮中速冻lmin，37°C水浴 5min,然后加入ImLYEB培养基，慢速振荡培养4h ；1, OOOrpm离心30sec，弃上清，加入 0. ImLYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm的YEB平板 上，28 °C培养约48h。阳性克隆的鉴定挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含有100μ g/mL Kan和125μ g/mL Sm)中振荡培养过夜；碱裂解法小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板， pBINOA-1 和 pBINOA-6 为引物，进行 PCR 扩增鉴定，PCR 的条件为94°C lmin、60_73°C lmin、 72°C 2min,30个循环后，72°C延伸lOmin，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果获得阳
性转化子。用于转化油葵的农杆菌菌液的准备从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mL YEB液体培养基中(含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm)，振荡培养过夜，取ImL菌液接种到100_200mL YEB液体培养基(含 有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mLSm)中，剧烈振荡培养至0D_为0. 4 0. 8，3500rpm离心 IOmin,菌体用MS (不含植物生长调节剂和抗生素)液体培养基重悬，使0D_为0. 6左右， 以进行侵染。3. 1. 3农杆菌介导的油葵外植体的遗传转化将发芽3 4d的油葵种子实生幼苗的茎尖、子叶、子叶节和去掉一片子叶的实生 株四种形式的外植体，在上述农杆菌菌液中浸泡6 8min，转至MS固体培养基上共培养 3d(25°C黑暗)。其中优选的方式是去掉一片子叶的实生株。3. 2将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子并进行目的基因和蛋白的 检测；3. 2. 1受体植物材料培养为完整的植株，得到种子将上述转化过的外植体转到含头孢霉素300mg/L的MS培养基上继续进行培养， 约7d后，转至MS抗性筛选培养基上(含头孢霉素300mg/L和卡那霉素70mg/L的)选择培 养，每15 20d更换培养基，筛选三次后获得抗性芽，将2 3厘米抗性芽转至生根培养基 MS2 (MS+IBAO. lmg/L+Kan 70mg/L+cef 300mg/L)，待抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和 营养土混合物培养，直至成熟收获种子。3.2.2目的基因和蛋白的检测在幼苗期对阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因进行PCR检测，收获籽粒后对花生油 体蛋白和阿朴脂蛋白A-I米兰突变体融合蛋白进行Western blotting检测。转基因油葵幼苗的PCR检测和PCR-Southern blotting检测采用SDS法提取抗性油葵幼苗幼嫩真叶的基因组DNA作为模板，以nptllF/nptllR 和pBIN0A-5/pBIN0A-6两对引物进行PCR扩增检测，引物序列分别为nptIIF =ATG AAC TGCAGG ACG AGG(SEQ ID NO :17)nptIIR :GCG ATA CCG TMAGC ACG(SEQ ID NO :18)nptIIF/ nptIIR和 pBIN0A-5/pBIN0A-6 的 PCR 扩增的条件均为为94°C lmin、60°C lmin、72°C lmin, 30个循环后，72°C延伸lOmin，分别扩增出预期为567bp的片段(部分nptll基因)和750bp 的apoA-IM基因片段，结果如图7和图8所示。图7中，M:DNA Molecular WeightMarker DL2000, L1-L4 mptllF/nptnR为引物，以自卡那抗性的油葵所提基因组DNA为模板扩 增出567bp的片段，即为阳性植株，L5 非抗性油葵做对照。图8中，M =DNA Molecular WeightMarkerDL2000, L1-L4 :pBIN0A-5/pBIN0A-6为引物，以自卡那抗性的油葵所提基因 组DNA为模板扩增出750bp的片段，即为阳性植株，L5 非抗性油葵对照。PCR-Southern blottinR 检测1)采用SDS法提取nptll和ap0A_IM均为阳性的转基因油葵幼苗真叶的基因组 DNA,以pBIN0A-l/pBIN0A-6为引物对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C lmin、600C lmin、72°C 2. 5min，30 个循环后，72°C延伸 IOmin02)将DNA从凝胶转移至尼龙膜，电泳完毕，进行变性、中和后，进行半干转膜，将膜 晾干，真空80°C干烤1. 2hrs。3) DNA探针标记回收pBINOA质粒的BamH I+Sac I双酶切片，取3 μ g DNA用于标记4)杂交63°C预杂交膜30mins，63°C杂交过夜，用充足的2XSSC，0. SDS洗膜2次；用预 热到65°C的0. 5 X SSC, 0. 1% SDS 63°C条件下洗膜2次。5)检测杂交和洗过的膜用冲洗缓冲液冲洗，简单淋洗一次；在IOOmL封闭液中浸泡 30min ；在20mL抗体溶液中浸泡30min ；用IOOmL冲洗缓冲液冲洗2次，各15min ；在20mL检 测缓冲液中平衡2-5min ；将膜的DNA面向上放到杂交袋中，加入ImL CSPD ；37°C温浴湿润的 膜lOmin，以使化学荧光充分反应；在X光片上室温曝光。结果如图9所示，M =DNA Molecular WeightMarker λ DNA/EcoT 141，L1-L4 以 PCR 检测阳性植株基因组为模板以 pBINOA-1/ pBINOA-6为引物扩增产物的Southern blotting结果，2. 2kb处显示杂交信号，与预期结果 一致，表明oleosin-apoA-lM融合基因已经整合到油葵基因组中，L5 非转基因油葵对照。转某籽粒Φ花牛油体蛋白禾口阿朴脂^SA-I米S突夺体融合蛋白的 Westernblotting 检泖丨将转基因油葵籽粒于5V研磨缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 4M sucrose, 0.5M NaCl)中研磨，离心IOXg 30min，分为三部分，取油相，重新悬浮于等体积的研磨缓 冲液中，混勻，轻轻加入5V预冷的50mM Tris-HCl pH 7. 5缓冲液，离心10 X g 30min，取油 相。将上述过程重复2次，用以进一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，得到纯净的油 体(油体的成分包括中性脂类磷脂、油体蛋白)。在油体中加入2V乙醚，离心，中性脂类 留在了上层乙醚相中，磷脂在下层的水相中，取中间的蛋白层，以0. IM的蔗糖缓冲液重悬， 加入氯仿甲醇O 1)混合物，抽提两次，取中间蛋白层，乙醚抽提一次，溶于无菌水中。进 行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜后用山羊抗兔阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的多克隆抗 体进行Wfestern blotting分析，结果如图10所示，M 蛋白分子量标准，Ll和L2 为自转基 因油葵的种子中提取的油体蛋白，有阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的表达，表达产物大小约 为48kDa，与预期的大小一致(花生油体蛋白18. 4kDa+凝血酶酶切位点0. 6kDa+阿朴脂蛋 白A-I米兰突变体28. 9kDa)。表达量占种子总蛋白的1. 1 %，超过了重组药物蛋白在植物 中表达的最低商业化要求(1% )，因此利用植物油体表达系统来实现阿朴脂蛋白A-I米兰 突变体的产业化，具有可行性和广阔的应用前景。3. 3从上述种子中分离纯化获得阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。第一步将油体与种子中的其它成分分开将种仁于5V研磨缓冲液(50mMTris-HCl pH 7. 5，0. 4M蔗糖，0. 5M NaCl)中研磨， 离心(10Xg)30min，分为三部分最底部是不可溶沉淀(籽壳、纤维质材料、不溶糖、蛋白质 和其它不溶性污物)，中间是水相，内含可溶的细胞成分(储藏蛋白)，最上层是油体和与之 结合的油体蛋白。第二步洗涤油体
取第一步所得油相，重新悬浮于等体积的研磨缓冲液中，混勻，加入5V预冷的 50mMTri s-HCl pH 7. 5缓冲液，离心(10 X g) 30min，取油相。将上述过程重复2次，用以 进一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，洗涤过的油体重悬于等体积预冷的50mM Tris-HCl pH7. 5中，这样所得的油体是基本纯净的油体制品，仅存的蛋白质是油体蛋白。第三步酶切反应释放阿朴脂蛋白A-I米兰突变体蛋白用凝血酶酶切缓冲液(20mM Tris-HCl ρΗ8· 4、150m M NaCl、2. 5m M CaCl2)洗涤 油体两次，加入适量的凝血酶，37°C过夜，离心，阿朴脂蛋白A-I米兰突变体蛋白存在于水 相中。第四步HPLC纯化阿朴脂蛋白A-I米兰突变体蛋白上反相色谱柱C4(5y，0. 24*25cm)，紫外波长214nm，缓冲液々(10%乙腈0. 1%H 氟乙酸)2mL/min平衡柱子，将上一步所得水相上样，对柱子施以0_60 %缓冲液B (95 %乙腈 0. 三氟乙酸)线性梯度洗脱，得到纯的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体蛋白，纯度达99. 5% 以上。^mm 4 M^^m^m.mm^m^^m^m.^m^mmm^ a-I 米 兰突变体的比较取相同质量QSOmg)的转阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因的油葵种子和红花种 子，依据实施例3分离纯化获得阿朴脂蛋白A-I米兰突变体蛋白，上样量为所得总量的十分 之一，进行Western blotting检测，结果如图11所示，M 蛋白分子量标准，Ll 自转基因红 花纯化的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，大小为28. 9kDa，与预期大小一致，定量为50ng，L2 白转基因油葵纯化的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，大小为28. 9kDa，与预期大小一致，定量 为80ng。由此推算Ikg转基因油葵种子可获得2. 85g阿朴脂蛋白A-I米兰突变体，同等条 件下Ikg转基因红花种子可获得1. 78g阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。而且油葵的亩产量约 250kg.红花的亩产量约200公斤，无论是从种子阿朴脂蛋白A-I米兰突变体产率还是单位 面积种植作物的阿朴脂蛋白A-I米兰突变体产量来看，油葵都要优先于红花。
1权利要求
1.一种表达载体，含有阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I与花生油体蛋白 融合基因，其中启动子为油菜油体蛋白基因启动子。
2.根据权利要求1的载体，其具有SEQID N0:15所示序列。
3.一种构建权利要求1所述的表达载体的方法，其包括如下步骤1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因。2)按照植物偏爱的密码子设计合成阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I基 因，其特征是按照油葵偏爱的密码子优化阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因。3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I米兰突变 体或阿朴脂蛋白A-I融合基因植物表达载体。
4.根据权利要求3的方法，包括如下步骤1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因。2)按照植物偏爱的密码子设计合成阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因，其特征是按照油 葵偏爱的密码子优化阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因。3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白A-I米兰突变 体融合基因植物表达载体。
5.根据权利要求4的方法，其中的油菜油体蛋白启动子可以克隆到pUC19的HindIII 和BamHI位点之间。
6.根据权利要求5的方法，在步骤( 中将频率小于10%的密码子一律认为是稀有密 码子被排除，其余的各密码子按油葵密码子使用频率优化。
7.根据权利要求6的方法，优化前后的一致性大于60%。
8.根据权利要求7的方法，优化前后的一致性为72%。
9.根据权利要求8的方法，在步骤(3)中利用重叠PCR技术将花生油体蛋白基因和阿 朴脂蛋白A-I米兰突变体基因基因构建成融合基因01e/apOA-IM，将该融合基因连入pUCN 得到重组质粒pUCNOA，优选连入的位点为pUCN的BamHI和McI酶切位点之间，双酶切重组 质粒pUCNOA，优选HindIII和&icl双酶切重组质粒pUCNOA，回收2202bp的外源片段，并将 该外源片段连入植物表达载体的HindIII和McI位点之间。
10.一种制备阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I的方法，其包括如下步骤1)将权利要求1或2所述表达载体导入受体植物外植体内；2)将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子；3)从上述种子中分离纯化得到阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I0
11.根据权利要求10所述的方法，其中受体植物为油葵。
12.根据权利要求10所述的方法，所制备的是阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。
13.根据权利要求10所述方法，其中步骤1)中的导入方法为农杆菌介导法转化。
14.根据权利要求11所述方法，其中所述油葵种子为卡那霉素抗性表型。
15.根据权利要求10所述方法，其中所述纯化方法为高效液相色谱法。
16.根据权利要求10所述方法，其中的分离纯化方法包括将含阿朴脂蛋白A-I米兰突 变体或阿朴脂蛋白A-I的种子在缓冲液中研磨，离心将油体和种子的其他成分分离，洗涤 油体，通过酶切反应将阿朴脂蛋白A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白A-I自油体表面释放，经 HPLC纯化获得阿朴脂蛋白A-I米兰突变体。
全文摘要
本发明公开了一种种子特异型表达载体及其构建方法与应用，主要是在植物双元表达载体pBI121的限制性内切酶酶切位点HindIII和SacI的之间插入以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白基因-阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因组成的融合蛋白表达盒，得到发明中所述的植物表达载体pBINOA。另外，提供了一种利用该表达载体转化油葵构建植物生物反应器制备阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的方法，该方法不仅可以提高阿朴脂蛋白A-I米兰突变体的产率，而且大大降低生产成本，适合工业化生产。
文档编号C12N15/82GK102127562SQ20101058001
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者于成钢, 刘培, 卢海刚, 安胜军, 李雪, 柴锡庆, 温昕, 焦展, 王崑声, 胡良元, 许海民, 邵铁梅, 陈云雨 申请人:安胜军, 柴锡庆, 王崑声