绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建的制作方法

文档序号:587812阅读:293来源:国知局
专利名称:绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建的制作方法
技术领域
本发明涉及绵羊Noggin基因编码区的全长cDNA序列的克隆及慢病毒表达载体的构建。
背景技术
Noggin BMPs (bone morphogenetic proteins,S ) ^白,是从非洲蟾蜍体内分离,能诱导神经组织发生和腹侧中胚层背侧化。由于它与BMP2和 BMP4具有高度亲和力,从而阻止它们与BMP受体的相互作用。因此,BMPs活性受到BMP拮抗蛋白noggin基因的抑制性调节。目前普遍认为,毛囊的发生也是由表皮干细胞引发的。在毛囊的形成过程中,表皮干细胞通过改变他们的极性以及细胞间的相互联系而启动这一过程。2003年,由洛克斐勒大学HHMI研究所Elaine Fuchs领导的研究人员发现了两个信号分子,即WNT及BMP 抑制剂Noggin,能够影响未成熟的干细胞形成毛囊的过程。在之前的研究中,Fuchs将 beta-catenin基因导入小鼠生产出具有很多毛囊的转基因老鼠。beta-catenin受Wnt信号通路调节,研究人员证明Wnt能使beta-catenin稳定,而noggin则能阻断BMP的功能, 产生Lefl。这样,beta-catenin即可结合并活化Lefl转录复合体,下调E-cadherin基因的表达,降低E-cadherin的水平,从而改变细胞的极性以及细胞间相互连接,引发毛囊的起始过程。如果提高E-cadherin的水平,毛囊则不再形成。这就是说,通过来源于不同类型细胞的WNT及noggin两个影响毛囊形成的信号分子,将细胞外的信号通路与细胞核转录因子联系在一起,共同作用于目标基因,可以重塑细胞间联系、启动毛囊的形成。毛发是少数几个能规律性再生的器官之一,是研究器官再生的主流模式之一,也是目前研究的热点领域。2008年,来自美国南加州大学钟正明教授的研究小组发现,毛发(即使是正常小鼠中的毛发)并不是以个体为单位生长,而是波浪式再生的,这说明毛发干细胞不仅受到一个毛囊中微环境的调控,也被邻近的毛囊、皮肤区间,以及系统激素有等级地进行调控。在分子水平上,BMP和Noggin的表达呈周期性变化。在毛囊生长期,尤其是细胞增殖时,Noggin 表达高、BMP表达低;在退行期和不应期,BMP表达高、Noggin表达低。这些发现表明皮肤宏观环境(macro-environment)下,BMP和Noggin的周期性表达在毛发干细胞活性机制中发挥关键作用。当许多毛发再生的时候,毛发必须在它们其间交换活性信号,在宏观环境的不同时间位点,这些干细胞活性受到抑制或者促进。研究人员还发现在转基因小鼠皮肤中过量上表达noggin,毛囊的不应期显著缩短,而毛囊的再生明显加快;将该转基因小鼠的皮肤移植到正常小鼠皮肤则发现,供体和受体皮肤的毛囊会受相互作用影响,其毛囊最终的命运则取决于真皮内BMP的活性;而人为调控皮肤BMP活性即可造成毛囊生长周期的变化。 所以,骨形态发生蛋白(BMP)及其拮抗因子Noggin在控制毛囊活动周期中起重要作用。因此,通过调节Noggin基因的表达干预BMP的活性,能够影响毛囊生长周期,延长毛囊生长期、加快毛囊循环周期的进程。Andrey的研究还发现,Noggin基因的过量表达还将改变毛囊的大小和毛发的形状,这些变化无疑对提高毛产量和品质提供了实验和理论依据。本发明利用RT-PCR技术扩增出绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,进一步构建慢病毒表达载体,利用慢病毒卵周隙注射技术生产转Noggin基因绵羊,以便进一步分析 Noggin基因在绵羊毛囊生长发育中的作用。

发明内容
本发明的目的在于提供的克隆绵羊Noggin基因的cDNA序列和构建慢病毒表达载体,对分析其在细毛羊毛囊生长发育中的功能有重要的科学价值与实践意义。本发明的目的是这样实现的绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,1)确定绵羊Noggin基因编码区的全序列;2)设计克隆Noggin基因全长 cDNA 的 PCR 弓丨物,上游引物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ;上下游引物酶切位点外侧含有酶切的保护碱基ATA和 CGA ;3)将目的基因定向克隆于pET41a原核表达载体中,获得pET41a-N0ggin重组原核表达载体;4)设计将目的基因定向克隆与慢病毒表达载体的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗体标签);将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中,获得Noggin基因慢病毒载体,生产重组病毒,利用慢病毒卵生产转Noggin基因绵羊力)通过 PCR方法鉴定转基因羊。所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,以反转录的cDNA为模板,利用特异性引物m和N2进行PCR反应,其反应体系为2uL cDNA模板,2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM),上下游引物(IOmM)各 luL,IuL DMSO,IUTaq 酶(宝生物,Pfu),用 ddH20 调整至 25uL;其 PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s, 64 °C 30s, 72 °C lmin,;35 个循环, 72°C IOmin ;取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认,将绵羊Noggin基因的扩增产物及 pET41a载体同时进行BamH I-Xho I双酶切,分别回收纯化酶切后的PCR产物和pET41a载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pET41a载体,转化E. coli DH5 α ;利用卡纳霉素和蓝白斑标记进行平板筛选,并以PCR法和限制性酶切法鉴定,阳性克隆质粒进行序列鉴定后,命名为pEI^la-Noggin。所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,构建表达载体,生产慢病毒,生产转 Noggin基因绵羊其构建载体以pET41a-N0ggin为模板,利用特异性引物Pl和P2进行PCR反应; 其反应体系为luL pET41a-Noggin,2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM),上下游引物(IOmM)各 luL,IuL DMSO, IUTaqSI (宝生物,Pfu),用 ddH20调整至 25uL ;其 PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s,64°C 30s, 72°C lmin,35 个循环,72°C IOmin ;取反应液 5uL 经琼脂糖凝胶电泳检测确认,将绵羊Noggin基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行BamH IAhoI双酶切,分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的 PCR产物和pLEX载体,转化E. coli DH5 α ;利用氨苄青霉素进行平板筛选,并以PCR法、限制性酶切法鉴定,并送由上海生物工程有限公司测序鉴定,新载体命名为pLEX-noggin ;其细胞培养条件37°C,5%的CO2,培养基采用DMEM+10 %的胎牛血清, 每IOcm面积中铺2-2. 5X IO6个细胞,保证第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80% ;其Lipectamine 2000脂质体转染加入1. 5ml预热的Opti-MEM培养基后,按下列比例加入转染载体(plex-noggin)12ug、包装质粒(pSPAX》9ug、包膜质粒(pMD2G) 3. 5ug、 轻轻混勻,同时将50ul的脂质体加入到1. 5ml opti-MEM培养基,室温放置5min后,将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物置于室温孵育20分钟;在此期间,用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次,将脂质体和DNA复合物加入细胞,将细胞培养板放回37°C培养箱中孵育,2-4小时后,移去脂质体和DNA复合物,在每个培养皿中加入IOml新鲜的培养液,重新将细胞培养板放回37°C培养箱中培养,4 后收集病毒;其收集病毒细胞培养上清液,将细胞上清用0. 45um过滤器过滤,收集过滤液,采用clontech公司的病毒滴度测定试剂盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)测定滴度,滴度大于106IFU/ml,超速低温离心浓缩,将浓缩后的病毒分装至1. 5ml的印pendorf中,置于液氮或者_70°C保存备用。所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,转基因羊的鉴定,采集脐带和皮肤组织,利用酚-氯仿法提取基因组DNA,通过PCR方法鉴定转基因羊;PCR上游引物 CACCAAAATCAACGGGACTT,下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGA GCACTTGCACTC ;PCR 反应体系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L,引物(lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L, DNA 模板 600ng, ddH20 补至 25 μ L ;PCR 反应程序95 V 5min ;95 °C 30sec ;60 °C 30sec ; 720C lmin,35 个循环;72°C 7min。所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,根据GenBank已经公布的人 (NM_0(^450),小鼠(NM_008711)和牛(XM_582573)的Noggin基因编码区的保守序列,利用 01igo6. 0设计一对PCR引物,其引物由上海生物工程公司合成。所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,选用的试剂盒、药剂均为市售产品。本发明构思是确定绵羊Noggin基因编码区的全序列,设计克隆Noggin基因全长 cDNA的PCR引物,通过RT-PCR技术,从绵羊胎儿脑组织克隆绵羊Noggin基因全长cDNA,确定绵羊Noggin基因编码区cDNA序列;将目的基因定向克隆于pET41a原核表达载体中,获得pET41a-N0ggin重组原核表达载体;特别是该发明构建Noggin基因慢病毒载体,生产重组病毒,利用慢病毒卵周隙注射技术生产转Noggin基因绵羊,具有重要的实践价值,彰显技术进步。


本发明对照附图作进一步说明。附图1为绵羊Noggin基因PCR扩增结果;如图所示M为150bp marker, 1为扩增到的noggin基因。附图2为绵羊Noggin基因原核表达结果;如图所示重组pET41-NogginSDS-PAGE 检测1,3,5. pET41_Noggin 诱导后,2,4, 6. pET41-Noggin 诱导前,7. pET41 空载体。附图3 为重组 pLEX-NogginWestern blot 检测结果;如图所示绵羊Noggin基因真核表达结果1,2pLEX_Noggin,3. pLEX空载体。图4为转Noggin细毛羊脐带,皮肤组织PCR检测结果;如图所示转基因羊鉴定的PCR结果第一排为脐带,第二排为相对应的皮肤组
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。

实验过程(1)实验样品采集与总RNA提取采集妊娠3个月的羊胚胎,快速分离脑组织,装入冻存管中并迅速置于液氮中保存备用;取IOOmg组织样在液氮中研碎,然后按照杭州博日RNA提取试剂盒说明书进行提取。(2)引物设计利用01igo6. 0设计的两对(N1,N2和P1,P2)PCR引物,由上海生物工程公司合成。(3) RT-PCR对绵羊胚胎脑组织RNA进行反转录,反转录方法参照说明书;以反转录的cDNA 为模板,利用特异性引物W和N2进行PCR反应,其反应体系为2uL cDNA模板,2.5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM),上下游引物(IOmM)各 luL,IuL DMSO,IUTaq酶(宝生物,Pfu),用 ddH20 调整至 25uL。PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s,64°C 30s, 72°C lmin, 35个循环,72°C IOmin ;反应结束,取反应液5uL进行琼脂糖凝胶电泳检测,确认其产物。(4)克隆和测序将绵羊Noggin基因的扩增产物及pEI^la载体同时进行BamHI-XhoI双酶切,分别回收纯化酶切后的PCR产物和pET41a载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和 pET41a载体,转化E. coli DH5 α ;利用卡纳霉素和蓝白斑标记进行平板筛选,并以PCR法和限制性酶切法鉴定,阳性克隆质粒进行序列鉴定分析后命名为pET41a-N0ggin。(5)原核表达将测序后的质粒DNA及空载体分别转化BL21(DE!3)感受态细胞,在含有卡纳霉素(50ug/mL)的LB固体培养基中37°C培养过夜;挑取单克隆菌落接种到含有卡纳霉素 (50ug/mL)的LB液体培养基,37°C震荡培养过夜;然后将培养物按1 100的比例接种于新鲜的含有卡纳霉素(50ug/mL)的LB液体培养基,37°C摇震培养至0P_ = 0. 4-0. 6时,加入IPTG(终浓度lmmol/L)37°C诱导培养4h后,按常规方法离心收集菌体,用200uLPBS重悬菌体,并加入200uL 2 X SDS-PAGE电泳上样缓冲液,100°C变性lOmin,进行SDS-PAGE和 Western-blot,分析目的蛋白的表达。(6)构建noggin基因的慢病毒表达载体,生产高滴度慢病毒,利用慢病毒卵周隙注射技术生产转Noggin基因绵羊;a、构建慢病毒表达载体以pET41a-N0ggin为模板,利用特异性引物Pl和P2进行 PCR 反应,其反应体系为2uL cDNA 模板,2. 5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM), 上下游引物(IOmM)各 luL,IuL DMSO, IUTaq 酶(宝生物,Pfu),用 ddH20 调整至 25uL。PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s, 64°C 30s, 72°C lmin, 35 个循环,72°C IOmin ;取反应液 5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认。将绵羊Noggin基因的扩增产物及pLEX慢病毒载体同时进行BamHIAho I双酶切,分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体,利用T4DNA连接酶
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7连接酶切后的PCR产物和pLD(载体,转化E. coli DH5a ;利用氨苄青霉素进行平板筛选, 并以PCR法、限制性酶切法鉴定,并送由上海生物工程有限公司测序鉴定,新载体命名为 pLEX-noggin ;将绵羊Noggin基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行BamH I/Xho I双酶切,分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和 pLEX载体,转化E.coli DH5a ;利用氨苄青霉素进行平板筛选,并以PCR法和限制性酶切法鉴定,新载体命名为pLEX-noggin ;b、在细胞中包装重组慢病毒步骤第1日J93T细胞培养和铺板293Τ细胞培养条件,37°C,5%的CO2,培养基采用DMEM+10%的胎牛血清,每IOcm 面积中铺2-2. 5X IO6个细胞,保证第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80% ;第2 日Lipectamine 2000 脂质体转染首先,在聚丙烯管里准备脂质体和DNA复合物;加入1. 5ml预热的Opti-MEM培养基后,按下列比例加入目的载体及病毒包装载体。轻轻混勻。室温放置;转染载体(plex-noggin)12ug包装质粒(pSPAX》9ug包膜质粒(pMD2G)3. 5ug在使用Lipectamine 2000之前先轻轻混勻脂质体;而后,在另一个管中加入 1. 5ml室温的Opti-MEM培养基,再加入50ul Lipectamine 2000,轻轻混勻后室温放置,室温放置5min后;将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物置于室温孵育20分钟;在此期间,用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次,将脂质体和DNA复合物加入细胞;将细胞培养板放回37°C培养箱中孵育,2-4小时后,移去脂质体和DNA复合物,在每个培养皿中加入 IOml新鲜的培养液,重新将细胞培养板放回37°C培养箱中培养;第4日收集病毒收集含病毒的细胞培养上清液。将细胞上清用0. 45um过滤器过滤,收集过滤液; 采用clontech公司的病毒滴度测定试剂盒(lenti-xqrt-PCR TitrationKit)测定滴度,滴度大于106IFU/ml,超速低温离心浓缩,保证浓缩后的病毒滴度大于109IFU/ml,将浓缩后的病毒分装至1. 5ml的^pendorf中,置于液氮或者_70°C保存备用;C、利用慢病毒卵周隙注射生产转基因羊。(7)转基因羊的鉴定采集转基因羊的脐带和皮肤组织,利用酚-氯仿法提取基因组DNA ;通过PCR方法鉴定转基因羊,PCR反应体系(25yL) :PCR Mix 12.5yL,引物 (lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L,DNA 模板 600ng, ddH20 补至 25 μ L ;PCR 反应程序95 "C 5min ;95 "C 30sec ;60 "C 30sec ;72 "C lmin,35 个循环; 72 0C 7min ;上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT(pLEX 载体自带引物),下游引物CGACTCGAGCT AAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC。
权利要求
1.绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于1)确定绵羊Noggin基因编码区的全序列;2)设计克隆Noggin基因全长cDNA 的 PCR 弓丨物,上游弓丨物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游弓丨物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ;上下游引物酶切位点外侧含有酶切的保护碱基ATA和 CGA ;3)将目的基因定向克隆于pET41a原核表达载体中,获得pET41a-N0ggin重组原核表达载体;4)设计将目的基因定向克隆与慢病毒表达载体的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗体标签);将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中,获得Noggin基因慢病毒载体,生产重组病毒,利用慢病毒卵生产转Noggin基因绵羊力)通过 PCR方法鉴定转基因羊。
2.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于以反转录的cDNA为模板,利用特异性引物m和N2进行PCR反应,其反应体系为2uL cDNA模板,2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM),上下游引物(IOmM)各 luL,IuL DMSO, IUTaq 酶(宝生物,Pfu),用 ddH20 调整至 25uL ;其 PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s, 64°C 30s, 72°C lmin,35个循环,72°C IOmin ;取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认,将绵羊Noggin基因的扩增产物及pET41a载体同时进行BamH I-Xho I双酶切,分别回收纯化酶切后的PCR产物和pET41a载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pET41a载体,转化E. coli DH5a ;利用卡纳霉素和蓝白斑标记进行平板筛选,并以PCR法和限制性酶切法鉴定,阳性克隆质粒进行序列鉴定后,命名为pET41a-N0ggin。
3.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于构建表达载体,生产慢病毒,生产转Noggin基因绵羊其构建载体以pET41a-N0ggin为模板,利用特异性引物Pl和P2进行PCR反应;其反应体系为luL pET41a-Noggin,2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM),上下游引物 (IOmM)各 luL,IuL DMSO, IUTaq 酶(宝生物,Pfu),用 ddH20 调整至 25uL ;其 PCR 反应条件为94°C 4min,94°C 30s,64°C 30s, 72°C lmin, 35 个循环,72°C IOmin ;取反应液 5uL 经琼脂糖凝胶电泳检测确认;将绵羊Noggin基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行BamH I/ XhoI双酶切,分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体,利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR 产物和pLEX载体,转化E.coli DH5a ;利用氨苄青霉素进行平板筛选,并以PCR法、限制性酶切法鉴定,并送由上海生物工程有限公司测序鉴定,新载体命名为pLEX-noggin ;其细胞培养条件37°C,5%的CO2,培养基采用DMEM+10%的胎牛血清,每IOcm面积中铺2-2. 5 X IO6个细胞,保证第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80% ;其Lipectamine 2000脂质体转染加入1. 5ml预热的Opti-MEM培养基后,按下列比例加入转染载体(plex-noggin)12ug、包装质粒(pSPAX》9ug、包膜质粒(pMD2G) 3. 5ug、轻轻混勻,同时将50ul的脂质体加入到1. 5ml opti-MEM培养基,室温放置5min后,将上述稀释好的DNA与脂质体混合,混合物置于室温孵育20分钟;在此期间,用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次,将脂质体和DNA复合物加入细胞,将细胞培养板放回37°C培养箱中孵育, 2-4小时后,移去脂质体和DNA复合物,在每个培养皿中加入IOml新鲜的培养液,重新将细胞培养板放回37°C培养箱中培养,4 后收集病毒;其收集病毒细胞培养上清液,将细胞上清用0. 45um过滤器过滤,收集过滤液,采用clontech公司的病毒滴度测定试剂盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)测定滴度,滴度大于106IFU/ml,超速低温离心浓缩,将浓缩后的病毒分装至1. 5ml的印pendorf中,置于液氮或者_70°C保存备用。
4.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于转基因羊的鉴定,采集脐带和皮肤组织,利用酚-氯仿法提取基因组DNA,通过PCR方法鉴定转基因羊;PCR 上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT,下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC ;PCR 反应体系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L,引物(lOpmol/ μ L)各 0· 5 μ L,DNA 模板 600ng, ddH20 补至 25 μ L ;PCR 反应程序:95 V 5min ;95°C 30sec ; 60°C 30sec ;72°C lmin,35 个循环;72°C 7min。
5.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于根据 GenBank 已经公布的人(ΝΜ_00Μ50),小鼠(ΝΜ_008711)和牛(ΧΜ_582573)的 Noggin 基因编码区的保守序列,利用01igo6. 0设计一对PCR引物,其引物由上海生物工程公司合成。
6.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,其特征在于选用的试剂盒、药剂均为市售产品。
全文摘要
本发明的绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建,确定绵羊Noggin基因编码区的全序列;设计克隆Noggin基因全长cDNA的PCR引物,上游引物N1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物N2CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC;其引物酶切位点外侧含有保护碱基ATA和CGA;将目的基因克隆于pET41a原核表达载体中,获得pET41a-Noggin重组载体;设计将目的基因定向克隆与慢病毒表达载体的引物上游引物P1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物P2CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC(包含HA抗体标签);将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒载体中,获得Noggin基因慢病毒载体,生产重组病毒,生产转Noggin基因绵羊;通过PCR方法鉴定其转基因羊。
文档编号C12N15/867GK102181447SQ20101058002
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者刘明军, 张宁, 张雪梅, 李文蓉, 贺三刚 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心
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