专利名称：绵羊mstn基因启动子区两个新snp位点检测及其检测方法的建立的制作方法
技术领域：
本发明涉及绵羊肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)基因启动子区的两个单核苷酸多态性位点及其检测方法。
背景技术：
绵羊肌肉的生长性状(包括产量和质量)决定着肉用绵羊的生产性能。产肉性能的好坏，除与绵羊的营养和饲养管理因素有关外，主要决定于遗传因素，即主要受与肌肉生长发育相关基因的调控。在过去十几年，大量的研究表明在绵羊2号染色体上存在影响绵羊肌肉生长性状的QTL。肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)属于转化生长因子超家族成员，是近年来发现的一类重要的肌肉生长负调控因子，该基因的突变失活，能阻断MSTN 对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低脂肪的沉积。到目前为止， 在具有双肌性状的Texel羊和其它品种绵羊的MSTN编码区中均没有发现与肌肉生长相关的SNP位点。2006年，Alex Clop等发现Texel羊双肌性状产生的遗传机制是由于MSTN基因3，UTR的一个SNP位点(g+6723G-A)产生了新的mi RNA作用靶点，引起MSTN基因翻译后抑制，进而导致Texel羊的双肌性状。进一步研究表明，该位点与绵羊的肌肉产量和脂肪沉积显著相关。以上研究表明MSTN基因调控区的SNP可能发挥着重要的生物学作用。因此本发明以国外引进品种陶赛特，特克赛尔，德国肉用美利奴和新疆地方品种阿勒泰羊，巴音布鲁克，巴士拜羊和多浪羊为试验材料，利用DNA测序技术对MSTN基因启动子区进行了单核苷酸多态性检测，在启动子区找到具有群体代表性的SNP，并进一步建立简单，经济PCR-RFLP方法检测心发现的SNP，为下一步进行启动子区域的SNP位点的生物学功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于检测绵羊myostatin基因启动子区单核苷酸突变位点，并提供该等位基因突变的检测方法。本发明的目的是这样实现的绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，分以下步骤；其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，位于GeneBank 序列，登记号DQ53(^60 ；从起始密码子ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点 (-959T/C, -784G/A)，表现为 6 种基因型(TT，TC, CC, GG, GA, AA)；其2检测到上述突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp; 其中 Pl 引物 F :TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG, R :TGGCTTCTAGTCTTGAGGATT ；用于 MSTN基因的启动子区测序；P2 引物 F TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG, R GAGCTGATTCATTTGACTACTTC ；和 P3 引物 F GTAGTCAATCGAAACTGAAGT, R CCCTGAATAAATTCTTAGCAC ；分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；
其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到 985bp和121bp片段的产物，利用Ι^ρ1406Ι和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，建立SNP 位点的PCR-RFLP检测体系，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，体外扩增；采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA ；使用特异结合的核苷酸引物Pl对基因组 DNA模板进行体外扩增；PCR反应体系(25 μ L) =IOXbuffer 2. 5yL，引物(lOpmol/μ L)各 0. 5 μ L，dNTP (10mmol/L) 2 μ L, DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0· 4 μ L，DNA 模板 1 μ L, ddH20 补至 25 μ L ；PCR 反应程序:95 V 5min ；95°C 30sec ；51°C 30sec ；72°C lmin30sec (Pl)，Imin (P2)， 30sec(P3);35 个循环；72°C IOmin0所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，PCR-RFLP的检测将-959位点酶切产物使用3%琼脂糖凝胶电泳检测，将Ι^ρ1406Ι酶切产生的基因型定义为CC(73!3bp， 252bp),TC(985bp,733bp,252bp)；将-784位点酶切产物使用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，针对-784位点设计一对错配引物，当G-A时就形成了 Rsa I的酶切位点，导致酶切产生两个片段(101bp+20bp)。所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，PCR扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司进行SNP位点的序列分析。所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，选用的试剂盒、药剂均为市售产品。本发明利用DNA测序技术结合PCR-RFLP对MSTN基因启动子区进行了单核苷酸多态性检测和群体遗传多态性分析，获得了具有群体代表性的SNP，为进一实施SNP位点的生物学功能研究奠定理论与实践的基础，彰显技术进步。
本发明对照附图作进一步说明。附图1为MSTN基因启动子区Pspl406 I酶切结果；如图所示M为150bp的marker，其余为检测巴士拜羊的PCR扩增样品。附图2为MSTN基因启动子区RsaI酶切结果；如图所示M为50bp的marker，其余为检测巴士拜羊的PCR扩增样品。
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。实施例操作设计其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，从起始密码子 ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点(-959T/C，-784G/A)，表现为6种基因型(TT， TC, CC, GG, GA, AA)；其2检测到突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp ；第一条引物用于MSTN基因的启动子区测序，第二、三条引物分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；
其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到 985bp和121bp片段的产物，利用Ι^ρ1406Ι和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。具体操作一、体外扩增(1)采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA ；(2)使用特异结合的核苷酸引物Pl对基因组DNA模板进行体外扩增；(3)PCR 反应体系 05 μ L) 10Xbuffer 2. 5 μ L，引物(lOpmol/μ L)各 0. 5 μ L， dNTP (10mmol/L) 2 μ L, DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0· 4 μ L，DNA 模板 1 μ L, ddH20 补至 25 μ L ；(4) PCR 反应程序95 "C 5min ；95 "C 30sec ；51 "C 30sec ；72 "C lmin30sec (Pl)， Imin (P2)，30sec(P3);35 个循环；72°C IOmin0二、PCR扩增产物测序从7个绵羊品种(阿勒泰羊，巴音布鲁克，巴士拜羊，多浪羊，陶赛特，特克赛尔和德国肉用美利奴)中选择35个个体(每个品种5个样本)，利用引物Pl对MSTN基因启动子区进行扩增，扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司进行序列分析，分析SNP位点。三、PCR-RFLP分析(1)根据所发现的 SNP，利用 Rsa I (-785)和 Pspl406I (-959)分别进行 PCR-RFLP 检测酶切体系为，10 μ L PCR 产物，2 μ L 10 XBuffer, 1 μ L IOU/ μ L RsaI 或 Pspl406I 限制性内切酶，18 μ L水，37°C温育3h ；(2)-959位点酶切产物使用3%琼脂糖凝胶电泳检测；电泳使用凝胶配置3%琼脂糖凝胶、琼脂糖3g、lXTAE100ml ；电泳在常温环境，85V电压条件下电泳15min ；电泳结束取下凝胶，使用溴乙锭法染色，利用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型，将 Pspl406I 酶切产生的基因型定义为 CC(733bp，252bp)，TC (985bp, 733bp, 252bp)， 结果见图1 ；针对-784位点设计一对错配引物，当G-A时就形成了 Rsa I的酶切位点，导致酶切产生两个片段(101bp+20bp)，聚丙烯凝胶电泳检测见图3 ；(3)-784位点酶切产物利用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；8%的聚丙烯酰胺凝胶配置 %丙烯酰胺-1% N，N-双丙烯酰胺4. 14mL ； 5XTBE1. 5mL ；10%过硫酸铵(AP) 0. IlmL ；TEMED (四甲基乙二胺)10 μ 1 ；去离子水 9. 25mL ； 总体积15mL ；电泳在常温环境，150V电压条件下电泳^ir ；电泳结束取下凝胶，使用快速染色显影方法先用蒸馏水清洗凝胶，然后转入染色盒中，加入染色液，摇床上染色10分min ；用蒸馏水清洗凝胶，转入显影盒，先加入少量显影液冲洗并把液体倒掉，然后加入适量显影液显影3min，待条带清晰用蒸馏水清洗，利用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型；染色液0. 1 %硝酸银溶液，称取0. 5克硝酸银溶于500ml去离子水，置于棕色瓶中，室温保存。显影液Na0H片10克，NaCO3 0. 2克，甲醛^il，加去离子水定容至500ml，现配现用。
权利要求
1.绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于分以下步骤；其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，位于GeneBank序列，登记号DQ53(^60 ；从起始密码子ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点(-959T/ C，-784G/A)，表现为 6 种基因型(TT，TC, CC, GG, GA, AA)；其2检测到上述突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp ；其中 Pl 引物 F :TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG，R :TGGCTTCTAGTCTTGAGGATT ；用于 MSTN 基因的启动子区测序；P2 引物 F :TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG, R :GAGCTGATTCATTTGACTACTTC ；和 P3 引物 F GTAGTCAATCGAAACTGAAGT, R CCCTGAATAAATTCTTAGCAC ；分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到985bp和 121bp片段的产物，利用Ι^ρ1406Ι和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，建立SNP位点的 PCR-RFLP检测体系，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。
2.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于体外扩增；采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA ；使用特异结合的核苷酸引物Pl对基因组DNA模板进行体外扩增；PCR反应体系(25 μ L) =IOXbuffer 2. 5μ L,弓 I 物(10pmol/yL)各 0· 5 μ L，dNTP (10mmol/L) 2 μ L，DNA 聚合酶 O. 5U/ μ L) 0. 4 μ L，DNA 模板 1 μ L, ddH20 补至 25 μ L ；PCR 反应程序95 "C 5min ；95 "C 30sec ； 51 °C 30sec ；72°C lmin30sec (Pl)，Imin (P2)，30sec (P3) 35 个循环；72°C IOmin0
3.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于 PCR-RFLP的检测将-959位点酶切产物使用3%琼脂糖凝胶电泳检测，使Ι^ρ1406Ι酶切产生的基因型定义为CC (733bp，252bp)，TC (985bp，733bp，252bp)；将-784位点酶切产物使用 8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，针对-784位点设计一对错配引物，当G-A时就形成了 Rsa I的酶切位点，导致酶切产生两个片段(101bp+20bp)。
4.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于PCR扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司进行SNP位点的序列分析。
5.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于选用的试剂盒、药剂均为市售产品。
全文摘要
本发明的绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，分步骤；其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，位于GeneBank序列，登记号DQ530260；从起始密码子ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点(-959T/C，-784G/A)，表现为6种基因型(TT，TC，CC，GG，GA，AA)；其2检测到上述突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp；第一条引物用于MSTN基因的启动子区测序，第二、三条引物分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到985bp和121bp片段的产物，利用Psp1406I和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，建立SNP位点的PCR-RFLP检测体系，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。
文档编号C12Q1/68GK102181517SQ20101058003
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者刘明军, 张宁, 张雪梅, 李文蓉, 贺三刚, 陈芯 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心