一种用于抗病毒药物筛选的方法

文档序号:587817
专利名称:一种用于抗病毒药物筛选的方法
技术领域
本发明涉及一种新的一种用于抗病毒药物筛选的方法,属生物和医药新技术领 域。
背景技术
mRNA翻译起始是通过5’端m7GpppN帽子结构,招募40S核糖体亚基和真核起始因 子eIF4F复合物。之后,核糖体复合物通过扫描机制从5’端到3’端进行翻译起始寻找合 适的起始密码子AUG进行翻译起始。这就是依赖帽子结构的翻译机制。而对于大部分RNA 病毒来说,特别是小RNA病毒5’端RNA结构含有多个稳定的茎环结构,它们能够减缓甚至 阻止核糖体复合物的扫描过程,其中含有能够不依赖帽子结构而独立招募核糖体进行翻译 起始的元件(内部核糖体进入位点(IREQ)。依赖IRES元件进行翻译起始的RNA病毒在哺 乳动物,无脊椎动物,植物中均有发现。到目前为止科学家已经在60种动物病毒和8种植物病毒的115个病毒mRNA中发 现 IRES 活性结构序列(Mokrejs M et al,Nucleic Acids Res. 34 :D125_30,2006)。其中包 含常见的脑心肌炎病毒(EMCV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、心病毒属(Cardiovirus)、口疮 病毒属(Aphthovirus)、肠道病毒属(enterovirus)、鼻病毒属(rhinovirus)、蟋蟀麻痹病 毒(CrPV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等。IRES是 一段与众不同的RNA分子,能够募集真核生物核糖体到mRNA分子5’ UTR上进行翻译起始。 这个过程就是内部起始翻译。具备IRES元件的RNA病毒5’端不含有帽子结构,GC含量较 高,具有复杂而且稳定的二级和三级结构。但是在一级和二级结构上还没有发现它们的共 同特征。随着对RNA病毒IRES元件研究的深入,其应用价值也随之体现出来。以IRES介导 的翻译起始已成为治疗RNA病毒引起的严重疾病的重要靶目标之一。例如,病毒依赖IRES 的翻译起始作为治疗靶目标的潜力已经在HCV中体现出来,即通过IRES元件鉴定能够抑制 病毒翻译的有效成分。如RNA适体(aptamer)就是从与HCV IRES紧密结合的众多RNA分 子中筛选出来的,它在体内和体外条件下都能够与HCV IRES的核心区III2 IV区结合,阻 止核糖体的进入,从而抑制依赖IRES的HCV的翻译起始,使病毒增殖能力丧失,达到防治该 病毒病的目的。对PV IRES元件的突变可以使PV在神经细胞中的增殖效率大大降低,从而 获得其弱毒株,这是制备重组型减毒疫苗的前提条件。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抗病毒药物筛选的方法,从而可以通过简单的指 标进行高效的抗病毒药物的筛选。本发明利用IRES可以介导不依赖于帽子结构的特点,构建双荧光蛋白报告质粒, 病毒IRES活性区的序列插入二个荧光报告基因中间。其第一个为正常的翻译方式所表达的荧光蛋白A,第二个荧光蛋白B的表达则依靠其上游插入的病毒IRES活性区。这样荧光 蛋白B与荧光蛋白A的相对值就可以定性或定量地反映病毒IRES依赖的翻译强弱。以这 样的质粒转染到哺乳动物细胞中,荧光蛋白B的表达则可作为病毒活性的指标。而一个药 物能够抑制B的表达的强弱,则很容易通过荧光显微镜或流式细胞仪进行定性或定量的检 测到,其结果也间接反映了改药对插入的IRES序列所属病毒抑制能力的强弱。稳定转染该 质粒的细胞可以大规模培养到96孔板中,用于大规模的抗该病毒的药物的筛选。本发明所述的抗病毒药物筛选的方法,主要为利用不同的荧光蛋白作为报告基 因,监控病毒含内部核糖体进入元件的5’ -非编码区指导的翻译活性。以翻译产物的荧光 强弱作为药物筛选的指标本发明所述方法特征在于,以含内部核糖体进入元件的病毒mRNA5’ -非编码区指 导的翻译活性作为评价药物抗病毒的活性并以荧光蛋白作为报告基因。以荧光蛋白表达的 强弱作为评价抗病毒活性的低或高。本发明的优点是以病毒mRNA5’ -非翻译区所介导的翻译水平的高低作为评价病 毒活性的强弱,进而作为抗病毒药物筛选的定性或定量指标。该方法使得抗病毒药物的筛 选指标得以简化,使得抗病毒药物筛选的速度大大提高。


图1、实施例中所用的各种质粒示意2、pG-R及PG-EMCV-R转染细胞48小时后不同荧光滤镜下的观察结果。图3、pR-G及pR-EMCV-G转染细胞48小时后不同荧光滤镜下的观察结果。实施例1以绿色荧光蛋白EGFP为第一个荧光报告基因、红色荧光蛋白DsRed为第二个荧光 蛋白报告基因中间插入EMCV IRES活性结构序列的pCI-EGFP-EMCV-DsRed监控质粒的构建 及转染(该稳定转染株可以用于拮抗EMCV病毒的药物筛选)。以 Ivitrogen 的 pDsRed-Nl 为模板,以正向引物 5,-CTATCTAGAACCATGGTGCGCTCC TC-3,,反向引物 5,-AATGCGGCCGCTACAGGAACA-3,进行 PCR 扩增(退火温度 62°C 53°C ) DsRed基因,PCR产物经Xba I和Not I双酶切后,插入已行相应酶切的表达载体pCI_EGFP 中,获得PCI-EGFP-DsRecK图1)质粒,简写为pG_R。以 Ivitrogen 的 pIRES2_EGFP 为模板,以正向引物 5,-ATACTTCTAGACGCCCC TCTCCCTCCCCC-3,,反向弓丨物 5, -TTCTTGGAGGAGCGCACCATGGTTGTGGCCATA TTATCAT-3, 进行PCR扩增(退火温度65 V 59 V )EMCV 5,-UTR基因;同样以pDsRed-Nl为模 板,以正向引物 5,-ATGATAATATGGCCACAA CCATGGTGCGCTCCTCCAAGAA-3,,反向引物 5,-AATGCGGCCGCTACAGGAACA-3,进行 PCR 扩增(退火温度 65 V 59°C ) DsRed 基因。将两 者PCR产物按一定比例混合后进行重叠PCR拼接(94°C 3min,95°C 30s,62°C 59°C 30s, 72°C 90s, IOcycles, 72°C IOmin),加入pIRES2_EGFP 的正向引物和 pDsRed-Nl (Invitrogen) 的反向引物进行 PCR 扩增(94 °C 3min,95°C 30s,62 °C 53 °C 30s, 72 °C 2min, 30cycles, 72°C IOmin) ,EMCV 5,_UTR和DsRed的重叠PCR产物经Xba I和Not I双酶切后,插入已行相 应酶切的表达载体pCI-EGFP中,获得pCI-EGFP-EMCV-DsRed质粒(图1),简称pG-EMCV-R。 将293细胞按2. 2 X 105个/孔铺6孔板,24h后按照脂质体Lipfection 2000说明书,每孔
48 μ g质粒转染细胞,4 他后更换完全培养液,48h后于倒置荧光显微镜下进行观察 (图 2)。实施例2以红色荧光蛋白DsRed为第一个荧光报告基因、绿色荧光蛋白EGFP为第二个荧光 蛋白报告基因中间插入EMCV IRES活性结构序列的pCI-DsRed-EMCV-EGFP监控质粒的构建 及转染(该稳定转染株可以用于拮抗EMCV病毒的药物筛选)。以 hvitrogen 公司的 pEGFP-Nl 为模板,以正向引物 5,-CTATCTAGAACCATGGTGAGC AAGG-3,,反向引物 5,-AATGCGGCCGCTTACTTGTACAGC-3,进行 PCR 扩增(退火温度 55 "C 47°C )EGFP基因,PCR产物经)(ba I和Not I双酶切后,插入已行相应酶切的表达载体 pCI-DsRed 中,获得 pCI-DsRed-EGFP 质粒(图 1),简称 pR_G。pCI-EGFP-DsRed质粒经)(ba I和Nhe I双酶切后回收pCI-DsIted片段,该片段自身 连接获得PCI-DsRed载体,质粒pIRES2-EGFP经Not I酶切后获得EMCV-EGFP重叠片段,将 该片段插入已行相应酶切的表达载体pCI-DsRed中,获得pCI-DsRed-EMCV-EGFP质粒(图 1),简称 pR-EMCV-G。将293细胞按2. 2 X 105个/孔铺6孔板,24h后按照脂质体Lipfection 2000说 明书,每孔8 μ g质粒转染细胞,4 他后更换完全培养液,48h后于倒置荧光显微镜 下进行观察(图3)。
权利要求
1.一种新的抗病毒药物筛选的方法,该方法为在利用荧光蛋白作为报告基因,监控病 毒含内部核糖体进入元件的5’-非编码区指导的翻译活性。以翻译产物的荧光强弱作为药 物筛选的指标。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,以含内部核糖体进入元件的病毒mRNA5’-非 编码区指导的翻译活性作为评价药物抗病毒的活性的依据。
3.如权利要求2所述,其特征在于,以荧光蛋白作为报告基因。
4.如权利要求3所述,其特征在于,以荧光蛋白表达的强弱作为评价抗病毒活性的低或高。
全文摘要
本发明涉及一种新的抗病毒药物筛选的方法。大部分病毒在侵染人体细胞的过程中会抑制体细胞正常的5‘-帽子结构依赖的翻译方式,而启动依赖病毒mRNA5’-非翻译区含有的内部核糖体进入元件(IRES)的翻译方式。本方法利用病毒的这一特性,以病毒mRNA5’-非翻译区IRES所介导的翻译水平的高低作为评价病毒活性的强弱,进而作为抗病毒药物筛选的指标。该方法使得抗病毒药物的筛选指标得以简化并同时可以对药物抗病毒活性进行定性或者定量评价,使得抗病毒药物筛选的速度大大提高。
文档编号C12Q1/68GK102121053SQ201010580148
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者储敏, 朱瑞宇, 李英, 蔡燕飞, 金坚, 陈建青, 陈蕴 申请人:江南大学
再多了解一些
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