专利名称：抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法、表达的抗内毒素短肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白表达技术领域，特别涉及蛋白在毕氏酵母中的诱导表达技术领域，具体是指一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法、表达的抗内毒素短肽及应用。
背景技术：
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁层上的特有结构-脂多糖，有多糖0抗原、核心多糖和类脂A组成，细菌在生活状态时不释放出来，当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时， 才表现其毒性，其主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了 1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来(蒋建新主编，细菌内毒素基础与临床，人民军医出版社)。内毒素是感染性休克及一系列并发症的主要致病因子，在许多病理生理过程中越过肠黏膜屏障入血，形成内毒素血症(endotoxeamia，ETM)，在内毒素性休克 (即感染性休克)、弥漫性血管内凝血、多系统器官功能衰竭等临床危症的发病机制中起重要作用。内毒素毒性作用机理除本身的直接作用外，主要是作用靶细胞诱导释放肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、干扰素(TNF)和氧自由基(OFR)等一系列细胞因子，从而导致多种炎性介质参与的级联反应。全球每天有1400例病人死于重度脓毒血症，起因于感染引起的全身炎症反应综合征，它会迅速导致器官衰竭，最终死亡(高斌，严玉霖，高洪，抗内毒素治疗研究现状， 2004，5，中兽医医药杂志)。仅在欧盟的重症监护室中，每年有135，000例病人死于重度脓毒血症与感染性休克(重度脓毒血症伴随低血压)，其治疗费用约76亿美元。在欧洲，重度脓毒血症的死亡率与肺癌、乳腺癌及结肠癌基本持平。在美国，每年有750，000例脓毒症患者，而因其死亡病例超过200，000 (Dongxu Liu et al，Cl Inhibitor-Mediated Protection from Sepsis, 2007, J Immu，179 :3966-3972)，在我国，随着经济发展和医疗技术的进步，严重创伤、外科大手术后出现的脓毒症、感染性休克及多器官功能障碍综合症的患病率仍高达30% -60% (詹芝规，PAI-I基因多态性与脓毒血症的研究进展，2007，中国热带医学，7 8)。内毒素进入体内后，首先与血浆中的脂多糖结合蛋白(LBP)结合形成复合物，在 LBP的介导下通过单核细胞、巨噬细胞等表面的MD2分子，与脂多糖受体CD14结合，通过 TLR4传递信号激活单核细胞、巨噬细胞等释放一系列炎症细胞因子，引起组织损伤及休克的发生。抗内毒素药物研究已是近十多年来国际医药学界研究最为活跃的领域之一，随着分子免疫学的发展及对内毒素休克发病机理的研究，市场上也出现了许多药物来阻断其发病过程，这些药物主要分为以下几个方面1、抗体类药物1. 1针对核心糖脂的多克隆抗体早期用加热灭活的大肠杆菌J5免疫兔产生抗内毒素多克隆抗血清用于拮抗大肠杆菌、绿脓杆菌的感染，结果发现感染性休克的发病率显著下降，但机体没有产生免疫记忆，且抗体滴度又无法控制而限制了此类抗体没能在临床推广。1. 2针对核心糖脂的单克隆抗体改种抗体有两种，都是由煮沸的J5疫苗免疫而获得，只是免疫的宿主分别是人和小鼠，但该抗体存在种属特异性及费用昂贵，人们不得不对其疗效及安全性做进一步的评价(DerkxB et al,Randomized placebocontrolled trial of HA-1A,a human monoclonal antibody to endotoxin, in children with meningococcal septic shock, Clin Infect Dis,1999,28(4) :770-777 ；Angus DC et al, E5 murinemonoclonal antiendotoxin antibody in gram-negative sepsis -.a randomized controlledtrial. J ΑΜΑ, 2000, 283(13) :1723-1730)。1.3抗LBP的抗体LBP介导LPS与⑶14的结合，是肝脏合成的一种急性期血清蛋白。动物实验发现，预防性给予抗LBP抗体能保护小剂量内毒素的损害，但不能改善大剂量内毒素造成的损伤，因为LPS在大剂量通过非依赖LBP途径刺激细胞应答，所以抗LBP抗体在内毒素造成的损伤预防中的作用非常有限(Schutt C et al, Fighting infection :the role of lipopolyscaccharide bindingproteins CD14 and LBP, Pathobiology, 1999,25(5) 435-444)。1.4 抗 CD14 抗体⑶14在LPS介导的炎症发生途径中起重要作用，但同LBP —样，LPS存在着不依赖 CD14/LBP途径的致炎症途径，故在大剂量的LPS情况下，抗CD14抗体的作用是非常有限的 (riantafilou M et al, Rough and smooth forms of fluorescein-labelled bacterial endotoxinexhibit CD14/LBP dependent and independent binding that is influenced by endotoxinconcentration. Eur J Biochem，2000，267(8) :2218-2226)。2、内毒素拮抗剂类药物2.1类脂A结构类似物脂多糖的致病作用主要在类脂A部分，而类脂A的生物合成前体物质及无毒类脂 A均能与内毒素竞争结合LBP，从而抑制了巨噬细胞等的活化。类脂IVA就是大肠杆菌类脂A的双糖前体分子，它与LPS竞争结合TLR4/MD2，而类脂IVA与TLR4/MD2复合物结合后并不能引起TLR4的聚集而激活下游反应，对内毒素有较强的拮抗作用(Siin-ichiroh Saitoh,Sachiko Akashi et al,Lipid A antagonist,lipid Iva,is distinct from lipid A in interaction withToll-like receptor 4(TLR4)-MD2 and ligand-induced TLR4 oligomerization. 2004，16 (7) :961-969)，但仍然不能阻止大剂量的LPS通过不依赖与该途径的致炎症作用。2.2抗内毒素蛋白及多肽抗内毒素蛋白和多肽具有杀菌、内毒素的中和、抑制免疫细胞的激活、补体的活化等作用。主要有杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)，由多型核白细胞分泌，能与内毒素有高度亲和性，能中和内毒素活性，增加细菌壁的通透性，并杀死细菌。Amit Srivastava 等报道rBPI21具有良好的抗内毒素作用(Amit Srivastava, Richard Malley et al, RecombinantBactericidal/Permeabi1ity-Increasing Protein Rbpi21 Protects against Pneumococcal Disease, 2007, Infect Immu,75(l) :342-349)。目前美国 FDA 已批准rBPI21/rBPI23进行扩大的三期临床实验，但是针对BPI蛋白是小分子多肽，易于被肝脏或肾脏排泄，生物半衰期不足1小时，存在用量大、成本高难以广泛应用到临床，同时光滑型细菌对其敏感性差等问题。另一种抗内毒素蛋白是从美洲鲎中提取的单链多肽(LALF)， 体外能能抑制LPS诱导人内皮细胞和鼠脾细胞的生物活性。2.3多阳离子结构拮抗剂内毒素分子含大量磷酸基，因此带有大量负电荷，Dand等对在内毒素拮抗剂的研究中发现，带正电荷基团的药物就是通过其正电荷基团与内毒素类脂A上的磷酸基团的负电荷形成共价键，引起内毒素的结构变化从而起到拮抗效果。例如多粘菌素B(PMB) 为一种多价阳离子环肽抗生素，可直接与类脂A部分特异性结合而使其失去活性，但由于该药抗菌谱广，且对神经系统和肾脏均有毒副作用而限制了它的使用。由于来自天然的蛋白质虽然有较好的抗内毒素活性，但存在着这样或那样的副作用，于是A. Hoess等通过对LALF、LBP、BPI、PMB中与脂多糖结合部位氨基酸序列的比对，阐述该部位的机构特点，希望利用计算机辅助设计短肽来拮抗内毒素的活性(A.HoeSS，R. Liddington et al, Crystal structure of anendotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1. 5 A resolution. 1993，EMBO, 12(9) :3351-3356)； Vladimir Frecer等根据短肽与LPS作用机制，通过计算机辅助设计了一系列多肽，通过实验证实能与LPS作用的最短且最大亲和力的短肽应具备BHPHB或BHBHB这样的结构模式(B是碱性氨基酸残基，H是疏水性氨基酸残基，P是中性氨基酸残疾(Vladimir Frecer et al, Interpretation of biological activity data of bacterial endotoxins by simpIemoIecuIar models of mechanism of action. 2000,Eur. J. Biochem, 267 :837-852), XU Z等通过噬菌体展示库来筛选抗内毒素的模拟肽(Xu Z et al, Screening of mimetic peptides for CD14 bindingsite with LBP and antiendotoxin activity of mimetic peptide in vivo and in vitro. 2009, Inflam Res, 58(1) :45-53)。而人血清白蛋白(BSA) 经常用来与短肽融合表达，这样有助于提高表达量和延长多肽药物在体内的半衰期，并且在体内不会产生抗原反应。补体cl抑制剂(cl inhibitor, ClINH)是血浆中重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpins)家族成员之一，最初于1957年由Ranoff和1印ow发现，单肽链糖蛋白，由478个氨基酸残基组成，含糖量高达35% -49%。Cl抑制剂在调节血管通透性及炎症抑制发挥重要作用，其次在凝血、激肽和纤溶系统是血液中也有重要的调节作用，而且还是血液中唯一的补体抑制剂。Cl抑制剂肽链内有两对二硫键，形成反应中心环。链上有约20个侧糖链， 大多数糖基位于肽链的N末端1-113肽段内，组成棒状尾部结构区，无丝氨酸蛋白酶抑制功能，C端由365个氨基酸残基组成，具有丝氨酸蛋白酶抑制功能。1991年，Bone RC报道脂多糖是内毒素休克的主要病理因子，通过激活补体系统等发挥作用(Bone, R. C. The pathogenesis of sepsis. 1991，Ann Intern Med，115 :457)，后来人们发现Cl抑制剂能够有效的保护内毒素诱导的炎症作用(Triantaphyllopoulos， D. C.，and Μ. S. Cho. Effect of injection of Cl inactivator on the platelet count and blood coagulation in rabbits infusedwith endotoxin. 1986, Thromb. Haemostasis 55 293 ；Guerrero,R. ,F. et al,Endotoxin-inducedpulmonary dysfunction is prevented by Cl-esterase inhibitor. 1993，J. Clin. Invest.91 :2754 ；Scherer, R. U et al，The influence of Cl-esterase inhibitor substitution on coagulation and cardiorespiratoryparameters in an endotoxin—induced rabbit model of hypercoagulability. 1996，Semin. Thromb. Hemostasis 22 :357)，在对 Cl 抑制剂的结构生物学进行深入研究发现，其反应中心环被打断后，抗内毒素生物活性反而比完整的Cl抑制剂更高(Dongxu Liu et al, Cl Inhibitor PreventsEndotoxin Shock Via a Direct Interaction with Lipopolysaccharide. 2003，J. Immunol. 171 :2594-2601)，说明 Cl 抑制剂的空间结构阻碍了其与LPS的作用，并且其活性主要在Cl抑制剂的N端，且N端的糖基化修饰对抗内毒素活性有正调控作用(Dongxu Liu et al, N-LinkedGlycosylation Is Required for Cl Inhibitor-Mediated Protection from Endotoxin Shock in Mice.2005，Infect Immun,72(4) :1946-1955 ；Dongxu Liu et al,N-Linked Glycosylation at Asn and thePositively Charged Residues within the Amino-Terminal Domain of the Cl Inhibitor Are Requiredfor Interaction of the Cl Inhibitor with Salmonella enterica Serovar TyphimuriumLipopolysaccharide and Lipid A. 2004， Infect Immun，73(8) :4478-4487)。而后通过胰蛋白酶处理Cl抑制剂，得到其N端多肽， 从中筛选了 13条多肽进行生物活性研究，发现N端18-30这一段残基有较强的抗内毒素活性，其中含有三个带正电荷的氨基酸残基(Dongxu Liu et al，Anmti-endotoxin peptide that generates from the amino-terminaldomain of complement regulatoryprotein Cl inhibitor. 2007，Biochem and Biophys Res Commu，359 :285-291)。但到目前为止，还没有关于该多肽类的抗内毒素药物上市。综上所述，目前抗内毒素治疗的方法有限，国内外暂时没有一种疗效明显、毒副作用底、价格低廉的抗内毒素感染药物，而已经进入临床的药物如BPI21、BPU3均釆用脯乳动物细胞(Chinese hamster ovary cells or human kidney cell line)表达 (Patrick W. Gray et al，Cloning of thecDNA of a Human Neutrophil Bactericidal Protein. 1990,J. Biolo Chem，264(16) :9505-9509 ;J. Weiss et al,Human Bactericidal/ Permeability- increasing Protein and a RecombinantNH2-Terminal Fragment Cause Killing of Serum-resistant Gram-negative Bacteria in Whole Bloodand Inhibit Tumor Necrosis Factor Release Induced by the Bacteria. 1992，J. Clin. Invest90 1122-1130)，产量底，价格昂贵，而一些与Fc等蛋白融合表达也只是处于实验阶段，所以急需一种高活性而生产价格低廉的抗内毒素药物来满足市场需求。因此，需要提供一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其可以高效高活性地表达抗内毒素短肽。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法、表达的抗内毒素短肽及应用，该诱导表达方法设计巧妙，从而可以高效高活性地表达抗内毒素短肽，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特点是，将经过密码子优化的编码抗内毒素短肽的核苷酸序列构建入毕赤酵母诱导表达载体中，然后转入毕赤酵母进行诱导表达，获得所述抗内毒素短肽。显然，采用上述方法可以表达任何感兴趣的抗内毒素短肽。较佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO 1所示的序列、如SEQ ID NO 4所示的序列或如SEQ ID NO 7所示的序列。毕赤酵母诱导表达载体可以选择任意的毕赤酵母诱导表达载体，均可以实现本发明。较佳地，所述毕赤酵母诱导表达载体是pHBM905a。毕赤酵母也可以选择任意的毕赤酵母株，均可以实现本发明。较佳地，所述毕赤酵母是毕赤酵母GS115。为了使表达的抗内毒素短肽纯度更高，较佳地，在获得所述抗内毒素短肽后，所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法还包括采用离子交换层析法纯化所述抗内毒素短月太。在本发明的第二方面，提供了一种抗内毒素短肽，其特点是，采用上述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法制备而成。在本发明的第三方面，提供了上述的抗内毒素短肽在制备抗内毒素药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法是将经过密码子优化的编码抗内毒素短肽的核苷酸序列构建入毕赤酵母诱导表达载体中， 然后转入毕赤酵母进行诱导表达，获得所述抗内毒素短肽，表达量可达约100mg/l ；所述抗内毒素短肽经体外结合实验、细胞实验和动物模型实验表明在体外能很好的和LPS直接作用，能有效抑制LPS由LBP介导的与巨噬细胞膜表面的⑶14结合，能明显抑制LPS的致炎症作用，设计巧妙，从而可以高效高活性地表达抗内毒素短肽，适于大规模推广应用。
图1是质粒pHBM90fe的质粒图谱示意图。图2是毕赤酵母诱导表达载体pHBM90feCN197的图谱示意图。图3是毕赤酵母诱导表达载体pHBM905aCN4M的图谱示意图。图4是毕赤酵母诱导表达载体pHBM90feCN1432HSA的图谱示意图。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。实施例1 pHBM905aCN197表达载体的构建和表达1、抗内毒素短肽的核酸密码子的优化及合成在Genebank中查找ClINH的蛋白质序列，选取感兴趣的一段氨基酸，通过网站 http://helix.nih. gov根据毕氏酵母密码子偏爱性优化核酸密码子并全序列合成获得 CN197核酸序列(即SEQ ID NO 1所示的序列)。并通过Genetool软件设计两端引物Pl和P2分别引入BioI和NotI限制性内切酶位点，其中Pl ^y-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT AACCCAAACGCTACTTCCTCTTCTT-，3 (即 SEQ ID NO 2所示的序列)P2 :5，-ATAGCGGCCGCTTAAGTTGTTGGTTGCGTTGGTGAATCGG-' 3 (即 SEQ ID NO 3 所示的序列)画线部分分别是BioI和NotI限制性内切酶位点。采用Pl和P2对上述序列进行PCR扩增，50ul PCR反应体系如下5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)IOuldNTP Mixture (各 2. 5mM)6ul引物 PlIul引物 P2IulddH2031. 5ulPrimeSTAR HS DNA polymerase (2. 5u/ul) 0. 5ul反应条件变性98°C，10秒；退火580C，15秒；延伸72°C，30秒；28个循环，72°C延伸1分钟。2、pHBM905aCN197表达载体的构建本实施例采用的表达载体是pHBM905a，是将载体pPIC9K改造而得，其质粒图谱见图1。具体通过如下步骤改造后得到质粒pHBM905a 1.先用BglII消化质粒pPIC9K，去掉AmpR和pBR322片段，然后自连形成质粒 PPIC9K1，再设计引物，两端都加上限制性核酸内切酶位点，扩增该片段；2. 1中扩出的片段和质粒PPIC9K1分别用MlI限制性核酸内切酶作用，再连接形成质粒pPIC9K2 ；3.将质粒PPIC9K1中的KanR基因片段切掉连在多克隆位点，即形成质粒 pHBM905ao将上述PCR获得的片段回收纯化后用BioI和NotI酶切，同时pHBM90fe也采用 XhoI和NotI酶切，然后两酶切片段连接，从而将CN197核酸序列构建入pHBM90feCN197，最后得到pHBM90feCN197表达载体，见图2。3、抗内毒素短肽的诱导表达构建好的pHB90feCN197表达载体用Mil酶切将质粒线性化，同时也去掉了载体上的抗性基因AmpR，然后通过电转化毕氏酵母GS115，挑选阳性克隆，进行诱导表达筛选； 采用下列方法进行鉴定(I)SDS-PAGE 电泳检测；(2) Dot Blot ； (3) Western blotting ； (4) 测序，并筛选出表达量较高的鉴定序列正确的重组菌(约100mg/l)。4、抗内毒素短肽的纯化因为抗内毒素短肽上没有加标签蛋白，主要采用离子交换层析法纯化所表达的抗内毒素短肽，纯化后纯度达到90%以上。5、生物活性研究1、抗内毒素短肽与LPS的体外结合实验1)采用ELISA法证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2)采用非变性蛋白质电泳证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2、细胞实验1)在正常培养小鼠巨噬细胞系中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；2)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；3)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；4)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；5)在正常培养人周围血白细胞中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；6)在正常培养人周围血白细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；3、动物模型实验1)实验对象为C57BL/6J小鼠(6_8W，18_22g)，采取i. ρ注射最低致死剂量的 LPS (20mg/kg)，在48小时内全部死亡；2)短肽分别采用i. ρ或i. ν注射5mM的抗内毒素短肽，观察M小时、48小时、72 小时、96小时、120小时、144小时、168小时小鼠的存活率，存活率在60-80%。3)收集被处理过的小鼠腹水细胞，采用ELISA分析TNF- α的分泌水平，TNF- α浓度控制在 200-300pg/ml。4)收集被处理过的小鼠腹水细胞，采用Wfestern blotting分析TNF- α的分泌水平，TNF-α 浓度控制在 200-300pg/ml。实施例2 pHBM905aCN454表达载体的构建和表达1、抗内毒素短肽的核酸密码子的优化及合成以SEQ ID NO 1序列为模板通过Genetool软件设计引物P3和P4，扩增片段CN4M 核酸序列(即SEQ ID NO 4所示序列)。P3 5' -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGTCTACAAGACAGAGGTGAAGGTAAGGTTG-3' (即SEQ ID NO 5所示的序列)P4 5' -ATAGCGGCCGCTTAggtagcagagttagtcgtagagttcgtcg-3' ( S卩 SEQ ID NO 6所示的序列)画线部分分别是BioI和NotI限制性内切酶位点。50ul PCR反应体系如下
5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)dNTP Mixture (各 2. 5mM)
IOul 6ul Iul Iul 31. 5ul引物 P3引物 P4ddH20PrimeSTAR HS DNA polymerase(2. 5u/ul) 0. 5ul反应条件预变性98°C，10秒；变性98°C，10秒；退火58°C，15秒；延伸72°C，30秒；28个循环，72 °C延伸1分钟。2、pHBM905aCN454表达载体的构建pHBM905aCN454表达载体的构建同实施例1，只是目的片段CN197核酸序列换成 CN454核酸序列，从而得到pHBM905aCN4M表达载体，见图3。3、抗内毒素短肽的诱导表达构建好的pHBM905aCN4M表达载体用Mil酶切将质粒线性化，同时也去掉了载体上的抗性基因AmpR，然后通过电转化毕氏酵母GS115，挑选阳性克隆，进行诱导表达筛选； 采用下列方法进行鉴定(I)SDS-PAGE 电泳检测；(2) Dot Blot ； (3) Western blotting ； (4) 测序，并筛选出表达量较高的鉴定序列正确的重组菌(约100mg/l)。4、抗内毒素短肽的纯化因为抗内毒素短肽上没有加标签蛋白，主要采用离子交换层析法纯化所表达的抗内毒素短肽，纯化后纯度达到90%以上。5、生物活性研究1、抗内毒素短肽与LPS的体外结合实验1)采用ELISA法证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2)采用非变性蛋白质电泳证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2、细胞实验1)在正常培养小鼠巨噬细胞系中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；2)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；3)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；4)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；5)在正常培养人周围血白细胞中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽(l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；6)在正常培养人周围血白细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；3、动物模型实验1)实验对象为C57BL/6J小鼠(6_8W，18_22g)，采取i. ρ注射最低致死剂量的 LPS (20mg/kg)，在48小时内全部死亡；2)短肽分别采用i. ρ或i. ν注射5mM的抗内毒素短肽，观察M小时、48小时、72 小时、96小时、120小时、144小时、168小时小鼠的存活率，存活率在60-80%。3)收集被处理过的小鼠的腹水细胞，采用ELISA分析TNF-α的分泌水平，TNF-a 浓度控制在200-300pg/ml ；4)收集被处理过的小鼠的腹水细胞，采用Wfestern blotting分析TNF-α的分泌水平，TNF-α浓度控制在200-300pg/ml。实施例3 pHBM905aCN1432HSA表达载体的构建和表达1、抗内毒素短肽的核酸密码子的优化及合成在Genebank中查找ClINH的蛋白质序列和HSA的核酸序列，在ClINH的N端选取感兴趣的一段氨基酸，并结合HSA序列，通过网站http://helix.nih. rov根据毕氏酵母密码子偏爱性优化核酸密码子并全序列合成获得CN1432HSA核酸序列(即SEQ ID N0:7所示的序列)。。并通过Genetool软件设计两端引物P5和P6分别引入BioI和NotI限制性内切酶位点，其中P5 :5，-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGTCTAC-3'(即 SEQ ID NO :8 所示的序列)P6 :5，-TTCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3‘(即 SEQ ID NO 9 所示的序列)画线部分分别是BioI和NotI限制性内切酶位点。采用P5和P6对上述序列进行PCR扩增，50ul PCR反应体系如下5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)IOul
0126]dNTP Mixture (各 2. 5mM)6ul
0127]引物 P5Iul
0128]引物 P5Iul
0129]ddH2031. 5ulPrimeSTAR HS DNA polymerase(2. 5u/ul)0. 5ul反应条件变性98°C，10秒；退火58°C，15秒；延伸72°C，30秒；观个循环，72°C延伸1分钟。2、pHBM905aCN1432HSA 表达载体的构建pHBM90feCN1432HSA表达载体的构建同实施例1，只是目的片段CN197核酸序列换成CN1432HSA核酸序列，从而得到pHBM90feCN1432HSA表达载体，见图4。3、抗内毒素短肽的诱导表达
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构建好的pHBM90feCN1432HSA表达载体用Mil酶切将质粒线性化，同时也去掉了载体上的抗性基因AmpR，然后通过电转化毕氏酵母GS115，挑选阳性克隆，进行诱导表达筛选；采用下列方法进行鉴定(I)SDS-PAGE电泳检测；(2) Dot Blot ； (3) Western blotting ； (4)测序，并筛选出表达量较高的鉴定序列正确的重组菌(约100mg/l)。4、抗内毒素短肽的纯化因为抗内毒素短肽上没有加标签蛋白，主要采用离子交换层析法纯化所表达的抗内毒素短肽，纯化后纯度达到90%以上。5、生物活性研究1、抗内毒素短肽与LPS的体外结合实验1)采用ELISA法证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2)采用非变性蛋白质电泳证实所表达的抗内毒素短肽在体外能很好的和LPS直接作用；2、细胞实验1)在正常培养小鼠巨噬细胞系中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；2)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；3)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS (lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；4)在正常培养原代小鼠巨噬细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；5)在正常培养人周围血白细胞中加LPS(lmg/ml)和同时加LPS及抗内毒素短肽 (l-100mg/ml)，培养一段时间后，采用FACS检测，证明抗内毒素短肽能有效抑制LPS由LBP 介导的与巨噬细胞膜表面的CD14结合；6)在正常培养人周围血白细胞中加LPS和同时加LPS及抗内毒素短肽 (0. 05-lmM)，培养一段时间后，采用ELISA或Wfestern blotting分析巨噬细胞分泌TNF-α 的量，证实抗内毒素短肽能明显抑制LPS的致炎症作用；3、动物模型实验1)实验对象为C57BL/6J小鼠(6_8W，18_22g)，采取i. ρ注射最低致死剂量的 LPS (20mg/kg)，在48小时内全部死亡；2)短肽分别采用i. ρ或i. ν注射5mM的抗内毒素短肽，观察M小时、48小时、72 小时、96小时、120小时、144小时、168小时小鼠的存活率，存活率在60-80%。3)收集被处理过的小鼠的腹水细胞，采用ELISA或狗8{6111 blotting分析TNF-α 的分泌水平，TNF-α浓度控制在200-300pg/ml ；4)收集被处理过的小鼠的腹水细胞，采用Wfestern blotting分析TNF-α的分泌水平，TNF-α浓度控制在200-300pg/ml。从上可以看出，采用本发明的方法表达的抗内毒素短肽的表达量高，可达约 100mg/l ；在体外能很好的和LPS直接作用，能有效抑制LPS由LBP介导的与巨噬细胞膜表面的⑶14结合，能明显抑制LPS的致炎症作用。综上，本发明的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法设计巧妙，从而可以高效高活性地表达抗内毒素短肽，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特征在于，将经过密码子优化的编码抗内毒素短肽的核苷酸序列构建入毕赤酵母诱导表达载体中，然后转入毕赤酵母进行诱导表达，获得所述抗内毒素短肽。
2.根据权利要求1所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特征在于， 所述核苷酸序列是如SEQ ID NO :1所示的序列、如SEQ ID NO :4所示的序列或如SEQ ID NO: 7所示的序列。
3.根据权利要求1所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特征在于， 所述毕赤酵母诱导表达载体是pHBM905a。
4.根据权利要求1所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特征在于， 所述毕赤酵母是毕赤酵母GS115。
5.根据权利要求1所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特征在于， 在获得所述抗内毒素短肽后，所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法还包括采用离子交换层析法纯化所述抗内毒素短肽。
6.一种抗内毒素短肽，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法制备而成。
7.根据权利要求6所述的抗内毒素短肽在制备抗内毒素药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法，其是将经过密码子优化的编码抗内毒素短肽的核苷酸序列构建入毕赤酵母诱导表达载体中，然后转入毕赤酵母进行诱导表达，获得所述抗内毒素短肽，较佳地，核苷酸序列是如SEQ ID NO1所示的序列、如SEQID NO4所示的序列或如SEQ ID NO7所示的序列，毕赤酵母诱导表达载体是pHBM905a，毕赤酵母是毕赤酵母GS115，还提供了上述方法制备的抗内毒素短肽及应用。本发明的抗内毒素短肽在毕氏酵母中的诱导表达方法设计巧妙，从而可以高效高活性地表达抗内毒素短肽，适于大规模推广应用。
文档编号C12N1/19GK102559524SQ201010585889
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘东旭, 杨小松 申请人:刘东旭, 杨小松