专利名称：植物耐低温蛋白tcf1及编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及1种植物耐低温蛋白TCFl及编码基因和相关转基因应用。
背景技术：
温度是植物生长发育所必需的环境因子，影响植物生长发育的所有过程，也是限制作物产量和分布的一个主要因素。冷害引起粮食作物大幅度减产是世界范围内普遍存在的问题。据估计，每年全世界仅用于减轻霜冻的危害就需要花费数亿美元(Pearce 1999)。 因此，阐明植物抗寒的机理，不仅有着重要的科学理论意义，而且具有重要的应用价值。在过去的20年中，由于模式植物的利用和相关功能基因的发现，使得我们在对植物抗逆如抗旱、盐碱分子机制的研究方面取得了很多突破性的进展。但是与植物抗旱和抗盐碱的分子机制的研究相比，对植物抗冷机理的研究相对滞后，用生物技术培育抗冷作物新品种的工作也比较落后。长期以来，人们主要用传统遗传育种的方法对农作物的抗逆性进行改良，然而这种方法具有效率低、周期性长的缺点，并且随着长期的使用其效果越来越不明显。利用转基因技术将抗逆相关基因转化到农作物中是提高其抗逆性的一个更直接有效的途径和必然趋势。因此，采用正反向遗传学和综合现代生物技术的研究方法，加快克隆植物感受冷信号及信号转导途径的重要基因，理解这些基因的功能和调控的网络的工作就变得非常紧迫。在植物受到冷胁迫后，染色质发生多种变化(Cheung P et al 2000 ；Rea S et al 2000 ；Stefanowska M et al2002 ；He Y et al 2003 ；Bastow R et al 2004 ；Kumar and Wigge 2009)，如组蛋白的修饰，组蛋白与DNA的结合情况，从而调控相关基因表达，影响蛋白质与代谢物质的合成与降解，使植物体内重新恢复物质和能量代谢平衡，帮助植物应对冷胁迫，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受低温胁迫诱导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对低温胁迫的抗性(Xin and Browse 2000)。与低温胁迫相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物低温等胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与低温胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等(Liu et al 2000)。目前，在冷驯化中起重要作用的基因已经在模式植物拟南芥中被克隆，并且转化到植物中提高了转化植株的冷耐受能力(Jaglo-Ottosen et al 1998 ；Gilmour et al 2000)，其中研究的最为清楚的是以拟南芥的CBFS(CRT-binding factorl)转录因子为代表，包括CBFs的上下游发挥功能的各个基因所介导的冷信号通路；但是除了 CBFs转录因子介导的冷信号通路外，其他独立于CBFs转录因子之外的冷信号通路的研究也取了一些进展(Zhu et al 2004 ；Xin et al 2007 ；Zhu et al 2008)；另外利用拟南芥同源克隆在农作物中克隆出大量基因，以及在作物中克隆的一些冷相关基因(Worrall D et all998 ；Fan Y et al 2002 ；Guo et al 2007)转化农作物均提高其冷耐受能力，这些进展不仅丰富了植物冷信号通路，而且为农作物育种提供思路，使得植物抗冷机制方面的研究深入到分子水平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合，达到用生物技术来探索和改进植物生长特性，提高植物对低温适应能力的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐低温蛋白TCFl及编码基因和相关转基因应用。本发明提供的蛋白质，来源于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，命名为 TCFl，为一种人类 RCCl (Regulator of chromosome condensation 1)蛋白的同源蛋白。 TCFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列1中TCFl蛋白质由488个氨基酸残基组成，含有6个RCCl重复结构域，人类的RCC1(NP_00U60)蛋白含有7个RCCl重复结构域，TCFl蛋白与RCCl蛋白具有类似的功能结构域分布(图1)。将TCFl蛋白质序列在Genabnk上进行比对，发现TCFl蛋白与植物物种同源蛋白序列具有较高一致性，如与葡萄有67%的一致性，与蓖麻有68%的一致性， 与水稻有61%的一致性，与高粱有63%的一致性，与杨树有57%的一致性，与小立碗藓有 52 %的一致性，而与人类RCCl蛋自仅有37 %的一致性。为了使TCFl蛋白便于纯化与检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
标签’残基序列GST231MSP1LGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDE GDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYI ADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYS KDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHV THPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIE AIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDL EVLFQGPLGSC-myc10EQKLISEEDL编码所述蛋白的基因TCFl也属于本发明的保护范围。所述TCFl基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5，端第67至1527位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的 DNA分子。序列2中的cDNA序列由1723个核苷酸组成，开放阅读框架为自5'端第67-1527
位核苷酸。含有所述基因的重组表达载体、重组菌和转基因植株均属于本发明的保护范围， 序列表中序列3为所述基因的启动子序列，亦为本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因及含启动子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物基因枪转化法所用的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如烟草花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子⑴biquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻泽。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (⑶S基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等) 或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选杆性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为 pCAMBIA 1300-35S-TCF1，pEZR (K) LC-35S-GFP-TCFl， pEZR (K) LC-Ptcfi-GFP-TCFI 和 pCAMBIA1391_PTCF1-⑶S，所用载体为 pCAMBIA1300 和 pEZR(K) LC (Brown et al2005)。所述 pCAMBIA1300_35S_TCFl 为将所述基因插入 pCAMBIA1300 的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表中序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1300的限制性内切酶KpnI和Mil酶切识别位点之间得到的重组质粒；所述pES (K)LC-35S-GFP-TCFl为将所述基因插入pES (K)LC的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pES (K)LC的限制性内切酶EcoRI和MlI酶切识别位点之间得到的重组质粒；所述 pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI 是以 pEZR(K)LC-35S-GFP-TCFl 载体为基础，将 TCFl 基因自身启动子片段(序列3)取代35S启动子获得的重组质粒，优选为将序列表中序列3所示的DNA 片段插入到pES (K)LC-35S-GFP-TCFl载体的限制性内切酶HindIII和McI切识别位点之间得到的重组质粒；pCAMBIA1391-PTeF1-GUS是将TCFl基因自身启动子片段(序列3)克隆到双元载体PCAMBIA1391上而获得的重组载体。本发明还保护一种培育耐寒性转基因植物的方法，是将所述TCFl基因导入目的植物中，得到耐寒性高于野生型的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体 PCAMBIA1300-35S-TCF1导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物，如水稻等；也可以是双子叶植物，如拟南芥 (如哥伦比亚生态型拟南芥)等。所述耐逆性具体为耐寒(抗寒)。扩增所述基因或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的TCFl基因受低温胁迫特异诱导表达；TCFl蛋白定位到细胞核上，是人类 RCCl蛋白的同源蛋白，但TCFl与人类RCCl作用机制不同。TCFl能够与组蛋白结合且与组蛋白H4结合紧密。本发明的TCFl基因缺失和过表达TCFl基因可以提高植物的耐寒性，将在培育抗寒性的植物育种中发挥重要的作用。
图1为拟南芥TCFl蛋白与人类RCCl蛋白功能结构域分析结果。图中绿色圆球所示为RCCl repeats结构域。图2为Col-O中TCFl基因在受低温，ABA，NaCl,Mannital胁迫下的半定量PCR图谱。A 图为 Col-O 在 4°C 处理 0h，3h，6h，12h, 24h, 48h, Oday, lday, 3day, 5day, 7day 结果。 B图为7天后取整株苗放在含有以下物质的培养基上进行胁迫处理ABA 100 μ M 5h，NaCl 300mM 3h，Mannital 400mM3h，整个处理过程在培养室(22°C )内进行。图3为tcf 1-1突变体在受低温，ABA, NaCl，Mannital胁迫下，TCFl基因的表达情况。生长7天的tcf 1-1突变体分别受到以下非生物胁迫处理4°C处理0h，6h，12h和Mh ； 100 μ M ABA 5h ；400mMMannital 3h ；300mMNaCl 3h。图4为TCFl基因在tcf 1+TCF1转基因植株中的表达情况。tcf 1-1+TCF1代表在 tcfl-Ι内过表达TCFl基因，Vector+tcfl-Ι代表在tcfl_l内转入空载体pEZR(K)-LC。图5为tcfl-Ι突变体受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。移土 3周的幼苗直接放在冷冻箱进行冷处理，左边为表型处理结果，右边为1周后的存活率统计数据。图6为tcfl-Ι突变体受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。移土 3周的幼苗首先放在4°C冰箱进行冷驯化7天，然后进行冷冻处理。左边为表型处理结果，右边为1周后的存活率统计数据。图7为TCFl基因过表达转基因植株TCFlOX受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。A为移土 3周的苗在-10°c处理浊表型结果。NA(-10°C，2h)表示未冷驯化，CA(_10°C， 2h)表示4°C冷驯化7day ；B为RT-PCR鉴定TCFl基因在各个转基因植株中的表达情况，C 为处理后一周统计的存活率情况。图8为GFP-TCFl融合蛋白在拟南芥叶子表皮细胞中的核定位。A和C显示GFP空载体对照，B和D为TCFl定位于细胞核中，其中A，B为暗视野，C，D为明视野。图9为TCFl蛋白GEF活性检测。RCCl有20% GEF活性，TCFl有5% GEF活性。图10为TCFl蛋白能与组蛋白相互结合。泳道1是蛋白质未加入组蛋白磁珠的量， 来表明上样量一致性，泳道2是经过组蛋白磁珠结合后剩下的上清液，泳道3是结合到组蛋白磁珠上的蛋白质。图11为TCFl蛋白与组蛋白H3，H4结合紧密。None表示PCR管中没加4种组蛋白的样品，All表示PCR管中加入4种组蛋白的样品，其余表示PCR管中加入各种单一组蛋白。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、TCFl基因的表达特性及TCFl基因的克隆一、TCFl基因在逆境下的表达特性分析取室温生长12d左右的拟南芥Col-O幼苗进行以下胁迫处理(1)低温处理将拟南芥Col-O幼苗置于4°C培养箱，光照培养O小时、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，_80°C保存备用。(2)脱落酸处理将拟南芥Col-O幼苗置于100 μ M的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养3小时后取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。(3)盐渍处理将拟南芥Col-O幼苗置于150mM的NaCl溶液中，光照培养5小时后取出材料，用液氮速冻，-80°C保存备用。(4) Manital处理将拟南芥Col-O幼苗置于300mM的Mannitol溶液中，光照培养 5小时后取出材料，用液氮速冻，-80°C保存备用。二、组织表达特异性(I)RT-PCR方法取常温和4°C处理12h的Col-O组织R，根；Sh，茎；L,叶；F，花；
Si，果荚，用液氮速冻，_80°C保存备用。(2)⑶S染色方法将TCFl基因启动子(序列3)克隆到双元载体pCAMBIA1391， 获得重组载体pCAMBIA1391-PTCF1-GUS。将重组载体采用蘸花法转化到野生型Col-O中。后代分离出的纯和转基因植株在4°C冷处理1 和未经冷处理情况下进行GUS染色，观察其 TCFl基因组织表达特异性。 三、mRNA的提取及RNA反转录采用Trizol法(TianGen)提取拟南芥总RNA ；将提取的mRNA用ftx)mege公司反转录试剂盒反转录为cDNA。四、RT-PCR结果分析将Col-O的cDNA用作半定量RT-PCR的模板。用TCFl基因全长引物对对样品进行扩增，分析基因对各种胁迫处理的应答情况及各组织中表达情况，以UBQ5做内参。PCR产物进行1. O %琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。五、TCFl基因全长序列的获得通过RT-PCR方法，用高保真酶扩增获得TCFl基因全长序列，获得的PCR产物连接到T载体上测序。实施例2、TCF1基因缺失突变体tcf 1-1和过表达TCFl转基因植株TCFlOX均提高耐寒性一、tcf 1-1和TCFlOX转基因植株获得ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) ^ SAIL Linesft^ii 行纯杂合鉴定，获得TCFl基因插入的纯合突变体tcfl-Ι。半定量RT-PCR结果显示tcf 1_1 是TCFl基因的无义突变体(图幻；将pCAMBIA1300-35S-TCFl载体采用拟南芥蘸花转化法到Col-O中分离得到纯和的转基因植株，RT-PCR结果显示TCFl基因在TCFlOX中过量表达 (图 4)。
二、tcfl-Ι和TCFlOX转基因植株均表现出抗寒能力在未冷驯化的情况下的进行冷处理，tcfl-Ι在_6°C，_8°C和-10°C冰冻处理2h后的存活率分别是91.3%，52. 2%和17.4%，而Col-O (WT)在相应处理温度下的存活率则分别是78. 3%，34. 8%和O (图5)，说明在没有经过冷驯化处理的情况下，tcfl-Ι比WT对冷表现出更高的耐受性；当突变体和野生型都同时放到4°C处理7天后，在进行相同冰冻处理， tcfl-Ι在-6°C，_8°C和_10°C的存活率分别是100%，82. 6%和65. 2%，而WT在相应处理温度的的存活率则分别是82. 6%，47. 8%和17. 4% (图6)；结果说明不论在冷驯化或未冷驯化情况下都表现出比野生型更强的冷耐受能力。将TCFlOX转基因植株进行-10°C，2h的冰冻处理，结果发现，不论是否经过冷驯化或未经冷驯化处理，其过表达植株的耐冷性都要比野生型Col-O强，在未冷驯化情况下， TCFl-OX转基因植株显示42. 2%的存活率，切打-1只有18.4%存活率，Col-O全部死亡， 经过冷驯化后，TCFl-OX显示82. 2%的存活率，tcfl-Ι显示61. 6%的存活率，Col-O只有 17. 9%的存活率(图7)，这些结果说明不论是否经过冷驯化，过表达TCFl基因能够提高转基因植株对冷的耐受能力。实施例3、TCFl蛋白生化特性分析一、TCFl蛋白亚细胞定位分析将培养皿里生长12天的苗(冷驯化或未冷驯化的转基因纯合植株)叶片剪下，放到一次性针筒里(不带针头)，将叶片与水混合，然后用手堵住针头，抽拉几次，使叶片变得半透明，将带有气孔的一面朝上放在载玻片上，加上一滴水，盖上盖玻片，倒放到Confocal 显微镜载物台上，调动明视野，然后激光扫描，激发光为488nm ；镜检同上。结果显示TCFl蛋白是核定位(图8)。二、鸟苷酸交换因子活性(GEF Activities)分析检测TCFl蛋白是否具有人类RCCl蛋白所具有的GEF活性。( 一)GST-TCFl 蛋白质获得(1)质粒构建与转化将TCFl基因构建到pGEX-4T-l载体上，获得重组质粒GST-TCFl，将重组质粒转化到表达菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞中(Novagen公司，CAS :69451-4)。(2) GST融合蛋白表达纯化方法如下①接单克隆菌落于5ml LB液体中，37°C培养过夜。②第二天，以1 100的接菌量将过夜菌转接到新鲜LB培养基上(Amp+终浓度为 60 μ g/L)，37°C继续培养2 3h，待OD = 0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，25°C，200r/ min,培养1 (TCF1为毒性蛋白，低温长时间诱导以获得最大的表达量)。③5，000r/min，4°C离心收集菌体。④用IXPBS重悬(每IOOml原始菌液用IOml PBS重悬)，然后在液压机上高压 3-5次以破碎细胞，将细胞压碎成混泥浆水样，无粘稠感，冰上放置准备蛋白纯化填料。⑤亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混勻，取 600 μ 1混合液加入一个层析柱中(BiO-Rad公司)，使琼脂糖在柱中自然沉降，加Iml PBS 清洗柱子，重复3次，最后一次时，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。⑥将4步骤中的菌体裂解液IOml轻轻加到层析柱上方，室温下使菌液自然流过层析柱。⑦保留0. 5ml过滤液做PAGE电泳检测用。⑧配制IOX还原型谷胱甘肽洗脱液(lg glutathione溶于 32. 5ml 10 X Glutathione Reconstitution Buffer 中)。用 IX 洗脱液洗脱 GST 融合蛋白， 每管0. 5ml接收洗脱液。⑨用Bio-Rad蛋白定量试剂盒测各管洗脱液蛋白浓度。首先做标准曲线:4ml Bradland和16ml H2O混勻，分装6个1. 5ml试管，每管Iml, 取 BSA(lmg/ml)，每管分别加入 BSA O μ 1，2 μ 1，4 μ 1，6 μ 1，8 μ 1 和 10μ 1，测 OD = 280 的吸光值，根据方程1 = kx求得k值，即试验中标准曲线斜率。其中y ( μ g/ μ 1)表示BSA的浓度，χ表示测得OD数值。然后将GST和GST-TCFl各稀释50倍，取Ιμ 加入到Iml Bradland测定液中， 测的0拟80的吸光值，代入方程求得浓度y，从而计算得到纯化的蛋白浓度y(需在扩大50倍)。⑩SDS-PAGE电泳检测纯度。(二)鸟苷酸交换因子活性(GEF)分析(Nemergut et at2002)①将表达纯化的重组蛋白GST-Ran与氚标记的[3H]⑶P和[3H] GTP混合，冰上孵育在MOPS缓冲液(25mM MOPS (pH 7. 1)和ImM EDTA)中20min。体系如下1 μ 1 GST-Ran (0. 7 μ g/μ L)，7 μ 1 4XM0PS-EDTA(100mM M0PS+4mM EDTA)，2 μ 1 [3H]GDP ;②加入IOmM MgCl2 (1. 3 μ 1)来终止反应；③30°C，加入 GST-RCCl，在 Exchange Buffer 里孵育 3min ；体系如下:10μ 1 [3Η] 标记好的 GST-RAN (步骤 1)，10 X ExchangeBuffer 3 μ 1，GST-RCC15 μ g, lmMGTP4 μ 1，力口 H2O 至 30 μ 1 ；④反应液里放入nitrocellulose filters，抽真空以停止交换反应；⑤用冰预冷的Wash Buffer洗3遍， )|f nitrocellulose filters ^( scintillation counter方j(身寸个生，$ 换率k。ff (即放射量的衰减)可以用如下公式算出ln(Ct/C0) =_1^#，其中{为反应时间 3min ；Exange Buffer :25mM MOPS (pH 7. 1)，7· 5mM MgCl2,0. 6mM NaH2PO4,0. 5mg/ml BSA, ImM GTP or GDP ;Wash Buffer :7. 5mM NaH2PO4 (pH 6. 8), 7. 5mM Na2HPO4 (pH 6. 8), IOmM MgCl2, ImM ATP。结果显示TCFl蛋白与RCCl蛋白相比有微弱GEF活性(图9)，说明TCFl蛋白与 RCCl蛋白作用机制不同。(三)组蛋白结合实验检测TCFl蛋白是否具有人类RCCl蛋白所具有的与组蛋白结合的能力。①诱导表达纯化GST-TCFl蛋白质。②利用Bradland(Bi0-Rad)试剂盒测定纯化得到的GST-TCF1和GST蛋白质浓度。③0. 2ml小牛胸腺组蛋白珠子(Sigma)用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5 ； 2mM EDTA ；0. 1% NonidetP-40 ；10% glycerol ；0. 05M NaCl)平衡 3 次。④将相同量的纯化蛋白2 μ g(用200 μ 1平衡缓冲液稀释)分别加入到0. 2ml小牛胸腺组蛋白珠子(histone-agarose columns)中，室温孵育5min，自然流过柱床，收集流过的液体作为未结合的上清液，再加入5倍柱床体积平衡缓冲液洗3遍。⑤加入终浓度为0. 3M NaCl (用平衡缓冲液配制)0. 2ml洗脱。⑥取等量将未结合上清和⑤中洗脱的蛋白跑SDS-PAGE和Wfestern blot检测，抗体 anti-GST antibody (GEHealthcare，27-4577-01)。BCIP/NBT Kit Qnvitrogen)作为检测试剂盒。结果显示GST-TCFl蛋白与组蛋白相互结合，而GST单独不与组蛋白结合(图10)。(四)组蛋白竞争试验检测TCFl蛋白是否具有人类RCCl蛋白所具有的与某种特异组蛋白结合的偏好性。①将TCFl基因克隆到PGBK-T7的EcoRI/&ilI位点上。②用 TnT —coupled wheat-germ extract system(L4330, Promega)体夕卜表达 Cmyc-TCFl蛋白，体系如下TNT wheat Germ Extract25 μ 1
TNT Reaction Buffer2μ 1
T7RNA Polymerase(T7)1 μ 1
Amino Acid Mixture (ImM)2μ 1
Rnasin Ribonuclease Inibitor (40U/μ 1)1 μ 1
DNA template(0. 5 μ g/μ 1)10 μ 1
Nuclease-Free Water 补至50 μ 1
37°C孵育1. 5h，可得Myc-TCFl蛋白。
③取6个PCR小管，每管加入3 μ 1②中的反应液，做上如下标记None，H2A H2B，
H3，H4，All。6个PCR小管依次加入下列组蛋白0yg(20y 1 PBS作为负对照)，200 μ g histone H2A (1073826, Roche), H2B (1073818, Roche), H3 (11036289, Roche), H4 (516767, Roche)，50 μ g4种组蛋白混合物，这些组蛋白都溶解在20 μ 1的PBS中(含0. 1 % (ν/ν) Nonidet-P40)，然后再加入 50 μ 1 的 PBS (含 0. 1 % (v/v) Nonidet_P40)，室温 Ih 混勻。④取50 μ 1(10 μ g)的 histone-agarose (18008540530,MPBI0)，与③相同的编号， 用3倍体积柱床平衡3次。⑤将③中的PCR小管对应加到④中的PCR管中，4°C过夜孵育。⑥用3倍柱床体积PBS (含0. 1 % (v/v) Nonidet-P40)，室温洗3次，每次5min。⑦ 在每管 histone-agarose 中加入 Loading Buffer，跑 10% SDS-PAGE 胶，然后 1Western blot 检测，抗体用 anti-c-myc antibody (11667149001, Roche，1/1，000)。结果显示 TCFl 与组蛋白H3和H4结合紧密(图11)。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，优选为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第67至1527位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒、重组菌和转基因植株。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体具体可为 pCAMBIA1300-35S-TCFl, pEZR (K) LC-35S-GFP-TCF1，pEZR(K) LC-Ptcfi-GFP-TCFI 禾口 pCAMBIA1391-PTeF「⑶S ；所用载体为PCAMBIA1300和pEZR(K)LC，所述pCAMBIA1300_35S_TCFl为将所述基因插入PCAMBIA1300的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表中序列2自5'端第 67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1300的限制性内切酶KpnI和Mil酶切识别位点之间得到的重组质粒；所述pES (K)LC-35S-GFP-TCFl为将所述基因插入pES (K)LC 的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pES (K)LC的限制性内切酶EcoRI和Mil酶切识别位点之间得到的重组质粒；所述 pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI 是以 pEZR(K)LC-35S-GFP-TCF1 载体为基础，将 TCFl 基因自身启动子片段(序列幻取代35S启动子获得的重组质粒，优选为将序列表中序列3 所示的DNA片段插入到pES (K) LC-35S-GFP-TCF1载体的限制性内切酶HindIII和^icI切识别位点之间得到的重组质粒；pCAMBIA1391-PTm-GUS是将TCFl基因自身启动子片段(序列3)克隆到双元载体pCAMBIA1391上而获得的重组载体。
5.一种培育耐寒性转基因植物的方法，是将权利要求2所述基因通过权利要求3或4 所述重组表达载体导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的材料的转基因植株。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于权利要求2所述基因通过权利要求3或4所述重组表达载体导入所述目的植物。
7.如权利要求5和6所述，其特征在于所述耐逆性为耐寒。
8.如权利要求5和6所述的材料，其特征在于所述目的植物为拟南芥，优选为哥伦比亚生态型拟南芥；所述方法为将权利要求2所述基因通过所述35S-TCF1导入所述目的植物中。
9.扩增权利要求2所述基因或其任意片段的引物对。
10.扩增权利要求2所述基因的启动子序列。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐低温相关蛋白TCF1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的TCF1基因特异受冷诱导表达，编码的蛋白定位到细胞核上，并且可以的与组蛋白特异结合，从而调控其下游基因的转录表达。本发明的TCF1基因缺失和过表达TCF1基因均可以提高植物的耐低温性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
文档编号C12N15/82GK102153636SQ201010585989
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者李霞, 王幼宁, 纪洪涛 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所