专利名称：检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置以及方法。
背景技术：
染色体拷贝数异常和人类的疾病有着密切的关系。平均每1000个新生儿中，有9 个会携带因染色体拷贝数异常而导致的疾病⑴。因此在胎儿尚未出生之前能够检测出染色 体拷贝数是很重要的。然而，目前所用的诊断方法，包括羊膜穿刺和羊绒毛膜取样，都属于 有创伤的方法，会给孕妇和胎儿带来一定的风险。用血清蛋白标记物和超声波来检测胎儿 是否有染色体拷贝数异常的疾病虽无创伤，但不是直接检测致病因素，因而准确性和灵敏 度都不太好(2)，也存在不能尽早地发现染色体拷贝数异常疾病的问题。这样的现状促使研 究人员去开发一种精确而且灵敏度高的无创诊断和检测方法。自从母体血液中的胚胎DNA被发现之后(3)，无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体 异常性成了一个重大的研究课题。2007年，卢煜明教授和他的同事们证明可以用母体血浆 mRNA中胎盘特异基因4的突变位点比例来断定胚胎是否有21号染色体3倍体⑷。突变位 点比例同时也被用来判断18号染色体是否为3倍体⑸。它的局限性在于突变位点在人群 中并不普遍，所以这些方法只适用于一部分人群。在同一时期，数码PCR(digital PCR，或 dPCR)被用来检测胚胎的染色体3倍体(6)’ (7)。数码PCR的优势是不依赖任何突变位点，但 它的精确度不够高，而且需要大量血样，加大了采样的困难。近年来迅猛发展的高通量测序技术解决了以上的问题。这些技术包括Illumina 公司的 Genome Analyzer , Life Technologies 公司的 S0LiD(9)，以及 Helicos 公司的 HeliSCOpea°)，能一次性地检测出几亿乃至几十亿个序列。用这些技术来检测母体血浆DNA 时，血浆中微量的胚胎DNA的染色体数目的变化能被检测出来(11)’(12)’㈦)。但因为测序的成 本太高，目前这些技术尚未被普遍使用。同时，从母体血液中检测胚胎染色体的局部拷贝数 的变化还属于未解决的难题。用高通量测序来检测母体血浆中胚胎染色体的拷贝数变化有 一些优势，但目前价钱昂贵，不能普及。而且测序的偏差(CV)比较高，检测的精确度和稳定 性也都有待改进。测序的偏差也决定了这种方法只适合少数几个染色体，如21号染色体， 18号染色体，而且目前还不适合于染色体局部拷贝数变化的检测。用高通量测序来检测染色体数目的变化的高成本和难度主要因为母体血浆中胚 胎DNA的含量比较低，低时只占5%，尤其在胚胎发育的早期。母体血浆中的大部分DNA还 是母体DNA。胚胎染色体数目或局部拷贝数的变化很容易被母体DNA的背景所覆盖。因此 分离母体和胚胎DNA的方法也就成为多年来研究的课题，但成效不大。比较成功的方法应 属Baylor医学院发明的针对组蛋白的分离方法(14)。不过分离出来的DNA量太少，只适合 于突变位点的检测，不宜用来检测染色体拷贝数的变化。
发明内容
针对上面检测胚胎染色体拷贝数的方法中的种种问题，发明人根据母体血浆中胚胎DNA和母体DNA的长度设计出一种能有效地低成本检测出胚胎染色体全部或局部拷贝数 的试剂盒、装置及方法。本发明是基于以下的事实如在文献中报道的(15)，母体血浆中的胚胎DNA大部分 为IOObp到250bp的片段，且150bp到170bp的DNA尤其占多数，虽然母体的DNA也有很小 部分分布在这个片段区域，但片段大于250bp的DNA基本上属于母体的DNA。本发明的发明 人首次发现，虽然理由未知，各个染色体占总DNA的比例在IOObp到250bp之间的任意一点 或任意一个区间处的DNA是均勻分布的，即各个染色体在IOObp到250bp之间的任何一点， 比如IlObp或167bp (此位点的DNA量最多)，与总DNA的比例代表了其他点的比例，因此， 也就代表了各个染色体占IOObp到250bp之间的所有DNA的比例。基于以上的发现，本发明人发明了相对无创且经济方便地检测胚胎染色体拷贝数 的试剂盒、装置和方法。本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒包括从母体取血液的器械；适合 将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；通过物 理方法根据所述DNA的片段大小对其进行分离的试剂和器械；和取100bp-250bp之间的任 意一点或任意一个区间的所有DNA进行测序的试剂和器械。优选地，所述物理方法是琼脂糖凝胶电泳的方法。优选地，所述检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括将所述DNA制成供双端测 序的文库的试剂和器械。优选地，所述检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括对所述从血浆中抽提的 DNA或所述供双端测序的文库进行PCR扩增的试剂和器械。优选地，其中所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是 150bp-170bp 的 DNA。优选地，其中所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的 DNA。优选地，其中所述双端测序对所述DNA两端各20_100bp的双端短序列进行测试。本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒包括从母体取血液的器械；适 合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；将所 述DNA制成可供双端测序的文库的试剂和器械；和对所述DNA进行双端短序列测序的试剂 和器械。优选地，所述双端短序列是所述DNA两端各小于50bp的核苷酸。优选地，本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括对所述从血浆 中抽提的DNA进行PCR扩增的试剂和器械。本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的装置包括检测模块，用于对母体血浆样 本中的DNA进行测序；比对模块，用于将所述DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比 对，以确定所述DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；计算模 块，用于计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所 有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述 比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数；以及输出模块，用于输出所述 待测染色体的拷贝数。
优选地，对所述母体血浆样本中DNA进行测序仅包括对所述DNA中100bp_250bp 之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序，通过物理方法可以分离出固定长度区间 的 DNA。优选地，所述母体血浆样本中DNA在检测前被制作成可供双端测序的文库。优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。优选地，对所述DNA的所述双端短序列进行测试后，通过与染色体组序列图谱进 行比对确定每段所述DNA的长度。优选地，所述母体血浆样本中DNA在检测前进行了 PCR的扩增。优选地，所述母体血浆样本中DNA在被制作成可供双端测序的文库之前或之后进 行了 PCR的扩增。优选地，所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp_170bp 的 DNA。优选地，所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间是DNA是167bp的DNA。优选地，所述参考染色体是2号、7号、12号、14号染色体或它们的任意组合。优选地，所述待测染色体是13号、18号、21号、X、Y染色体或它们的任意组合。本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的方法包括以下步骤取母体血液；将所述 血液中的血浆和血细胞分离；通过物理方法将所述血浆中的DNA根据所述DNA的片段大小 对其进行分离；对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行 测序；将所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序结 果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意 一个区间的所有DNA中的每段DNA来自几号染色体；以及计算在同一样本内所述DNA中 100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染 色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定 待测染色体的拷贝数。优选地，所述物理方法是是琼脂糖凝胶电泳的方法。优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括在通过物理方 法分离所述DNA大小之前或之后将DNA制成可供双端测序的文库，其中对所述DNA中 100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序采用的是双端测序的方法。优选地，所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp_170bp 的 DNA。优选地，所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括将所述DNA的所述 双端短序列的测试结果与染色体组序列图谱进行比对以确定每段所述DNA的长度的步骤。优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括在通过所述物理方 法分离所述DNA之前或所述测序之前对所述DNA进行PCR扩增的步骤。本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤取母体血液；将 所述血液中的血浆和血细胞分离；对所述血浆中的DNA制作成可供双端测序的文库；对所 述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序；将所述测序的结果与染色体组序列图谱进行比对，确定每段所述DNA序列来自几号染色体以及每段所述DNA序列的长度；以及取所述 DNA的序列长度在100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序和比对 结果，计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有 DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比 值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。优选地，所述100_250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp_170bp 的 DNA。优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。可替换地，上述的检测胚胎染色体拷贝数的方法也可以通过测试所述血浆中的 DNA的单端长序列以代替双端测序，此时可以包括也可以不包括对所述血浆中的DNA制作 成可供双端测序的文库的步骤，因为测试单端长序列的文库可以与供双端测序的文库是同 一文库。当用本发明的试剂盒、装置及方法来计算胚胎DNA的染色体数或染色体局部拷贝 数的变化，发现计算出来的胚胎DNA的染色体数或染色体局部拷贝数不但精确，而且需要 的血样很少，计算所需的序列数目可以大大减少，从而大幅度地降低测序成本。
图1是将母体血浆的DNA制成可供双端测序的文库后，用的琼脂糖凝胶电泳后 的图像。左边的通道是DNA IOObp标准样的图像，右边的通道是可供双端测序的文库DNA 的图像，最明显的条带位于^Obp左右，其中包含了 120bp的连接引物。图2是样品G367的DNA片段大小的分布图。图3是比对后样品G367中确定来自X染色体的DNA片段根据片段大小所做的分 布图。图4是计算得出的和实际测得的G367X染色体的DNA片段根据片段大小所做的分 布图，图中带星号的线表示G367样品的总DNA序列数乘以X染色体的百分比后得到的图 形，圆圈代表实际检测到的X染色体的序列数。如图中所示，计算得出的G367X染色体的 DNA片段的分布与实际测量得到的分布基本相同，两条线基本完全吻合。
具体实施例方式需要说明的是，在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。本发明的附图及其实施例仅仅 用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。名词解释双端短序列是指紧接着5’端链接引物的小于50bp的序列和紧接着3’端链接引 物的小于50bp的序列。优选地，双端短序列是指紧接着5’端链接引物的不大于36bp的序 列和紧接着3’端链接引物的不大于36bp的序列。单端长序列是指紧接着5’端链接引物的大于99bp的序列或紧接着3’端链接引 物的大于99bp的序列。
双端测序是指分别测试位于序列两端的双端短序列。DNA簇指由单一 DNA分子扩增而成的位于一定固体面积的多个DNA分子。在该申 请的实施例中，DNA簇指由单一 DNA分子扩增而成的位于1平方微米内的大约1000个DNA 分子。乳化PCR指的是将PCR(Polymerase Chain Reaction)的反应物，包括PCR模板 DNA、PCR引物、PCR聚合酶和碱基置于一个油珠内进行PCR反应。通常情况下，乳化PCR的 模板只有一个DNA分子。实施例实施例1 一种检测胚胎染色体拷贝数的方法步骤1 取母体血液，制备血浆在本实施例中，总共抽取了 5个母体血液样品，血液样品经高速离心后得到除去 了血细胞的血浆样品，每个样品的血浆量大约为1ml，样品的代号为G367、G374、G379、 G435和G440。上述样品均由中南大学湘雅医学院的邬玲仟教授采集得到。步骤2:提取血浆DNA可以使用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为 57704)。 步骤3 将血浆DNA制成可供双端测序的文库将提取的DNA末端补平并进行5，端磷酸化将DNA30 μ 1、纯水45 μ 1、具有IOmM ATP 的 T4DNA 连接酶缓冲液 10 μ IUOmM dNTP Mix 4 μ 1、T4DNA 聚合酶 5 μ 1、Klenow 酶1μ1、Τ4ΡΝΚ 5μ 1混合后，在20°C温浴30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒 PE-102-1001提供)。温浴后采用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part把8104)纯化 DNA。末端悬A 将上步的产物溶解在32 μ 1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5 μ l、lmM dATP 10 μ 1、Klenow Εχο_3 μ 1，在37°C保持30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒 PE-102-1001 提供)，产物由 QIAGEN MinElute PCR 纯化试剂盒(part把8004)连接DNA溶解在10 μ 1缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液h 25 μ 1、PE Adapter Oligo MixlOy 1，DNA连接酶5 μ 1，在20°C保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂 盒PE-102-1001提供)。温浴后采用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part把8104)纯化 DNA。图1是每个样品的DNA被制作成可供双端测序的文库，将该文库中的DNA用 的琼脂糖凝胶进行电泳，图1是凝胶电泳的图像，最明显的条带在^Obp左右，由于包含了 120bp的连接引物，因此母体血浆DNA主要片段集中在160bp左右。优选地，还可以对可供双端测序的文库进行PCR扩增1μ 1 DNA、22yl纯水、 1 μ IPE PCR 引物 PE 2. OU μ 1 PE PCR 引物 PE 1. 0、2x Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes 0y)(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)。通过PCR仪器扩增DNA，程序 为98 °C 30秒；98°C 40秒，65°C 30秒，72°C 30秒，共进行12个循环；72°C 5分钟。步骤4 对所述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序用I Ilumina的cBot仪器将DNA双端测序文库中单一的DNA分子制成DNA簇，这一 步也可由乳化PCR将单一 DNA分子变成珠子上的多分子。将上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在Illumina的Genome Analyzer或HKeq2000测序仪进行双端测序。此过 程均由仪器本身自动完成。可替换地，也可将上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在11 Iumina的 GenomeAnalyzer或Hikq2000测序仪进行单端长序列的测序。在Illumina的Genome Analyzer和HiSeq2000测序仪上的测序步骤和反应条件与以上描述的一样。步骤5 确定血浆中的DNA片段来自几号染色体，并确定待测染色体的拷贝数是否 正常在进行了 DNA文库的双端测序后(可替换地，也可以是测定单端长序列)，当已 知了一个DNA片段两端各36bp的碱基序列后，可以将这两端的序列与人类基因组标准序 歹丨J 37. 1 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/pro iects/genome/assembly/grc/human/data/ ？ build = 37)，该数据库也称hgl9比对，确定了这两端的序列分别在染色体上的位置，该两 端序列之间的距离就是该DNA片段的长度，同时该两端序列所在的染色体位置即确定了该 DNA片段来自几号染色体。图2是根据上述的方法确定得到的样品G367的DNA片段大小的分布图，从图中可 以看出，母体血浆的短DNA主要集中在IOObp到220bp之间。图3是将比对后样品G367中确定来自X染色体的DNA片段根据片段大小所做的 分布图。所得到的图形与图2几乎一致。步骤6 取DNA的序列长度在100bp_250bp之间的任意一点或任意一个区间的所 有DNA的比对结果，计算并确定待测染色体的拷贝数在本实施例中我们取了长度在150bp到区间的DNA片段的比对结果，将7 号和14号染色体作为参考染色体，X、Y和21号染色体作为待测染色体。表1中列出了在 150bp到区间，来自7、14、X、Y和21号染色体的DNA片段占该区间的总DNA片段的 百分数样品 chr7 chrl4 chr21 chrXchrYG367_46xx 0.010527261 5. 440913867 3. 168290974 1. 3591621044. 011180933G374_46xx 0. 012214554 5. 451782745 3. 164119016 1. 3536778943. 962889744G379_46xx 0.009586766 5. 445655908 3. 170272522 1. 3522686254. 037545306G452_47xy 0.060654459 T21 5. 371282594 3. 174026866 1. 5010533123. 490446542G440_45x 0.0101686 5. 467367816 3. 189015757 1. 3566645683.679299238根据比对的结果，得知G367的X染色体的序列数占总序列数的4. 0112%，可以验 证本发明的发现的是将图2的纵坐标乘以4. 0112%得到了与图3非常吻合的图形，具体 参见图4，图中带星号的线表示G367样品的总DNA序列数乘以X染色体的百分比后得到的 图形，圆圈代表实际检测到的X染色体的序列数。在表2中列出了 5个样品中来自X和Y染色体的DNA片段数占150bp到区间的总DNA片段数的百分数与来自7号和14号染色体的DNA片段数占150bp到区 间的总DNA片段数的百分数的比值，也列出了这些比值的平均值和标准误差。根据平均值 和标准误差，得到Z数值Z=(样品比值-平均值)/标准误差。在该实施例中，根据Z数 值可以判断胚胎中X和21号染色体的个数以及Y染色体是否存在，在此声明，本发明不用 于非医学需要的胎儿性别鉴定或者性别选择性的人工终止妊娠的性别鉴定。
权利要求
1.一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，包括 从母体取血液的器械；适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械； 抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；通过物理方法根据所述DNA的片段大小对其进行分离的试剂和器械；和 取100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA进行测序的试剂和器械。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述物理方法是琼脂糖凝胶电泳的方法。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括将所述DNA制成供双端测序的文库的试剂 和器械。
4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，还包括对所述从血浆中抽提的DNA或所述供 双端测序的文库进行PCR扩增的试剂和器械。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一 个区间的DNA是167bp的DNA。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双 端短序列进行测试。
9.一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，包括 从母体取血液的器械；适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械； 抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械； 将所述DNA制成可供双端测序的文库的试剂和器械；和 对所述DNA进行双端短序列测序的试剂和器械。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述双端短序列是所述DNA两端各小于50bp 的核苷酸。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，还包括对所述从血浆中抽提的DNA进行PCR 扩增的试剂和器械。
12.—种检测胚胎染色体拷贝数的装置，包括检测模块，用于对母体血浆样本中的DNA进行测序；比对模块，用于将所述DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA 中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；计算模块，用于计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一 个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个 样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数；以及 输出模块，用于输出所述待测染色体的拷贝数。
13.根据权利要求12所述的装置，其中对所述母体血浆样本中DNA进行测序仅包括对 所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序，通过物理方法可以分离出100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在检测前被制作 成可供双端测序的文库。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双 端短序列进行测试。
16.根据权利要求15所述的装置，其中对所述DNA的所述双端短序列进行测试后，通过 将所测得的DNA的双端短序列与染色体组序列图谱进行比对能够确定每段所述DNA的长度 以及每段所述DNA来自几号染色体。
17.根据权利要求12所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在检测前进行了PCR 的扩增。
18.根据权利要求14所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在被制作成可供双端 测序的文库之前或之后进行了 PCR的扩增。
19.根据权利要求13或15所述的装置，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一 个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
20.根据权利要求19所述的装置，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间是DNA是167bp的DNA。
21.根据权利要求12所述的装置，其中所述参考染色体是2号、7号、12号、14号染色 体或它们的任意组合。
22.根据权利要求12或21所述的装置，其中所述待测染色体是13号、18号、21号、X、 Y染色体或它们的任意组合。
23.一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤取母体血液；将所述血液中的血浆和血细胞分离；通过物理方法将所述血浆中的DNA根据所述DNA的片段大小对其进行分离；对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序；将所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序结果与 染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个 区间的所有DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；以及计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有 DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比 值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述物理方法是是琼脂糖凝胶电泳的方法。
25.根据权利要求M所述的方法，还包括在通过物理方法分离所述DNA大小之前或之 后将DNA制成可供双端测序的文库，其中对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任 意一个区间的DNA进行测序采用的是双端测序的方法。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的DNA是167bp的DNA。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述双端测序对所述DNA两端各小 于50bp的双端短序列进行测试。
29.根据权利要求观所述的方法，还包括将所述DNA的所述双端短序列的测试结果与 染色体组序列图谱进行比对以确定每段所述DNA的长度的步骤。
30.根据权利要求M46或28中任一项所述的方法，还包括在通过所述物理方法分离 所述DNA之前或所述测序之前对所述DNA进行PCR扩增的步骤。
31.一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤取母体血液；将所述血液中的血浆和血细胞分离；对所述血浆中的DNA制作成可供双端测序的文库；对所述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序；将所述测序的结果与染色体组序列图谱进行比对，确定每段所述DNA序列来自几号染 色体以及每段所述DNA序列的长度；以及取所述DNA的序列长度在100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的 测序和比对结果，计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个 区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样 本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区 间的DNA是167bp的DNA。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp 的双端短序列进行测试。
35.根据权利要求31所述的方法，其中通过测试所述血浆中的DNA的单端长序列以代 替双端测序。
全文摘要
本发明涉及检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法，使用本发明的试剂盒、装置和方法能够相对无创、经济地检测胚胎染色体的拷贝数。本发明主要基于发明人发现在母体血浆中的胚胎DNA大部分为100bp到250bp的片段，且各个染色体占总DNA的比例与各个染色体占母体血浆中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的比例是一致的。因此本发明的方法仅需要测定100bp到250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA中的每段DNA来自几号染色体，并计算在同一样本内100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
文档编号C12Q1/68GK102108406SQ20101059523
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者周代星, 张建光, 王珺, 田凤, 高扬 申请人:北京贝瑞和康生物技术有限公司