专利名称：植物花药中响应光周期基因的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种植物花药中响应光周期基因的筛选方法。
背景技术：
杂交育种技术雄性不育是植物界非常普遍的现象，受内外源多种因素控制和影 响。由于雄性不育品种为农业生产上异花授粉提供了极大的便利，所以控制作物的雄性生 殖发育是杂交育种的基础。上世纪70年代，以袁隆平为代表的我国一批水稻育种学家在 细胞质雄性不育基础上，相继育种成功恢复系和保持系，创建了所谓杂交育种三系法(不育 系，恢复系和保持系)，至今基于三系法的杂交水稻单在我国已播种5亿公顷，增加水稻产量 20%以上，为我国的粮食安全做出巨大贡献。三系法虽然功勋卓著，然而其基因型单一，同时 细胞质雄性不育来源于线粒体或者叶绿体发育的缺陷，在一定的遗传背景下可能会引发植 物整体上生长和适应力上的隐患。与三系法相比，基于核基因突变的光(周期)敏雄性不育 或者温敏雄性不育的两系法杂交稻种子生产的程序简化，种子成本低，基因型配套多样，有 利于推广。因此光(周期)温敏核不育水稻是极为重要的种质资源。但对于光(周期)温敏 不育性的内部遗传机制仍未完全搞清楚。考虑到已知的植物体内光敏(周期)信号途径是在转录水平上调控的，所以，如果 能在鉴定出转录水平上决定花粉育性的基因的表达受光周期提控，则有望找到光周期敏感 的雄性不育基因。本发明有助于进一步研究光敏雄性不育，并在此基础上人工构建两系法 光敏雄性不育作物。植物基因工程技术基因工程是当今最具有前景的改良动植物某单一特性和培 育新品种的有效技术。它可以不受亲缘关系、地理远缘和育性差异的影响而实现不同物种 之间基因的转化。在目前常用的植物转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占主要地位。
根癌农杆菌介导的植物转基因系统是一种天然有效的遗传工程系统，目前在大多数双 子叶植物和少数单子叶植物转化中取得了很好的效果。表达谱基因芯片表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种基因芯片。是目前 技术比较成熟，应用最广泛的一种基因芯片。用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组 织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针，将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤， 用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计 算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。这是基因功能研究的一种重要手 段。用传统方法筛选拟南芥花药中响应光周期基因，需要用EMS (甲基磺酸乙酯，一种 剧毒致癌物质)来诱变大量拟南芥种子(至少10000粒)，然后将诱变的种子种植后自交2-3 代，得到纯合基因型的植株后，再将得到的植株于长短日照下分别处理，观察其表型变化， 从而筛选出响应光周期的基因。该方法筛选周期长，要求的条件苛刻，筛选前提是该基因突 变后有明显可以观察到的表型变化，如不育、早花、晚花等表型。发明内容本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种筛选植物花序中响应光周期 基因的新方法。为了达到上述目的，本发明构思是在不同的光周期条件下种植待筛选植物，并取 花序。然后用基因芯片来分析不同长短日照的花药特异表达基因的表达谱，并对比找出长 短日照下表达了有显著差异的基因。根据上述发明构思，本发明采用下述技术方案
一种植物花药中响应光周期基因的筛选方法，其特征在于该方法的具体步骤为
a.根据国外公开的芯片数据获取待筛选植物的花药特异表达基因；
b.在其它所有条件相同的前提下，分别于长光照周期和短光照周期下培养待筛选 植物，待植物抽薹后2天，对其花药分别提取mRNA ；
c.将步骤b中提取的长短日照下两组mRNA分别制作全基因组表达谱芯片，找出表 达有显著差异的基因；
d.将步骤c所得表达有显著差异的基因与步骤a中得到的待筛选植物的花药特异 表达基因对比，得到该植物花药中响应光周期基因。上述的长光照周期为16小时光照/8小时黑暗；所述的短光照周期为8小时光 照/16小时黑暗。上述的表达有显著差异的基因为长光照周期下的基因的表达量为短光照周期下 表达量的至少2倍。本发明与传统方法相比，有以下几个优点1)本发明不需要用到EMS这类剧毒致 癌物质；2)本发明只需用到240-300粒拟南芥种子即可，无需大批量种子来完成实验；3)本 发明中的实验方法周期短，只需种植一代植物即可完成；4)传统方法筛选拟南芥花药中响 应光周期基因，前提是该基因突变后有明显可以观察到的表型变化，如不育、早花、晚花等 表型，而用本发明中的方法，即使没有任何表型的基因，也可以全部筛选到。
图1为AT2G16890基因RT-PCR检测结果；
图2为长短日照AT2G16890基因启动子表达GFP转基因植物荧光检测结果。
具体实施例方式
以下以野生拟南芥为例，结合附图详细说明如下 培养及取材
1.1播种Col生态型(Columbia生态型的简称，拟南芥一种最常见的生态型)的 野生型(Wild Type)植株4盆，每盆约60个单株，于黑土 蛭石珍珠岩的混合土中 (1:6:0. 25)，4°C春化2-4天后，以塑料薄膜覆盖，在20°C，湿度60% 70%，光照强度为50 μΕπι-28-1,16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，营养液为PNS (PNS培养液配方见下表)。 待种子萌发后揭去薄膜，继续以上述条件培养植物直到抽薹。PNS 营养液
PNS母液成分和1升1 XPNS配方
权利要求
1.一种植物花药中响应光周期基因的筛选方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.根据国外公开的芯片数据获取待筛选植物的花药特异表达基因；b.在其它所有条件相同的前提下，分别于长光照周期和短光照周期下培养待筛选植 物，待植物抽薹后2天，对其花药分别提取mRNA ；c.将步骤b中提取的长短日照下两组mRNA分别制作全基因组表达谱芯片，找出表达有 显著差异的基因；d.将步骤c所得表达有显著差异的基因与步骤a中得到的待筛选植物的花药特异表达 基因对比，得到该植物花药中响应光周期基因。
2.根据权利要求1所述的植物花药中响应光周期基因的筛选方法，其特征在于所述的 长光照周期为16小时光照/8小时黑暗；所述的短光照周期为8小时光照/16小时黑暗。
3.根据权利要求1所述的植物花药中响应光周期基因的筛选方法，其特征在于所述的 表达有显著差异的基因为长光照周期下的基因的表达量为短光照周期下表达量的至少2 倍。
全文摘要
本发明涉及一种植物花药中响应光周期基因的筛选方法。该方法的具体步骤为根据国外公开的芯片数据获取待筛选植物的花药特异表达基因；在其它所有条件相同的前提下，分别于长光照周期和短光照周期下培养待筛选植物，待植物抽薹后2天，对其花药分别提取mRNA；将提取的长短日照下两组mRNA分别制作全基因组表达谱芯片，找出表达有显著差异的基因；将所得表达有显著差异的基因与待筛选植物的花药特异表达基因对比，得到该植物花药中响应光周期基因。本发明不需要用到EMS这类剧毒致癌物质；只需用到240-300粒拟南芥种子即可，无需大批量种子来完成实验；周期短，只需种植一代植物即可完成。本发明中的方法，即使没有任何表型的基因，也可以全部筛选到。
文档编号C12N15/113GK102121001SQ20101059986
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者孙立成, 张卫, 杨正凯, 王哲 申请人:上海大学