专利名称：一种可用于外源基因表达的载体及细胞株筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及采用DNA重组技术在哺乳动物细胞中高效表达的载体，一种将目的基因表达和筛选基因潮霉素B磷酸转移酶表达紧密连接在一起的技术，一种弱化扩增基因DHFR的表达来提高MTX筛选效率，降低MTX使用浓度的技术。本发明还涉及采用以上技术优化的表达载体转染细胞后，获得高水平表达克隆的筛选方法。
背景技术：
为了获得与功能和药代特性相一致的蛋白翻译后修饰，生物药物蛋白需要用哺乳动物细胞来作为其表达宿主细胞。常用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠肾细胞(CHO)，BHK 细胞和杂交瘤NSO细胞等。而CHO细胞由于其可在无血清或无蛋白的培养基中高密度生长， 并已证明为安全的生物药物蛋白生产细胞而被广泛使用。CHO稳定表达系统已开发了二氢叶酸dhfr扩增系统和谷氨酰胺合成酶GS扩增系统。这两种系统可获得高水平的表达，但由于GS系统涉及Lonza公司专利知识产权，高昂的知识产权费使其只能在少数几个大的制药公司中应用，CHO-dhfr系统仍是主流的生物药物蛋白生产细胞株。异源目的基因需要与一个筛选基因(比如潮霉素B磷酸化转移酶)一起重组到细胞系基因组上，通过筛选基因的筛选获得的稳定细胞株可表达目的蛋白。异源目的基因和筛选基因通常放置在相同或不同表达载体上，一个或两个不同的载体转染或共转染细胞后，加入抗生素，比如hygmycin进行筛选，细胞培养数周后，抗生素耐受的生长克隆可检测目的蛋白的表达水平。由于整合到不同的基因组位置，不同细胞表达目的蛋白的能力差异很大，并且还有大量细胞株只整合了抗生素基因，而没有整合进入目的基因。因此，为了获得目的基因整合到高表达位点，通常需要高通量ELISA检测大量的抗生素耐受克隆来获得少量的高表达克隆。基因扩增可使蛋白表达水平得到大幅度的提高而在重组生物蛋白药物的生产中广泛使用。以二氢叶酸还原酶(DHFR)为基础的基因扩增系统广泛应用于DHFR缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系统中。可将目的基因和dhfr筛选基因放置于一个或两个不同的载体上，转染细胞后，在不含甘氨酸，次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中进行筛选。然后再逐步加入不同浓度的二氢叶酸还原酶抑制剂，甲氨喋呤(MTX)来扩增基因拷贝，提高蛋白的表达能力 (Kaufman, R. J. et al.，JMol Biol, 1982，159,601-621)。高浓度的 MTX 可扩增基因提高蛋白表达能力，但基因的表达水平也极容易在长期培养中丢失，而使得目的基因的表达量非常不稳定。因此这需要从大量的细胞扩增筛选中，才能获得极少数的稳定高表达的细胞株， 这需要耗费大量的人力和时间。目前，已有开发了多种商业化的哺乳动物的表达载体，许多优化的载体都主要看重蛋白表达水平的提高，比如采用强病毒启动子如CMV，SV40来增强目的基因表达的启动 (Barbara S. C. et al. ,Nucleic Acids Research,1991,19(14),3979-3986 ；Daniel J. L. et al. ,Protein Expression andPurification，2002，20，500-506)或采用新的 NPT 筛选系统 (KerstinSautter, Wiley InterScience，2005，530-538)。但优化 CHO 表达载体更应看重的是提高效率，降低浪费在低表达或无表达克隆的工作量，提高高蛋白表达克隆的筛选几率，这样将可减少制药的经济成本和时间成本。Raju K. K. et al.，Gene，2001，280，87-95 的文章中提到将目的基因定向重组到热点表达的基因组上，他在载体上放入了 51Λ的一段基因组转录活化区域，与目的基因和dhfr基因共同构建在一个载体上。转染细胞可明显的降低筛选工作量和提高基因重组的稳定性。Wff Hong et al.，Vaccine，2007，25 :4103-11 报告的文献中将CHO表达载体与DHFR RNAi沉默基因的载体进行共转染，这个方法能明显降低dhfr基因的表达水平，在dhfr缺陷型或dhfr正常表达的细胞株中都获得高表达的细胞系。Brian K. L. et al.，Nucleic Acids Research，1996，24 (9)，1774-1779 发表的文献中，将dhfr基因放置于强启动子和目的基因之间的内含子内，该结果可明显减少耐受高浓度的细胞数量，提高耐受克隆的表达量。因此，优化载体来获得高水平并且稳定表达的细胞株，减少筛选的工作量和工作时间是非常需要的优化方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在哺乳动物细胞中高效表达的载体系统。在一个具体实施例中，目的基因所采用的启动子为CMV IE启动子，该启动子的序列为 SEQ ID NO :12ο在一个具体实施例中，筛选基因潮霉素B磷酸转移酶的内部被插入了一个可被高效剪切的内含子序列，该内含子的序列为SEQ ID NO :7。并且将目的基因的表达盒被放置于该内含子的内部。该内含子及目的基因表达盒的插入可明显的降低潮霉素B磷酸转移酶的表达，增强筛选基因的筛选效率，使用降低的工作量来获得更多的高表达克隆株。在一个具体实施例中，扩增基因dhfr采用弱的组成性表达启动子Ubc来启动dhfr 的表达，该启动子的序列为SEQ ID NO :3，其目的为降低dhfr的表达，并使在降低浓度的 MTX下，获得高倍数的扩增效果，大大提高目的基因的表达量。本发明的目的在于提供一种使用本发明的载体在哺乳动物中获得高表达细胞株的筛选方法。在一个具体实施例中，筛选抗生素选择为hygmycin，表达载体转染细胞后，按一定数量的细胞进行铺板，加入的hygmycin浓度为0. 4mg/L, 1. Omg/L或2. Omg/ml。在一个具体实施例中，扩增试剂选择为MTX，高表达重组克隆在降低浓度的MTX下进行高度的扩增，选择逐步加入的MTX的浓度为ΙΟηΜ，30nM, IOOnM和300nM。在一个具体实施例中，所表达的目的蛋白为IFN γ Rl受体Fc融合蛋白。说明书附1 表达载体结构图，采用Ubc启动子来启动dhfr的表达，同时在筛选基因潮霉素B磷酸转移酶的内部插入内含子的SD和SA序列。该表达载体采用高浓度的hygmycin 来筛选目的蛋白高表达克隆，采用低浓度的MTX来扩增目的基因的拷贝数，获得高水平的目的蛋白的表达。图2 目的蛋白IFN γ Rl-Fc的表达载体图。图3 常用的对照载体的示意图。图 4 在 hygmycin 抗生素筛选下，pSCT-IFN y Rl-Fc 和 pSV2-dhfr_IFN y Rl-Fc 转染后各挑30个克隆的ELISA表达量和单位细胞表达水平(Qp)。
图 5 两种载体 pSCT-IFN y Rl-Fc 和 pSV2-dhfr_IFN y Rl-Fc 转染获得 30 个克隆经不同浓度MTX扩增到设定的高浓度后的ELISA表达量和单位细胞表达水平(Qp)。
具体实施例方式启动子是指在DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，它决定目的基因的转录效率。在功能上，启动子被分为强启动子和弱启动子，强启动子是指可使目的基因高效启动表达的功能区域，它启动目的基因转录的间隔时间非常短，而弱启动子启动目的基因的转录的时间会非常长。本发明所涉及的是一个运用于CHO-dhfr缺陷型系统的高效表达载体，该CHO真核细胞表达载体采用优化CMV IE启动子SEQ ID No :12，即在原有的CMV病毒启动子的内部加入了 CMV增强子，该启动子包含以下特征GC富含区域，Spl结合位点，多聚嘧啶区域和 TATA盒。该启动子可以在含血清，低浓度血清和无血清的细胞培养条件下组成性的启动蛋白的表达。本发明并不只限于只使用CMVIE启动子，本专业领域所熟知的其他强启动子序列也可以应用于本专利。本发明所描述的载体还涉及一种弱化筛选基因的表达，并且将筛选基因的表达与目的基因的表达紧密结合的一种方法。本发明在筛选基因的ORF中设计一个内含子序列， 分别将目的基因的表达框插入到内含子中。在筛选基因转录RNA修饰过程中，剪切去除内含子的组分，形成成熟的mRNA，表达耐受抗生素的筛选蛋白。增加的RNA后处理过程将筛选基因的表达水平将大大降低，可在较高的hygmycin浓度下可筛选到重组于高表达位点的细胞克隆。该筛选基因可为本领域人员所熟知的任何筛选基因，如潮霉素B磷酸转移酶，新霉素磷酸转移酶等。而目的基因由于其表达盒与筛选基因紧密相连，所以可与筛选基因的基因一起整合到高表达位点上，可明显的提高筛选克隆的阳性率和表达量。本发明的内含子可以为天然的内含子，也可以为合成的内含子。内含子在筛选基因的位置也不限于本发明实施例中所描述的位置，本领域人员所掌握的筛选基因内任何可以形成内含子的位点都可以在本发明的保护范围内。本发明所描述的载体还涉及一种弱化扩增基因的方法。本方法采用了组成性表达的弱启动子来启动扩增基因的表达。该弱启动子在真核细胞中的启动能力很弱，可明显降低筛选基因的表达能力，在相同的扩增剂使用浓度下，需要更大比例的扩增基因来获得耐受压力。采用本发明实施例中的Wdc弱启动子可明显的降低扩增剂的使用浓度，快速获得表达量大幅增加的克隆的比例和表达量。弱启动子的选择也是本领域专业人员所熟知的， 并不限于本发明所描述的Wdc启动子。扩增基因的选择也是本领域人员所掌握的，常用的包括DHFR-MTX，AMP脱氢酶-adenosine系统等都可以用来扩增目的基因的拷贝数。本发明涉及用稳定表达载体转染哺乳细胞筛选获得稳定表达细胞株的表达方法。本发明所涉及的哺乳动物细胞优选采用DHFR作为扩增基因的细胞系，优选采用 CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)和CH0-DG44 (Urlaub. G. et al. ,Cell 1983，33，405-412)这两种 dhfr缺陷型细胞株。本发明所描述的表达载体转染哺乳动物细胞可采用多种本领域已知的方法。可用的转染方法包括脂质体介导的转染，磷酸钙介导的转染，电转和阳离子介导的转染，微注射和病毒感染。本发明优选采用的是hygmycin抗生素筛选系统，本发明的稳定株载体转染后，可采用较高浓度的hygmycin进行筛选，获得的克隆数将明显少于未优化的克隆，并且克隆的阳性率和表达量有明显的提高。hygmycin的使用浓度是本领域人员所熟知的，为了提高筛选效率，本发明将hygmycin的浓度提高到了 2. Omg/ml的极限浓度范围。本发明的转染克隆的dhfr表达明显弱化后，MTX的筛选浓度也采用了较低的浓度。本实施例中MTX的使用浓度为10nM，30nM，IOOnM和300ηΜ，这些使用浓度并不是本发明所局限的。实施例一高效表达载体的构建真核表达载体的构建是基于商业化的pcDNA3/hyg载体基础上获得的，将原载体上的CMV启动子替换为低启动效率的人泛醌蛋白启动子(hW3C)。具体做法为本专业人士所熟知的。设计 Mbc-F 上游引物 5’ GCTTCGCGAGATCTGGCCTCCGCGC3，(SEQ ID N0:1)禾口 hUbc-R 下游引物 5，AGCAAGCTTGTCTAACAAAAAAGCC 3，(SEQ ID NO :2)，PCR 商品化的载体 Ubc. IkBSR-Flag Pgk. Cre 质粒，获得 1. 2kb 的 hUbc 启动子 PCR 片段(SEQ ID NO :3)。该片段用Nru I和Hind III双酶切。pcDNA3/hyg载体用Nru I和Hind III双酶切后，酶切产物使用 promega WizardSV Gel and PCR clean-up System 纯化试剂盒进行纯化。用 TaKaRa 的DNALigation Kit Ver. 2. 1试剂盒将轻链表达盒与pcDNA3载体进行连接。获得的重组质粒pc3-Ubc，转化DH5a细菌后保存。二氢叶酸dhfr基因来自商品化的pSV2_dhfr载体，根据已知序列，设计dhfrPCR 上游引物 dhfr-F 5‘GCCAAGCTTATGGTTCGACCATTGA 3，(SEQ ID NO 4)和下游引物 dhfr-R 5，CAGTCTAGATTAGTCTTTCTTCTCG 3，(SEQ ID NO 5)，从 pSV2_dhfr 载体中扩增获得 dhfr 基因的序列(SEQ ID NO :6)。该片段用Hind III和Xba I双酶切。pc3_Ubc载体用Hind III 和 Xba I 双酶切后，酶切产物使用 promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System 纯化试剂盒进行纯化。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver. 2. 1试剂盒将轻链表达盒与 pc3-Ubc载体进行平端连接。获得的重组质粒pc3-Ubc-dhfr，转化DH5 α细菌后保存。Pst I酶切pc3-Ubc-dhfr载体，该酶切位点位于hygmycin耐受基因(潮霉素B磷酸转移酶)的基因内部，插入一段通过基因拼接获得的内含子序列。CTGCAGGTAAATCAGTGA TATCTACTAACTCTCTCCTGCCTCTCCCTCCTTTTTTTTTTTCCTGCAG(SEQ ID NO :7)，设计基因拼接引物 Iig-F :5，GCTCTGCAGGTAAATCAGTGATATCTACTAACTCTCTCCTGCCTCT 3，(SEQ ID NO :8)和反向引物 Iig-R 5‘GCTCTGCAGGAAAAAAAAAAAGGAGGGAGAGGCAGGAGAGAGT 3，(SEQ ID NO :9)。将 2 条引物按 50uM，Iul 的量混合，加入 2ul IOx PCR buffer, 0. 2ul PCR 酶，1.4uM dNTP 2ul 混合后，补加水到20ul总体积，加入到PCR仪中。反应条件为94度5分钟，37度10分钟， 72 度 30 分钟。将拼接产物用 promega Wizard SV Gel and PCRclean-up System 纯化试剂盒进行纯化。纯化产物用I3St I酶切后，用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver. 2. 1试剂盒将轻链表达盒也用I3St I酶切的pc3-Ubc-dhfr载体中，构建重组的pSCT_dhfr表达载体， 载体具体结构见
图1。实施例二 IFN γ Rl-Fc融合蛋白的基因载体的构建高效启动的启动子CMV-IE序列可从pDendra2-N(Clonetech公司)载体中PCR 获得，将启动子序列用 promoter-F 5’ GCTTCGCGAAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG 3’ (SEQ ID No: 10)和 promoter-R 5，AGCAAGCTTGGATCTGACGGTTCACTAAACCAGC 3，(SEQ ID No 11)PCR 获得后(SEQ ID No 12), Nru I 禾口 Hind III 双酶切，pcDNA3 载体也用 Nru I+Hind III 双酶切后，进行连接，构建pc3-CMVIE载体。全基因合成IFN γ Rl-Fc融合蛋白基因，Hind ΙΙΙ+Xba I 双酶切，用 promegaWizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化。pc3-CMVIE载体也用Hind ΙΙΙ+Xba I酶切，与片段连接后形成pc3_CMVIE_IFN γ Rl-Fc 表达载体。实施例三IFN γ Rl-Fc融合蛋白的CHO稳定株表达载体的构建将pc3-CMVIE_IFN y Rl-Fc 载体用 Nru I+Nae I 酶进行酶切，采用 promegaWizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒胶回收3. 41Λ左右的片段。该片段包含了 IFN y Rl-Fc的整个表达盒，将该表达盒插入到pSCT-dhfr CHO稳定细胞株表达载体中。 pSCT-dhfr用EcoR V酶切后，纯化试剂盒纯化线性化片段，用CIAP将载体去磷酸化，再用纯化试剂盒纯化后，与3. 4kb的IFN y Rl-Fc表达盒进行连接，构建获得pSCT_IFN y Rl-Fc CHO 稳定株表达载体，载体图示见图2。实施例四IFN γ Rl-Fc融合蛋白的CHO稳定细胞株的构建本发明中，表达蛋白细胞如CHO细胞可培养于多种培养基中。商业化的培养基如DMEM，MEM, Ham，s F12, RPMI-1640 (Gibco)都可用于宿主细胞的培养。此外，Ham et al. , Meth. Enz. 1979 58 44 ；Barnes et al. , Anal. Biochem. 1980 102 255 ；U. S. Pat. Nos. 4，767，707 ；4, 657，866 ；4, 927，762中的培养基均可用于培养宿主细胞。宿主细胞的培养条件，如温度，PH值等也是本领域技术人员熟知的常规条件。转染哺乳动物宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为 CHO/dhfr—细胞时，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法Jordanet al.，Nucleic Acids Res. 1996 24 :4，脂质体包装法(如 lipofectamine2000)Audouy S. et al.，Mol Membr Biol. 200118 U) :129，电穿孔法和显微注射法Morrison et al.，Science. 1985 229:1202。我们采用 Iipofectamine 2000 (Cat :invitrogen)转染法，按其使用说明， 将15 μ g表达载体质粒和45 μ 1 Iipofectamine 2000的混合物，各转染6X IO6个CHO/ dhfr_细胞，过夜转染后，将细胞平均分配到80块96孔板中进行选择基因的筛选。IFN γ Rl-Fc融合蛋白表达载体pSCT-IFN γ Rl-Fc转染的CHO细胞在DMEM+5 % dFBS+0. 4mg/ml hygmycin 下进行筛选，2 3 天后更换为 DMEM+5 % dFBS+2. Omg/ml hygmycin筛选培养基，培养2_3周各获得100多个筛选细胞克隆。IFNyRI融合蛋白对照载体pSV2-dhfr-IFN y Rl-Fc按相同的筛选方法，获得了 500多个筛选细胞克隆。将两种表达载体转染CHO细胞各随机挑选30个单克隆按相同的密度0. 2 X IOVcm2传至M孔板中， 在0. 5ml DMEM+5% dFBS培养基中培养5天，计数细胞。并且ELISA检测培养基上清液中 IFN y Rl-Fc融合蛋白的表达量。IFN γ Rl-Fc融合蛋白的ELISA方法为羊抗人IgG-Fc多抗4°C过夜包被，室温下 2% BSA封闭池后，加入不同稀释度的细胞培养上清液，温育lh。加入HRP标记的羊抗人 IgG-Fc多抗。TMB显色，读取0D450的值。IVC(时间积累活细胞密度)的计算方式为前一代细胞的时间积累活细胞密度 + (收样时活细胞密度-接种时活细胞密度)Λ2Χ (收样时培养时间-接种时的时间))， Qp (生产力)的计算公式为表达产物的浓度/时间积累活细胞密度。这30个克隆的ELISA 表达量，IVC和Qp结果见图。本发明的载体经过hygmycin抗生素筛选后，所获得的100个克隆中随机挑选的30克隆，在含血清的贴壁培养下5天，有70%的细胞的Qp超过了 lug/le6 细胞/天，40%的细胞超过了 2ug/le6细胞/天。而对照的载体所随机挑选的30个克隆中， 只有10%的克隆的Qp达到了 lug/le6细胞/天，见图4。
实施例五IFN γ Rl-Fc融合蛋白的CHO稳定细胞株的扩增为了使hygmycin筛选的IFN γ Rl-Fc融合蛋白细胞更高效的表达，每种载体重组细胞的30个表达细胞都用MTX进行扩增表达。细胞加压扩增培养的技术是本领域人员都熟知的。具体操作为，重组CHO细胞在DMEM+10% dFBS培养基中培养，并在培养过程中加入逐步增加的MTX浓度，培养过程中持续监测抗体的表达水平，当MTX浓度增加到细胞生长无法耐受时停止增加MTX浓度。本发明的载体有弱化dhfr表达的考虑，因此 pSCT-IFN y Rl-Fc载体转染克隆的MTX加压递增浓度设定为10nM，30nM, IOOnM和300nM， 而pSV2-dhfr-IFN Y Rl-Fc载体转染克隆，按照文献报道值，MTX加压递增浓度设定为 200nM, 600nM和1800nM。当MTX分别增至300nM或1800nM时，细胞按相同的数量接入含 5mlDMEM+5% dFBS+300nM或1800nM MTX培养基的T25培养瓶中，培养五天后ELISA检测培养基清液中IFN y Rl-Fc融合蛋白的表达量，计数细胞获得IVC，并计算获得Qp数据，结果见图。大部分pSCT-IFN γ Rl-Fc载体转染克隆的Qp达到了 40ug/le6细胞/天以上的水平， 最高的克隆达到了 60ug/le6细胞/天，明显优于高于pSV2-dhfr-IFN y Rl-Fc载体的最高 26ug/le6细胞/天的表达水平。在含血清的贴壁培养条件下，加压后的pSCT-IFN γ Rl-Fc 载体转染克隆的表达量超过了 100mg/L，而pSV2-dhfr-IFN y Rl-Fc载体转染克隆的表达水平都小于40mg/L。并且前者的MTX加压浓度为300nM，而后者的MTX浓度为1800ηΜ，是前者的6倍，见图5。
权利要求
1.一种获得目的蛋白稳定表达的真核细胞表达载体，该载体包含a)一个包含强病毒启动子的目的蛋白表达盒，该表达盒放置于筛选标记的基因内部；b)一个包含弱病毒启动子的筛选标记表达盒，该筛选标记基因序列中加入了内含子元件，目的蛋白的表达盒被放置于该内含子元件中；c)一个包含弱真核细胞启动子的扩增标记的表达盒。
2.权利要求1所述的表达目的蛋白的表达盒中的强病毒启动子包含人CMV启动子部分加上人CMV内含子部分，该强病毒启动子的序列为SEQ IDNO :12。
3.权利要求1所述的强病毒启动子表达盒使IFNyRI受体FC融合蛋白在未扩增CHO 细胞株的平均表达水平达到1 3皮克/细胞/天。
4.权利要求1所述的内含子元件位于筛选标记基因的内部，该载体仍表达出有活性功能的筛选标记，该内含子元件的序列为SEQ ID NO :7。
5.权利要求1所述的筛选标记的表达盒使在相同筛选剂浓度下耐受生长的细胞克隆数量明显减少，表达目的基因的细胞克隆的比例及表达量都明显偏高。
6.权利要求1所述的筛选标记为潮霉素B磷酸转移酶，新霉素磷酸转移酶，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或谷氨酰胺合成酶。
7.权利要求1所述的扩增标记表达盒使在较低扩增剂浓度的压力下基因扩增，抗体的表达量得到迅速增加。
8.权利要求1所述的弱真核细胞启动子为弱化的人泛醌蛋白启动子(hW3C)，该启动子的序列为SEQ ID NO :3ο
9.权利要求1所述的扩增标记为二氢叶酸还原酶(DHFR)，扩增剂为氨甲喋呤(MTX)。
10.一种目的蛋白稳定表达细胞株的筛选方法，该筛选方法包括a)用筛选标记的抗生素筛选获得的目的蛋白稳定表达的细胞株；b)用扩增标记的基因扩增筛选获得的目的蛋白表达水平明显提高的细胞株。
11.权利要求10所述的蛋白稳定表达细胞株为dhfr基因缺陷型的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞株。
12.权利要求10所述的筛选标记为潮霉素B磷酸转移酶时，所使用的筛选剂Hyg的使用浓度为0.4 2. Omg/ml。
13.权利要求10所述的扩增标记物为二氢叶酸还原酶时，所使用的扩增剂MTX的使用浓度为30nM 300nM。
14.一种目的蛋白表达方法，该方法包含用权利要求1所述的真核细胞表达载体和权利要求10所述的筛选方法获得的稳定表达CHO细胞株。
15.权利要求14中所述的蛋白是受体蛋白，细胞因子，抗体，激酶或其他功能蛋白。
16.权利要求14所述的蛋白表达方法使IFNyRI受体FC融合蛋白的表达水平大于 100mg/L,单位细胞表达水平(Qp)达到50 60皮克/细胞/天。
17.权利要求16所述的蛋白表达水平是细胞在含血清贴壁条件下培养获得的。
全文摘要
本发明提供了一种在哺乳动物细胞中高效表达的载体，该载体将目的基因表达和筛选基因潮霉素B磷酸转移酶表达紧密连接在一起，该载体采用弱化扩增基因DHFR的表达来提高MTX筛选效率，降低MTX使用浓度的技术。本发明提供了采用以上技术优化的表达载体转染细胞后，获得高水平表达克隆的筛选方法。
文档编号C12N15/52GK102559734SQ20101060367
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者孙春昀, 盖文琳, 罗春霞, 谢良志 申请人:神州细胞工程有限公司