专利名称：单链非编码MicroRNA及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种MicroRNA的乙肝重症病人血浆中的表达水平及其在诊断乙型肝 炎重症化中的作用。
背景技术：
目前全球估计有3. 5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过 HBV0在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60%，约有1. 2亿人 携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。乙肝重型肝炎是一类表现为短期大量肝细胞坏死导致肝功能衰竭的综合症，其死 亡率极高，发展迅速，凶险而且临床预后差。并严重威胁人们身体健康的肝疾病，因此，早期 诊断，以便及时采取有效的治疗措施尤其重要。MicroRNA是由机体内源基因转录的约70nt的发夹状结构前体(pre-MicroRNA)被 Dicer酶切割后产生的约22nt的非编码单链RNA片段，在进化过程中高度保守，能通过与靶 基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控 靶基因的表达。MicroRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优点，为基因 调控的研究和基因治疗的发展带来了新的视角。MicroRNA非常稳定，用于临床诊断试剂的 研发具有重复性好、容易操作等优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用单链非编码MicroRNA let-7a-l制备诊 断试剂盒以诊断重症肝炎。为了解决上述技术问题，本发明提供一种单链非编码MicroRNA，单链非编码 MicroRNAlet-7a-l 为 SEQ ID NO 1 所示的序列。本发明还同时提供了上述单链非编码MicroRNA let-7a_l在制备诊断乙型重症肝 炎的诊断试剂中的应用。本发明还同时提供了一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，包括PCR试剂、探针、 上游引物和下游引物；探针为SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物为SEQ ID NO :3所示的 序列，下游引物为SEQ ID NO :4所示的序列。作为本发明的用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒的改进PCR试剂为 IXTaqManUniversal PCR MasteMix。MicroRNA是一类高度保守的单链RNA(约22个核苷酸)，生物信息学分析表明， 每个microRNA可能调节数百个靶基因，提示microRNA可能参与调节细胞生命活动中众多 的信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程中发挥作用。 另外，MicroRNA的异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生，相反疾病的产生也将导致 MicroRNA的表达水平的改变，人们可以利用它来反映疾病的程度并做出相应的治疗。MicroRNA序列测定相对简单，通过基因工程技术可以比较容易地分离纯化人类外周血中存在的MicroRNA，并对其进行测序。到目前为止已经报道了超过800个MicroRNA序 列，但是由于MicroRNA功能的复杂性，大部分MicroRNA的功能和用途仍属未知，因此，寻找 和开发有用的MicroRNA用于临床诊断和治疗是当前研究热点。美国应用生物系统公司根 据目前的研究现状研发了 MicroRNA芯片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知 的MicroRNA的反转录引物，利用该芯片可以检测出已知序列的这些MicroRNA表达水平的 变化情况。本发明利用该芯片对乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA进行检测，以正常人为 对照，对患者作一个比较全面的MicroRNA图谱，从中找出与乙型肝炎重症化病情变化密切 相关的MicroRNA分子。利用该分子可研发预测和诊断肝炎重症化诊断试剂。在本发明中，发明人通过检测乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA let-7a-l的表 达水平，观察乙型肝炎重症状态下MicroRNA的改变情况。本发明选取正常人和已被确诊为 乙型肝炎重症患者的血浆，从血浆中提取RNA，利用MicroRNA表达谱芯片(美国应用生物 系统公司 Taq Human MicroRNA Array A(B))对 MicroRNA 进行分析。结果发现，MicroRNA let-7a-l在乙型肝炎重症患者血浆中显著上调，S卩，该MicroRNA在乙型肝炎重症患者血浆 中表达较正常人明显增高。提示MicroRNA let-7a_l在乙型肝炎重症化中起着重要的调控 作用，同时该MicroRNA可以作为乙型肝炎重症化的诊断标志物。采用本发明的方法来早期诊断乙型肝炎重症化，具有如下优点本发明确认了 MicroRNA let-7a-l作为诊断乙肝重型肝炎的潜在靶点，能用于快 速检测和诊断。microRNA在血浆和血清中非常稳定，它们有效保护以免接触RNases，在严酷环境 的条件下仍能保持稳定。因此，它们的稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值吻 合的很好。血清中microRNA表达谱的检测技术已经成熟，目前研究microRNA表达谱的常 用技术主要有Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等，方法快速、便 捷，精确度和灵敏度可满足临床需求。血清microRNA作为临床诊断和预后的标志物，主要有以下优点检测的损伤小、 稳定性好、灵敏度高，可应用于疾病早期变化的检测。目前尚未见用于诊断乙型肝炎重症 化的microRNA，但是microRNA用于诊断其他疾病已经获得许多令人鼓舞效果例如血浆 miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89 %，特异性达到70 %，且肿瘤切 除后miR-92的表达量较术前显著降低；早期诊断可以大大提高生存率和改善预后。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是MicroRNA表达谱芯片检测结果，正常人中MicroRNA let-7a_l几乎不表达， 而乙型肝炎重症患者则明显的高表达。
具体实施例方式实施例1血浆中总RNA的提取选取浙江大学医学院附属第一医院，乙型肝炎重症患者4例，同时选取4例年龄、 性别相匹配的正常人，抽取細1全血；即抽取乙型肝炎重症患者的全血、正常人的全血各4 例。以TOsnRNA作为内参，MicroRNA的相对表达水平用表示，检测方法相同。实时荧光定量PCR根据美国应用生物系统公司提供的TaqMan MicroRNA Arrays进行操作。为了减少个体差异我们把不同组的血浆进行混合(即，4例患者的血浆进行混合， 4例正常人的进行混合)。利用mirVana PARIS Kit来从血浆样品中提取总RNA，提取方 法根据该试剂盒的说明书操作，过程依次如下1.将血浆样品(最大体积625 μ L)(冰上冻融)与等体积的2Χ Denaturing Solution室温混勻。如果血浆样品少于lOOul，先加Cell Disruption Buffer到彡100 μ L， 再加入等体积的2X Denaturing Solution，立刻充分混勻(涡旋30s)，冰上孵育5min。2.加入试剂盒中所提供的酸化的酚/氯仿到上述混合液。3.涡旋震荡30-60s混勻。4.室温10，OOOXg离心5min分离出水相和有机相(水相在上层)。5.转移位于上层的水相到新的EP管，并标注体积。6.加入水相1. 25倍体积的100%乙醇(室温)到水相，充分混勻。7.将过滤柱置于Collection Tube (收集管)中，吸取裂解物和乙醇的混合物(即步骤6所得)到过滤柱上。8. 10，000 Xg 离心 30s。9.弃滤液，重复离心，直到所有的裂解物/乙醇混合物都滤过过滤柱为止。将过滤 柱重新置于收集管中。加入700yL MicroRNA Wash Solution 1到过滤柱。10，OOOXg离 心 15s。10.弃滤液，置过滤柱到相同的收集管。11.加入 500 μ L Wash Solution 2/3 到过滤柱。10，000 X g 离心 15s，弃滤液，置 过滤柱到相同的收集管。12.重复步骤11。13. 10，000X g 空离 Imin014.转移过滤柱到新的收集管。15.加入IOOyL预热(95 °C )的洗脱液或者无核酶水到过滤柱中央，闭盖， 10，OOOXg离心30s，弃柱，收集总RNA，-20°C保存或更低温度保存。以下实施例中所用的试剂均为常规试剂，能通过市购的方式获得，例如，可购自美 国ABI公司。实施例2预扩增1.进行逆转录(RT)(1)冻融以下试剂Megaplex RT PrimersTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit componentSMgCl2反应体系3 μ L (1 to 350ng) total RNA (实施例 1 所得)4. 5μ L of RT reaction mix(如表 1)(2)混合以下试剂(如表1所述)到1. 5ml微离管。表 1Megaplex TM RT primers (IOX)0.8
dNTPs with dTTP(IOOmM)(λ2
MulL丄Sor丄be TM Reverse
1. 5
Transcriptase(50U/ul)
IOXRT BufferoT§
MgCi2 (25mM)(λ9
RNase Inhibitor (20 U/ul)(Π
Nuclease-free water0.2
总体积(3)倒置管6次以混勻，稍微离心一下数秒。(4) ^96-well MicroAmp Optical Reaction Plated MicroAmp 8-Tube Strip 中，吸取4. 5 μ L RT反应混合物到各孔或管。(5)加入3 μ L(lto 350ng)总RNA到含有RT反应混合物的各孔或管，得到7. 5ul 体积的混合液。(6)用 MicroAmp Clear Adhesive Film 或 MicroAmp Optical Strip Caps 封 口，接着倒置板或管6次以混勻，稍微离心一下。(7)冰浴 5min。(8)设置以下RT运行条件(表2)，反应体积7· 5 μ 1。表 2
、Hm
40个循环 6 ^
42 Im
50°C1 s
85 ^
4Τ获得的cDNA可以-15to_25°C保存一周以上。2.预扩增反应预扩增反应体积25 μ L 2. 5 μ L RT产物(即上述RT步骤所得的cDNA)22. 5μ L PreAmp reaction mix(如下表 3 所示)(1)冰上冻融 Megaplex PreAmp Primers，倒置管 6 次以混勻。
(2)回荡瓶以混勻 TaqMan PreAmp Master Mix(2X)。(3)混合以下试剂(表3)到1. 5ml微离管。表 权利要求
1.单链非编码MicroRNA，其特征是单链非编码MicroRNAlet-7a-l为SEQID N0:1所 示的序列。
2.如权利要求1所述的单链非编码MicroRNA在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用。
3.一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，其特征是包括PCR试剂、探针、上游引物和 下游引物；所述探针为SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物为SEQ ID NO :3所示的序列，下 游引物为SEQ ID NO :4所示的序列。
4.根据权利要求3所述的用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，其特征是所述PCR试剂 % 1X TaqMan Universal PCR MasteMix。
全文摘要
本发明公开了一种单链非编码MicroRNAlet-7a-1，为SEQIDNO1所示的序列。本发明还同时公开了上述单链非编码MicroRNAlet-7a-1在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用。本发明还同时公开了一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，包括PCR试剂、探针、上游引物和下游引物；探针为SEQIDNO5所示的序列，上游引物为SEQIDNO3所示的序列，下游引物为SEQIDNO4所示的序列。
文档编号C12Q1/68GK102127547SQ20101060596
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者刘东成, 李淑萍, 郑敏, 陈 峰, 陈智 申请人:浙江大学