专利名称：一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条及其制备和应用的制作方法
技术领域：
一种胶体金标记的适配体的金标试纸条检测西瓜果斑病毒的方法，属于胶体金检 测技术领域。
背景技术：
西瓜、甜瓜病害发生普遍，有些已经得到有效的控制。但是瓜类细菌性果腐病，也 称为果斑病(Bacterial Fruit Blotch，简称BFB)作为近几年来呈上升趋势的一种病害，对 瓜类的生产构成了极大威胁。果实发生该病后用药防治基本上没有效果，果实腐烂失去商 品价值，瓜农损失惨重。由于该病害的主要传播方式是种子带菌，所以也给我国的西瓜、甜 瓜种殖业和种子出口带来了严重冲击。细菌性果腐病的发生已经成为西瓜、甜瓜生产上急需解决的问题之一，怎样预防、 及早发现并进行有效的防治也成为西瓜、甜瓜生产上的首要任务。目前针对该病害，国内外 就病原菌的鉴定、检测技术、带菌种子的处理等方面作了比较多的研究，但是关于侵染循环 等基础研究仍十分薄弱。
发明内容
本发明的目的是提供胶体金标记的适配体的金标核酸试纸条用于检测西瓜果斑 病毒，该方法具有快速、灵敏度高、操作简单等优点。本发明的技术方案
Aptamer ①3-HS - AAAAAAAAAAAACGGTAGGGCGAAGAAACCAACACC, Aptamer ②5-Biotin-TTT TTT TTT TTT TTT TTT, Aptamer ③5_Biotin- GCCATCCCGCTTCTTTGGTTGTGG,
streptavidin 与 biotin-Aptamer ②反应生成 streptavidin-Aptamer ②， streptavidin 与 Aptamer ③反应生成 streptavidin-Aptamer ③,Aptamer ①、Aptamer ②、 Aptamer ③、streptavidin-Aptamer ②、streptavidin—Aptamer ③，均购自上海生工生物 工程有限公司。Streptavidin 阿拉丁试剂公司购买
一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条，由下吸水垫1，胶体金偶联Aptamer①2， streptavidin- Aptamer (2) 3, streptavidin- Aptamer (3) 4,5,^ !! 6
和底板7所组成；硝酸纤维素膜6固定于底板7上，硝酸纤维素膜6 —端与上吸水垫5相 联；而另一端或者与下吸水垫1相联，或者通过固定于硝酸纤维素膜6 —端的胶体金偶联 Aptamer①2与下吸水垫1相连；
胶体金偶联 Aptamer ① 2、streptavidin-Aptamer ② 3、streptavidin- Aptamer ③ 4 间隔地顺序复合在硝酸纤维素膜6上；
其中，以str印tavidin-Aptamer②3作为检测带，以str印tavidin—Aptamer③4作为 参照带；测试纸宽度不低于3. 5 mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5 mm/
mirio所述的西瓜果斑病毒金标核酸试纸条的制备方法
(1)biotin修饰的适配体Aptamer②与str印tavidin按摩尔比1:4反应生成 streptavidin-Aptamer ②；
(2)biotin修饰的Aptamer③与str印tavidin按摩尔比1:4与反应生成 streptavidin-Aptamer ③；
(3)上吸水垫5和下吸水垫1分别贴于底板7上与硝酸纤维素膜6串联；下吸水垫1或 者与固定于硝酸纤维素膜6 —端的胶体金偶联Aptamer①2部分交叠；
(4)下吸水垫1、胶体金偶联Aptamer①2及上吸水垫5底面有不干胶纸用于固定于底 扳7上。用所述试纸条检测西瓜果斑病毒的方法
(1)样品制备
西瓜表面病斑处用5%次氯酸钠溶液消毒后，分别切取病斑周围和内部尚未有病斑扩 展的组织，在无菌水中研碎静置30min后，用灭菌的接种环蘸取浸泡液在干燥的YDC培养 基平板表面划线，置于恒温箱中培养，培养一星期后得到西瓜果斑病毒，刮取培养皿表 面西瓜果斑病毒溶于超纯水中，即得到待测样本；
所述YDC培养基为酵母粉葡萄糖氯霉素琼脂培养基；
(2)操作
将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫，浸入30s，取出放平，IOmin读取 结果；
(3)检测结果 阴性
检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明样品中不含西瓜果 斑病毒；
检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明样品的西 瓜果斑病毒含量低于lOng/mL ； 阳性
检测带、参照带两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中西瓜果 斑病毒含量超过lOng/mL ；
检测带不显色，参照带显色，说明样品中的西瓜果斑病毒含量高于15 μ mol/L。本发明检测原理是利用吸水垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测物质首先与胶体 金偶联Aptamer①发生竞争形式的结合，其后果是，当偶联Aptamer①过量时，多余的适配 体漂移到检测带，与str印tavidin-Aptamer②结合并显色；而与检测物结合的胶体金偶联 Aptamer①，其V区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测带漂移到参照带以C区位点与 streptavidin-Aptamer③非特异性结合，同检测带进行比色而得到检测结果。本发明的有益效果本发明应用层析式一步竞争法原理，试纸条的上下带比色来 半定量检测样品中西瓜果斑病毒残留量，在15min内，快速准确地检测出样品是否含有西 瓜果斑病毒，以确定西瓜果斑病毒是否超标，能够满足食品安全对西瓜果斑病毒残留量检测需求，适用于饲料、屠宰企业及政府检测机构。本发明与现有技术相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、经济快捷、制作容易、 成本低廉的特点。
图1本发明西瓜果斑病毒金标核酸试纸条的侧视图。1、下吸水垫；2、胶体金偶联 Aptamer ①；3、streptavidin_Aptamer ②；4、streptavidin_Aptamer ③；5、上吸水垫；6、硝 酸纤维素膜；7、底板。
具体实施例方式以下结合附图做进一步说明。1、西瓜果斑病毒金标核酸试纸条
包括1、下吸水垫，2、胶体金偶联Aptamer①，3、streptavidin-Aptamer②，4、 streptavidin- Aptamer③，5、上吸水垫，6、硝酸纤维素膜，7、底板。L^streptavidin- Aptamer (2)^ ^, L^i, streptavidin- Aptamer 为参照带。膜条宽度不低于3. 5 mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5 mm/ min02、西瓜果斑病毒金标核酸试纸条的制备
biotin修饰的适配体Aptamer②与str印tavidin按摩尔比1:4反应生成 streptavidin-Aptamer ②，
biotin修饰的Aptamer③与str印tavidin按摩尔比1:4反应生成 streptavidin-Aptamer ③
上吸水垫5和下吸水垫1分别贴于底板7上与硝酸纤维素膜6串联；下吸水垫1或者 与固定于硝酸纤维素膜6 —端的胶体金偶联Aptamer①2部分交叠；
下吸水垫1、胶体金偶联Aptamer①2及上吸水垫5底面有不干胶纸用于固定于底扳7上。3、试纸要求
(1)阴性参考品符合率
用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 4)配制浓度为lOOng/mL的乙肝病毒标准品溶 液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在IOmin时观察结果，应为阴性。用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 4)配制浓度为lOOng/mL的甲肝病毒标准 品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在IOmin时观察结果，应 为阴性。(2)阳性参考品符合率
用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 4)配制浓度为1、5、10、15ng/mL的西瓜果斑病 毒标准品进行平行检测，各浓度进行10次平行实验，反应时间在IOmin时观察结果，不得出 现阴性。
(3)最低检出量
用磷酸盐缓冲液(PBS :0. 01mol/L、pH 7.4)分别配制浓度为0、1、5、10、15、20、IOOng/ mL的西瓜果斑病毒标准品溶液，各浓度进行10次平行实验，反应时间在IOmin时，以正常或 矫正目力观察结果，最低检出量不高于lOng/mL。(4)再现性
用磷酸盐缓冲液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 4)分别配制浓度为50ng/mL的西瓜果斑病毒 标准品溶液，进行10次平行实验，反应时间在IOmin时，以正常或矫正目力观察结果，结果 一致，显色度均一。(5)稳定性测试
37°C放置10天后，各项指标应符合以上要求。4、试纸使用方法 (1)样品制备
病瓜表面用5%次氯酸钠消毒后，分别切取病斑周围和内部尚未有病斑扩展的组织，在 无菌水中研碎静置30min后，用灭菌的接种环蘸取浸泡液在干燥的YDC培养基平板表面划 线，置于恒温箱中培养。培养一星期后得到西瓜果斑病毒。刮取培养皿表面病毒溶于 超纯水中，即得到待测样本。(2)操作
将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫1。浸入30sec取出放平，IOmin
读取结果。(3)检测结果 阴性
检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明样品中不含西瓜果
斑病毒。检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明样品 的西瓜果斑病毒含量低于IOppb (lOng/mL)。阳性
检测带、参照带两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中西瓜果 斑病毒含量超过lOng/mL。检测带不显色，参照带显色，说明样品中的西瓜果斑病毒含量高于 15 μ Μ(15μ mol/L)。
权利要求
1.一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条，其特征在于由下吸水垫(1)，胶体金偶联 Aptamer ①(2), streptavidin- Aptamer (2)(3), streptavidin- Aptamer ③(4),上吸水垫 (5),硝酸纤维素膜(6)和底板(7)所组成；硝酸纤维素膜(6)固定于底板(7)上，硝酸纤维素膜(6) —端与上吸水垫(5)相联；另 一端或者与下吸水垫(1)相联，或者与通过固定于硝酸纤维素膜(6)这一端的胶体金偶联 Aptamer①(2)与下吸水垫(1)相连；胶体金偶联 Aptamer ①(2)、streptavidin-Aptamer ②(3)、streptavidin- Aptamer ③(4)间隔地顺序复合在硝酸纤维素膜(6)上；其中，以 str印tavidin-Aptamer ②(3)作为检测带，以 str印tavidin—Aptamer (3)(4) 作为参照带；测试纸宽度不低于3. 5 mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5 mm/min0
2.权利要求1所述的西瓜果斑病毒金标核酸试纸条的制备方法，其特征在于(1)biotin修饰的适配体Aptamer②与str印tavidin按摩尔比1:4反应生成 streptavidin-Aptamer ②；(2)biotin修饰的Aptamer③与str印tavidin按摩尔比1:4反应生成 streptavidin-Aptamer ③；(3)上吸水垫(5)和下吸水垫(1)分别贴于底板(7)上与硝酸纤维素膜(6)相联；下吸 水垫(1)或者与固定于硝酸纤维素膜(6) —端的胶体金偶联Aptamer①(2)部分交叠；(4)下吸水垫(1)、胶体金偶联Aptamer①(2)及上吸水垫(5)底面有不干胶纸用于固 定于底扳(7)上。
3.用权利要求1所述试纸条检测西瓜果斑病毒的方法，其特征在于(1)样品制备西瓜表面病斑处用5%次氯酸钠溶液消毒后，分别切取病斑周围和内部尚未有病斑扩 展的组织，在无菌水中研碎静置30min后，用灭菌的接种环蘸取浸泡液在干燥的YDC培养 基平板表面划线，置于恒温箱中培养，培养一星期后得到西瓜果斑病毒，刮取培养皿表 面西瓜果斑病毒溶于超纯水中，即得到待测样本；所述YDC培养基为酵母粉葡萄糖氯霉素琼脂培养基；(2)操作将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫，浸入30s，取出放平，IOmin读取 结果；(3)检测结果阴性检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明样品中不含西瓜果 斑病毒；检测带、参照带两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明样品的西 瓜果斑病毒含量低于lOng/mL ；阳性检测带、参照带两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中西瓜果斑病毒含量超过lOng/mL ；检测带不显色，参照带显色，说明样品中的西瓜果斑病毒含量高于15 μ mol/L。
全文摘要
一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条及其制备和应用，属于胶体金检测技术领域。本发明利用吸水垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测物质首先与胶体金偶联Aptamer①发生竞争形式的结合，当偶联Aptamer①过量时，多余的适配体漂移到检测带，与streptavidin-Aptamer②结合并显色；而与检测物结合的胶体金偶联Aptamer①，其V区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测带漂移到参照带以C区位点与streptavidin-Aptamer③非特异性结合，同检测带进行比色半定量检测样品中西瓜果斑病毒残留量，能够满足食品安全对西瓜果斑病毒残留量检测需求，适用于饲料、屠宰企业及政府检测机构，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
文档编号C12Q1/68GK102128832SQ20101060674
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者勇倩倩, 匡华, 王利兵, 胥传来, 邓小芳, 陈伟, 马伟, 马文蔚 申请人:江南大学