一种碱性果胶酶pla及其基因和应用的制作方法

文档序号:588360阅读:814来源:国知局
专利名称:一种碱性果胶酶pla及其基因和应用的制作方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体地,本发明涉及一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用。
背景技术
果胶质是广泛存在于高等植物初生壁和细胞间隙中的一组多糖,在植物的细胞组织中起着“粘合”的作用。构成果胶质的基本单元是不同酯化度的半乳糖醛酸,D-半乳糖醛酸以α _1,4糖苷键相连接作为主链,并以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖及其他糖类连接在其主链上作为支链(Thakur BR, et al. Crit Rev Food Sci Nutr. 37 :47-73,1997) 果胶酶(pectinases)是分解果胶质的多种酶的总称。由于果胶质的化学结构比较复杂.能够催化其分解的果胶酶也是种类繁多。果胶酶根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质可以分为果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pectin lyases, PL)、果胶酉旨酶(pectin esterases, ΡΕ)禾口原果胶酶(Alkorta I, et al. Process Biochem33 :21-28,1998).果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。目前研究和应用较多的是酸性果胶酶,其酶作用最适PH在偏酸性范围,主要用于水果榨汁和果汁澄清。碱性果胶酶(Alkaline pectinase)则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶,一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase,简称PGL)。其最适pH在 8. 0-10.0,可以在高pH条件下断开果胶聚合物主链,产寡聚半乳糖醛酸。碱性果胶酶是非常重要的工业酶制剂之一,具有不可估量的潜在应用价值。目前,碱性果胶酶在植物药提取、茶和咖啡发酵、油提取,纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用越来越受到重视,所以成为人们研究的热点(Jayani RS, et al. Process Biochemistry 40 :2931-2944,2005) 碱性果胶酶多由细菌中的杆菌属和假单胞菌属产生(Hayashi K, et al. Phytochemistry 45 :1359-1363,1997),放线菌(Beg QK, et al. J Ind MicrobiolBiotechnol 24 :396-402,2000)和真菌产碱性果胶酶也有报道(Baracat et al. J IndMicrobiol 11 139-142,1993) 0不同来源的碱性果胶酶生化性质差异较为明显。 来源于 Bacillus licheniformis (Singh SA, et al. Process Biochem. 35 :411-417,1999) 禾口 Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersci (Pietro AD,et al. FEMS Microbiol Lett. 145 295-298,1996)的碱性果胶酶的最适 pH 为 11. O。来源于 Bacillus alcalophillusNTT33 果胶酶的最适 pH 为 9. 5(Zhai C,et al. Enzyme and Microbial Technology. 33 :173-178, 2003)。来源于 Pseudomonas marginal is CFBP 1沘7 的果胶酶的最适 pH 为 8. 5-9. O (Membre and Burlot,Appl Environ Microbiol. 60 :2017_2022,1994)。报道的碱性果胶酶的最适温度在30-70°C之间。一些碱性果胶酶的基因已经被克隆,并且已经大肠杆菌、毕赤酵母等表达系统中进行了表达(Zhai C, et al. Enzyme andMicrobial Technology. 33 173-178, 2003;王芸等,微生物学通报,35 C3) :341-345,2008)。但碱性果胶酶的表达量仍然很低,由于成本问题,至今未得到广泛应用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种产碱性果胶酶的菌株Klebsiella sp.Yl。本发明再一目的是提供来源于上述菌株的碱性果胶酶。本发明的再一目的是提供上述果胶酶的基因。本发明的再一目的是提供包含上述果胶酶的重组载体。本发明的再一目的是提供包含上述果胶酶基因的重组菌株。本发明的再一目的是提供一种制备碱性果胶酶的方法。本发明的再一目的是提供上述碱性果胶酶的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种性质优良的新 酶。本发明人筛选到ー种天然菌株,其来自于该克雷伯氏菌Klebsiella sp.,它所产生的果 胶酶适合于在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶エ业废水 处理及生物技术等行业中使用。本发明从上述菌株中获得了一种碱性果胶酶PLA,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示1 MKIAKITLAL GVLSLFSLNA GAQENERLSS VKQFADVVLD KASDRYGHYS51 PLLANGVDPR TGKQMEffVFP DGKVTVLSNF SAQQNLMRML VGLSNLTGET101 KYKQRVAENI RYYFDHYQDA SGLLLffGGHR FVDLKTLQPQ GPSEKERVHE151 LKNAYPYYDM MFAVDDQATA RFIKAFffNAH VYDffKTLETS RHGEYGKPMG201 ALffQSDFVQQ PPFFATKGLS FLNAGNDLIY SASLLYQYDG DAGALTffAKR251 LAEQYVLPRD KKTGLGVYQF TQPLKRADTS DDSDTHSKYG DRAQRQFGPE301 LGPDALEG匪 LLKGRTSTLY SENALMQLAL AKSLGKD⑶D LKKffTLDGLK351 AFATYAYDEQ NNTFRPMLAN GTDLSDYALK RDGYYGKKGT VLKAYPAGNE401 FLLSYARAffT LEPDHAIffKV ARGIAKGQGL GDIGEPGGTN RRLNSQTENH451 QPYAIFALID LffQSTGQRDY LTLADRIGAN IINKQRLNGF FVDDPEAEYA501 SIDSIAPYAL LALEAAFRNT PDAVAPFLNG AGFTEGAYRM ADGTVRYSTR551 DDELFRLRPG EQLKPNGKK*其中,该酶基因编码569个氨基酸和ー个终止密码子,N端22个氨基酸为其预测 的信号肽序列“ MKIAKITLALGVLSLFSLNAGA,,。因此,成熟的碱性果胶酶PLA的理论分子量为63. 8kDa,其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示1 QENERLSSVK QFADVVLDKA SDRYGHYSPL LANGVDPRTG KQMEffVFPDG51 KVTVLSNFSA QQNLMRMLVG LSNLTGETKY KQRVAENIRY YFDHYQDASG101 LLLffGGHRFV DLKTLQPQGP SEKERVHELK NAYPYYDMMF AVDDQATARF151 IKAFffNAHVY DffKTLETSRH GEYGKPMGAL WQSDFVQQPP FFATKGLSFL201 NAGNDLIYSA SLLYQYD⑶A GALTffAKRLA EQYVLPRDKK TGLGVYQFTQ251 PLKRADTSDD SDTHSKY⑶R AQRQFGPELG PDALEG匪LL KGRTSTLYSE301 NALMQLALAK SLGKD⑶DLK KffTLDGLKAF ATYAYDEQNN TFRPMLANGT351 DLSDYALKRD GYYGKKGTVL KAYPAGNEFL LSYARAffTLE PDHAIffKVAR
401 GIAKGQGLGD IGEPGGTNRR LNSQTENHQP YAIFALIDLff QSTGQRDYLT451 LADRIGANII NKQRLNGFFV DDPEAEYASI DSIAPYALLA LEAAFRNTPD501 AVAPFLNGAG FTEGAYRMAD GTVRYSTRDD ELFRLRPGEQ LKPNGKK*该果胶酶PLA同时具有好的pH稳定性,在低温(0°C )、常温及较高温下具备高活性、在碱性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到的克雷伯氏菌Klebsiella sp. Yl所产生的果胶酶,其最适ρΗ9· 0,在ρΗ7· 5-10. 0的范围内维持80%以上的酶活性;最适温度50°C,在20-60°C之间有85%以上的酶活,在0°C能维持35%以上的酶活。具有良好的PH稳定性,在pH5. 0-10. 5之间稳定;比活797U/mg ;极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。本发明还提供了编码上述碱性果胶酶的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了
这一碱性果胶酶基因plA,基因plA全长1710bp,该酶的全基因序列如SEQ IDNO. 3所示
1ATGAAGATTGCAAAAATCACTCTGGCATTGGGCGTTCTGAGTCTCTTCTCACTGAATGCG
61GGTGCCCAGGAGAACGAGCGCCTGAGCAGCGTAAAGCAGTTCGCCGACGTCGTGCTGGAC
121AAAGCAAGCGATCGGTACGGGCATTACTCTCCCCTGCTGGCTAATGGCGTGGACCCACGC
181ACCGGCAAACAAATGGAATGGGTATTTCCGGACGGTAAAGTGACCGTGCTGTCGAACTTC
241TCTGCCCAGCAAAACTTGATGCGGATGCTGGTAGGGTTAAGCAACCTGACTGGCGAAACA
301AAATATAAACAGCGGGTCGCGGAGAATATACGCTACTACTTTGACCACTATCAGGATGCA
361AGCGGGCTGCTGCTATGGGGAGGGCATCGTTTTGTTGATTTAAAAACGCTGCAGCCTCAA
421GGCCCAAGTGAAAAAGAGCGGGTTCATGAACTTAAGAATGCCTATCCCTATTACGACATG
481ATGTTTGCCGTCGATGACCAGGCGACCGCGCGCTTTATCAAGGCTTTCTGGAATGCCCAT
541GTTTACGACTGGAAAACGCTGGAAACCAGCCGCCACGGGGAGTACGGCAAACCGATGGGC
601GCGCTCTGGCAAAGTGATTTTGTCCAACAGCCGCCCTTTTTCGCCACCAAAGGTCTGAGC
661TTTCTCAATGCCGGCAACGACCTGATCTACTCCGCATCGCTGCTGTATCAATACGATGGT
721GACGCTGGCGCACTGACGTGGGCAAAACGGCTGGCCGAACAGTACGTTCTGCCGCGAGAT
781AAGAAGACCGGGCTGGGCGTATACCAGTTTACCCAACCGTTAAAACGCGCCGATACCAGC
841GATGACAGCGACACGCATTCGAAATACGGCGACCGCGCGCAGCGTCAGTTTGGCCCGGM
901CTGGGCCCGGACGCGCTGGAAGGCAATATGCTGCTTAAGGGCCGMCCAGTACGCTCTAT
961TCAGAAMTGCGCTGATGCAGCTTGCCCTGGCAAMTCGCTCGGCAAAGACGGTGACGAT
1021CTCAAAMATGGACTCTTGATGGCCTCAAGGCCTTCGCGACCTACGCTTACGATGAGCAG
1081AATAATACCTTCCGCCCGATGCTGGCCAACGGCACGGATCTCTCCGACTACGCGTTAAM
1141CGCGATGGCTATTATGGAAAMAAGGGACGGTGCTCAAAGCCTATCCGGCGGGMATGAA
1201TTTCTTCTCTCCTATGCCCGCGCCTGGACGCTTGMCCGGATCATGCCATCTGGAAGGTC
1261GCCCGCGGCATCGCGAMGGCCAGGGGTTAGGCGATATCGGTGAACCCGGCGGCACAAAC
1321CGCAGGCTGAATAGCCMACGGAGAATCATCAGCCGTATGCGATTTTCGCGCTTATCGAC
1381CTGTGGCAGTCCACCGGGCAGCGGGATTATTTGACGCTGGCGGATCGCATCGGCGCGAAC
1441ATCATCMCAAGCAGCGCCTCMCGGCTTTTTTGTCGATGATCCTGAGGCAGAATATGCC
1501AGTATCGATAGTATCGCCCCCTATGCGCTTCTCGCCCTGGAAGCCGCCTTCCGCAACACG
1561CCGGACGCGGTCGCTCCGTTCCTGAACGGCGCTGGATTCACGGAAGGCGCTTATCGGATG
1621GCTGACGGAACCGTGCGCTACTCCACCCGAGATGACGAGCTGTTCAGGCTCAGACCCGGT
1681 GAGCAGCTGA AACCGAACGG CAAAAAATAA其中,信号肽的碱基序列为ATGAAGATTGCAAAAATCAC TCTGGCATTG GGCGTTCTGAGTCTCTTCTC ACTGAATGCG GGTGCC。成熟蛋白理论分子量为63. SkDa0将碱性果胶酶基因plA DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。发现与来源于EntercAacter sp. 638的果胶裂解酶的核苷酸序列一致性为78. 9 %,氨基酸序列一致性为85. 8%。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。说明PLA是一种新的碱性果胶酶。这也是第一次从克雷伯氏菌中克隆得到碱性果胶酶基因。本发明还提供了包含上述果胶酶基因的重组ρ IA载体。本发明还提供了包含上述果胶酶基因plA的重组菌株。本发明还提供了一种制备碱性果胶酶的方法,包括以下步骤1)用上述重组载体转化宿主细胞,得重组菌株;优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。2)培养重组菌株,诱导重组果胶酶的表达;以及3)回收并纯化所表达的果胶酶。本发明还提供了上述碱性果胶酶的应用。本发明的碱性果胶酶的最适pH为9. 0,在pH7. 5-10. 0之间有80%以上的酶活。具有良好的PH稳定性,在pH5. 0-10. 5之间稳定;比活797U/mg ;极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂,在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。


图IplA在大肠杆菌中表达的果胶酶的SDS-PAGE分析,1,分子量标准;2。3诱导培养基上清;4,穿透峰 5,NTA-O ;6,NTA-20 ;7,NTA_40 ;8,NTA_60 ;9,NTA_80 ;纯化的重组果胶酶。图2本发明重组果胶酶的最适pH值。图3本发明果胶酶的pH稳定性。图4本发明果胶酶最适反应温度。图5本发明果胶酶的热稳定性。图6本发明果胶酶的金属离子抗性
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体宿主大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3),载体 pET_22b (+), 购自于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司,连接酶购自hvitrogen公司。 果胶、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司,其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基
(1)诱导选择培养基0. 5%果胶,0.5%蛋白胨,0.5%酵母提取物,0. KH2PO4, 0. 2% CuSO4,0. 1% CaCl2, ρΗ9· 0。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl,ρΗ7.0)。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1克雷伯氏菌果胶酶编码基因plA的克隆克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)来源于广西果汁厂的土样,提取克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.)基因组DNA 将在LB培养基中30°C培养了 2d的菌液IOOOOrpm离心 IOmin,称取50mg菌泥加500 μ L无菌水清洗,离心取沉淀的菌体。沉淀的菌体重悬于500 μ L 溶菌酶混合液,37°C温育lh,再补加酶液100μ L于45°C继续保温30min,至菌液透明后,加 10% SDS至终浓度2%,搅拌约5min至菌液粘度显著下降,15000rpm离心IOmin去碎片。上清液分别用等体积酚,酚氯仿,氯仿依次抽提。取上层溶液加0. 6-1倍体积的异丙醇常温沉淀lOmin。16000rpm离心15min。沉淀用70%乙醇清洗,稍离心,将沉淀抽干后用30 μ L 无菌水溶解,-20°C保存备用。根据发表的果胶裂解酶的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列保守序列GLF(L)Y(L)WGGH和RQFGPE,并设计合成了简并引物PL9-F, 5 ‘ -CTGTTYTAYTGGGGYGGRCA-3 ‘ ;PL9-R, 5 ‘ -CTCNGGNCCRAAYTGTCG-3 ‘ (Y 代表 C/T,R 代表G/A,N代表A/T/C/C),以克雷伯氏菌Yl的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为 950C 5min ;94°C 30sec, 53-48°C 30sec (其中每个循环后复性温度下降 0. 5°C ),72°C lmin, 10个循环,然后进入第二个循环程序94°C 30sec,48°C 30sec,72°C lmin,25个循环后; 72°C lOmin,琼脂糖电泳检测。得到的片段测序。根据测序得到的核甘酸序列,设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向,sp2的位置设计在spl的内侧,sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定,引物长度一般22 30nt,退火温度在60 65°C。并将它们分别命名为uspl,卿2,usp3(上游特异性引物),dspl, dsp2, dsp3(下游特异性引物)见表1。表1果胶酶plA TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种碱性果胶酶PLA,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种碱性果胶酶PLA,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种碱性果胶酶基因plA,其特征在于,编码权利要求2或3所述的果胶酶PLA。
4.如权利要求3所述的果胶酶基因plA,其特征在于,其碱基序列如SEQID NO. 3所示。
5.包含权利要求3或4所述果胶酶基因plA的重组载体。
6.包含权利要求3或4所述果胶酶基因plA的重组菌株。
7.一种制备果胶酶的方法,其特征在于,包括以下步骤1)用权利要求5重组载体转化宿主细胞,得重组菌株;2)培养重组菌株,诱导重组果胶酶因的表达;以及3)回收并纯化所表达的果胶酶PLA。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
9.权利要求1或2所述的果胶酶PLA的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域,具体地,本发明涉及一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用。根据本发明的碱性果胶酶PLA,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本发明的碱性果胶酶的最适pH为9.0,在pH7.5-10.0之间有80%以上的酶活。具有良好的pH稳定性,在pH5.0-10.5之间稳定;比活797U/mg;极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂,在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。
文档编号C12N1/19GK102559638SQ20101060922
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者张菁, 苑鹏, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司
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