专利名称：一种与欧美杨花药发育相关MYB基因PeMYB103及其RNAi载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个与欧美杨(PopulusXeuramericana)花药发育相关MYB基因 PeMYB103及其RNAi载体，属于分子生物学与生物技术领域。
背景技术：
花药是植物的雄性生殖器官，是雄配子体_花粉发育的场所。研究花药发育机理对理解植物生殖的遗传机制、改进农林作物育种方法以及防止转基因漂移具有重要意义。MYB是植物转录因子中最大的家族之一，该家族成员以N端含有MYB结构域为共同特征。按所含MYB结构域的数目，MYB类转录因子可分成3种类型MYB1R、R2R3-MYB、MYB3R， 分别含有1个、2个和3个MYB结构域。每个MYB结构域通常由51 52个氨基酸组成，在空间结构上，MYB结构域形成螺旋-螺旋_转角-螺旋(helix-helix-turn-helix)结构， 负责与DNA序列的特异结合。植物中绝大多数MYB类转录因子是R2R3-MYB，在调节次生代谢(特别是苯丙酸代谢)、控制细胞的分化和器官的形态建成以及参与对环境胁迫、光和激素的应答等方面起着重要的调控作用。近年，一些调控花药及花粉发育的MYB类转录因子相继被鉴定，这些研究主要集中在拟南芥、烟草和玉米等植物中。Yang等人以MYB蛋白同源序列标记42bp寡核苷酸探针筛选烟草成熟花粉的cDNA文库，首次克隆到花药特异性的MYB基因NtMYBASl/2，二者编码的氨基酸序列同源性高达92%。随后，运用筛选育性降低的突变体结合遗传学手段，人们又先后从拟南芥中鉴定出参与花药及花粉发育调控的MYB类转录因子AtMYB26、AtMYB103、 AtMYB32、AtMYB33、AtMYB65和AtMYB24等。其中，AtMYB103特异在花药绒毡层和毛状体中表达，其功能下调会导致绒毡层提前降解和花粉败育。因此，AtMYB103及其同源基因 (orthologs)可为人为控制高等植物雄性育性提供一个有效工具。以上研究表明，MYB类转录因子对花药及花粉发育起重要调控作用。杨树是研究林木遗传、发育及基因工程改良的模式植物，同时也是重要的经济树种，在我国广泛种植，但长期以来存在育种周期较长、雄株散粉、雌株飞絮及转基因植株安全性等问题。因此，挖掘、利用与杨树花药及花粉发育相关的重要基因不仅有助于加深对林木花药发育机理的理解，而且可为控制花粉发育，构建雄性不育系以及防止转基因漂移等方面提供理论依据和应用指导。
发明内容
本发明的目的是提供一个与欧美杨花药发育相关的MYB基因PeMYB103及其编码的蛋白质，该基因特异在花药中表达，表明其在杨树花药发育过程中发挥重要作用。本发明所提供的PeMYB103基因来源于欧美杨，其核苷酸序列及其编码的蛋白质序列分别如序列表中所示SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。SEQ ID NO :2氨基酸序列是由 311个氨基酸组成的蛋白质，分子量为35KD，等电点为5. 6，具有典型的R2R3 MYB结构域R2 (第12-64位氨基酸)与R3 (第65-115位氨基酸)。R2结构域自第17位氨基酸开始， 每间隔19个氨基酸有1个保守的疏水氨基酸残基色氨酸，共计3个W ;R3结构域中第1个 W为苯丙亮氨酸(F，第70位氨基酸)所取代，自L起每间隔18个氨基酸有1个W残基。以上分析结果表明，PeMYB103是一个典型的R2R3 MYB转录因子家族成员。经过BLAST比对， PeMYB103与调控拟南芥花药发育的重要转录子AtMYB103同源性为52%，是一种新的欧美杨MYB转录因子。本发明的目的还在于提供一种欧美杨PeMYB103基因RNAi载体；同时，还包括含有该载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。本发明构建的PeMYB103基因RNAi载体，可用于下调或抑制PeMYB103的表达，以获得新的杨树雄性不育系，具有极大的研究价值和应用潜力。本发明同已有技术相比可产生如下积极效果本发明首次从欧美杨中获得一个花药特异MYB基因PeMYB103，并构建了其RNAi载体，提出了利用该基因创造杨树雄性不育新品种的基因工程改良方法。本发明的创新性在于(1)首次从欧美杨中获得一个花药特异MYB基因PeMYB103 ；(2)PeMYB103与调控拟南芥花药发育的重要转录子AtMYB103同源性为52%，表明 PeMYB103在杨树花药发育中发挥重要作用。(3)构建了 PeMYB103基因RNAi载体，可用于下调或抑制PeMYB103的表达，以获得新的杨树雄性不育系，具有极大的研究价值和应用潜力。
图1为PeMYB103在不同组织中的表达模式分析图；其中1，根；2，茎；3，叶；4，花盘；5，雌蕊；6，花药；图2为亚细胞定位所用的pCambial300_GFP载体图；图3为pBI121_PeMYB103 RNAi表达载体的构建流程示意图；图4为pPUCCRNAi+lF质粒的酶切鉴定图；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1，BamH I 和 Sal I 双酶切结果图5为pPUCCRNAi+2F质粒的酶切鉴定图；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1, Xba I 禾口 Sal I 双酶切结果图6为pBI121_PeMYB103 RNAi质粒的酶切鉴定图；其中M, DNA Marker DL 2000 ；1, Xba I 禾口 Sal I 双酶切结果
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的详细说明下述实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。试验材料1.菌株与载体大肠杆菌菌株DHa、农杆菌菌株LBA4404购自华美生物公司；表达载体pCambial300载体购自Cambia公司；表达载体pBI 121购自Clontech公司。2.主要试剂Taq DNA聚合酶购自北京全式金公司、DNA标准分子量购自Takara公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、M-MLV反转录酶购自Promega公司；RNeasy Plant Mini Kit 购自 Qiagen ；BDSMART RACE cDNA Amplification Kit 购自 Clontech。其它化学试剂均为国产分析纯。
3.本发明设计的引物序列
引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下
PMYBf 5‘ -CGTTG (T/C)GG(A/C)AA(A/G)AG(T/C)TG(T/C)CGT-3‘
PMYB103-1:5' -CTGGTGTCAACATAAATAAGG-3‘
PMYB103-2 5' -ATGGGTCACCATTCTTGCTGC-3‘
PMYB103-3 5‘ -TTATAGAGATGAAGGGAAAG-3‘
PMYB103-4 5' -TGTGGATAGTAGTGTACGTG-3‘
PMYB103-5 5' -AAGAGCTCATGGGTCACCATTCTTGCTGC-3'(引入Sac [酶切位点)
PMYB103-6 5‘ -AAGGTACCTTATAGAGATGAAGGGAAAG-3‘(引入Kpn I酶切位点)
PMYB103-RNAi-F
5'-AAGGATCCTGTGGATAGTAGTGTACGTG-3 ‘(引入 BamHI酶切位点)
PMYB103-RNAi-Rl
5'-AAGTCGACTTATAGAGATGAAGGGAAAG-3'(引入 Sal I酶切位点)
PMYB103-RNAi-R2
占) ^ \\\ /5'-AAGTCGAC TCTAGA TTATAGAGATGAAGGGAAAG-3 ‘(弓丨入 Sal I 禾口 Xba I 酶切位ACTIN f 5' -ACCACATACAACTCCATCAT-3‘ACT IN r 5' -CACCTTGATTTCCATGCTGC-3‘4.植物材料欧美杨(PopulusXeuramericana)5.主要仪器常温离心机、冷冻离心机来自Eppendorf公司；、PCR仪、凝胶成像仪购自Biorad公司。实施例1、欧美杨MYB基因PeMYB103的克隆与鉴定1. lPeMYB103 3'端的分离1. 1. lPeMYB103 3'端的扩增以欧美杨雄花序为材料，利用RNeasy Plant Mini Kit提取总RNA。用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行反转录，合成cDNA的第一条链，以上具体操作均按照试剂盒说明书进行。根据保守区的氨基酸序列RCGKSCR—兼并引物PMYBf，以cDNA为模板进行3' RACE PCR，获得一特异片段。PCR扩增的条件为94°C 3min预变性后，94°C lmin, 50°C lmin，72°C 90s，共 35 个循环。1. 1.2连接、转化、测序连接10yL连接体系中依次力卩入3yL扩增产物，IyL pGME-TeasyVector (Promega), 1 μ L 10 Xbuffer, 1 μ L Τ4 DNA Ligase，其余用 ddH20 补足。 在7°C下连接过夜。转化大肠杆菌DHa感受态细胞的制备方法参照F.奥斯伯等(《精编分子生物学实验指南》，1998，科学出版社)进行。将连接产物通过42°C热激导入大肠杆菌DH α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，酶切鉴定。测序阳性质粒送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。测序引物为T7 Promoter Primer 5' -TAATAADCGACTCACTATAGGG-3‘和SP6 Promoter Primer5' -CATACG ATTTAGGTGACACTATAG-3‘。将所得序列作BLAST分析，得出该片段与拟南芥的AtMYB103有
5较高的同源性，将其命名为PeMYB103。1. 2PeMYB103 5'端的分离根据获得的片段序列，设计特异引物PMYB103-1，通过5' RACEPCR分离基因的5' 端序列。具体操作参照 BD SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)说明。扩增产物的连接、转化及测序方法同1. 1. 2。1. 3 PeMYB103编码区全序列的分离在目的基因的编码区两端设计特异引物PMYB103-2和PMYB103-3，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得cDNA编码区全序列。PCR扩增的条件为94°C 3min预变性后，94°C lmin, 50°C lmin,72°C 90s，共35个循环。扩增产物的连接、转化及测序方法同1. 1. 2。筛选阳性克隆pGEM-PeMYB103，送上海生工生物工程有限公司分别用T7和SP6从两侧进行测序证实， 该片段与将3'端序列和5'端序列拼接所得的序列一致，至此，获得PeMYB103编码区全序列。实施例2、欧美杨PeMYB103基因的序列分析及同源性比较利用DNAstar、Primer Premier 5. 0软件对PeMYB103 cDNA编码氨基酸序列进行分析，结果显示，PeMYB103是由311个氨基酸组成的蛋白质，分子量为35KD，等电点为5. 6， 具有典型的R2R3MYB结构域R2 (第12-64位氨基酸)与R3 (第65-115位氨基酸)。R2结构域自第17位氨基酸开始，每间隔19个氨基酸有1个保守的疏水氨基酸残基色氨酸，共计 3个W;R3结构域中第1个W为苯丙亮氨酸(F，第70位氨基酸)所取代，自L起每间隔18 个氨基酸有1个W残基。以上分析结果表明，PeMYB103是一个典型的R2R3 MYB转录因子家族成员。用NCBI数据库中的Blast软件将PeMYB103与GenBank中的序列进行比对和相似性搜索，发现PeMYB103与拟南芥的AtMYB103同源性为52 %，且同源区域都集中在N端 R2R3 DNA结合域，而C端同源性极低，表明分离得到的PeMYB103是一个新的杨树MYB基因 PeMYB103。实施例3、欧美杨PeMYB103基因在不同组织中的表达特征采用RT-PCR半定量法对PeMYB103的表达模式进行分析。分别提取根、茎、叶、花盘、花药、雌蕊等不同组织的总RNA。取1 μ g的总RNA，用20 μ L的M-MLV酶反应体系反转录合成cDNA的第1条链。根据PeMYB103的3端非保守区设计特异引物PMYB103-4和 PMYB103-3,进行PCR扩增。以肌动蛋白基因ACTIN为扩增内部参照，扩增引物为ACTIN f 和 ACT IN r。扩增条件为:94°C 3min 预变性后，94°C lmin，54°C lmin，72°C 90s，30 个循环。 结果显示，仅在花药cDNA中扩增出目的片段(图1)，表明PeMYB103为花药特异基因，在杨树花药发育过程中发挥重要作用。实施例4、PeMYB103蛋白的亚细胞定位用GFP融合蛋白技术进行了 PeMYB103亚细胞定位研究。将PeMYB103的cDNA片段插入到PCAMBIA1300载体(载体图谱见2)中GFP基因的上游，构建了含有PeMYB103_GFP 融合基因的双元载体，用基因枪转化方法转化洋葱表皮细胞，在荧光显微镜下观察，发现 PeMYB103-GFP融合蛋白定位在细胞核中。融合表达载体的构建方法如下根据PeMYB103 的cDNA编码区两端序列设计引物PMYB103-5和PMYB103-6 (分别引入Sac I和Kpn I酶切位点)，通过PCR扩增获得PeMYB103 cDNA编码区全序列。先将扩增的PeMYB103片段和 PCAMBIA1300载体分别用Sac I和Kpn I进行双酶切，然后在pCAMBIA1300载体反应液中加入2 μ L碱性磷酸酶，置于37°C下进行去磷酸化。PeMYB103片段和pCAMBIA1300载体片段按照2 10 1的比例在T4DNA连接酶作用下16°C过夜。连接产物转化大肠杆菌DHa， 在含有卡那霉素(50mg/mL)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，进行酶切鉴定，正确的即为重组质粒 pCAMBIA1300-PeMYB103-GFP。实施例5、PeMYB103基因RNAi载体的构建PeMYB103基因RNAi载体的构建策略见图3。5. lPeMYB103RNAi中间载体的构建5. 1. lPeMYB103基因3'端非保守区的获得选择PeMYB103 基因 3 ‘端非保守区设计引物 PMYB103-RNAi-FPMYB 103-RNAi-Rl 和PMYB103-RNAi-R2，为便于载体的构建，在引物PMYB 103-RNAi-F中引入BamH I酶切位点，在引物PMYB103-RNA1-R1中引入Sal I酶切位点，引物PMYB103_RNAi_R2中引入Sal I 和 Xba I 酶切位点。用引物 PMYB103-RNAi-F、PMYB 103-RNAi-Rl 及 PMYB 103-RNAi-F、 PMYB103-RNAi-R2分别进行扩增，获得大小均为400bp的片段1和片段2，将扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，证实片段1和片段2均为PeMYB103基因3'端片段。5. 1. 2 重组质粒 pUCCRNA i+lF 的构建将扩增的目的片段1和pUCCRNA i质粒分别用BamH I和Ml I进行双酶切，回收 400bp的PeMYB103片段和2. Skb的载体片段。目的片段1和载体片段按照2 10 1的比例在T4 DNA连接酶作用下16°C过夜。连接产物转化大肠杆菌DHa，在含有氨苄青霉素 (100mg/mL)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，用BamH I和Ml I进行双酶切鉴定，正确的即为含有正向目的片段的重组质粒pUCCRNA i+lF(图4)。5. 1. 3 重组质粒 pUCCRNA i+2F 的构建用Xho I和Bgl II双酶切重组质粒pUCCRNA i+lF，回收载体片段。同时，用BamH I和Ml I双酶切目的片段2，并进行回收纯化。二者在T4DNA连接酶作用下16°C过夜。连接产物转化大肠杆菌DHa，在含有氨苄青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，用)(ba I和Ml I双酶切鉴定，正确的即为含有正向和反向目的片段的pUCCRNAi载体 pUCCRNA i+2F (图 5)。5. 1. 4 pBI121-PeMYB103 RNAi 载体的构建用Xba I和Ml I分别双酶切以上构建的pUCCRNA i+2F载体和pBI121载体，回收 Ikb PeMYB103 RNAi片段和13kb pBI 121载体片段。同样按照2 10 1的比例在T4 DNA连接酶作用下16°C过夜。连接产物转化大肠杆菌DHa，在含有卡那霉素(50mg/mL)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，用)(ba I和Ml I双酶切鉴定，正确的即为质粒pBI121-PeMYB103 RNAi (图 6)。实施例6、pBI121-PeMYB103 RNAi载体向农杆菌LBA4404的导入6. 1感受态细胞的制备1、挑取单菌落LBA4404，接种于5mL附加有50mg/L的利副平的液体LB培养基中， 过夜培养；2、取2mL培养物至液体LB中，继续培养至0D800为0. 5左右；
3、将培养物冰浴30分钟，4°C，5000rpm,离心5分钟； 4、弃去上清，IOmL 0. lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；
5、4°C，5000rpm,离心 5 分钟；5、弃上清，ImL 20mmol/L冷的CaC12悬浮，分装成200 μ L/管，液氮中冷冻后-70°C保存。6. 2转化、筛选1、冰上融化感受态细胞，加入1-2 μ L重组质粒DNA(pBI121-PeMYB103RNAi)，冰浴 45分钟，液氮中冷冻1分钟，再37°C水浴3分钟。2、加入ImL无抗生素的LBJ8°C，200rpm，3小时。3、12000rpm离心1分钟以浓缩菌液，100 μ L回溶菌体。4、将转化后的菌液涂于附加50mg/L卡那霉素，50mg/L利副平的固体LB培养基上， 置于下培养2-3天。5、进行菌落PCR反应验证，阳性菌落即为已导入pBI121_PeMYB103RNAi载体的农杆菌LBA4404。使用含有pBI121-PeMYB103 RNAi质粒的农杆菌侵染杨树，有望获得花粉败育的转基因植株。
权利要求
1.一个与欧美杨(PopulusXeuramericana)花药发育相关MYB基因PeMYB103，其特征在于其核苷酸序列及其编码的蛋白质序列分别如序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所7J\ ο
2.—种RNAi载体，其特征在于其含有权利要求1所述的基因PeMYB103。
3.根据权利要求2所述的一种RNAi载体，其特征在于所述的载体为pBI121-PeMYB103 RNAi。
4.一种宿主细胞，其特征在于其含有权利要求2所述的RNAi载体。
5.根据权利要求4所述的一种宿主细胞，其特征在于包括大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
全文摘要
本发明公开了一个与欧美杨(Populus×euramericana)花药发育相关MYB基因PeMYB103及其RNAi载体，本发明首次从欧美杨中获得一个花药特异MYB基因PeMYB103，该基因编码一个由311个氨基酸组成的核定位转录因子。PeMYB103与调控拟南芥花药发育的重要转录子AtMYB103同源性为52％。本发明构建了PeMYB103的RNAi载体，该载体可用于下调或抑制PeMYB103的表达，以获得花粉败育的转基因植株。本发明的基因将在通过基因工程途径创建雄性不育系，尤其是培育杨树新品种方面具有极大的应用潜力。
文档编号C12N15/63GK102181453SQ201010612880
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者冯培勇, 刘林德, 宿红艳, 张娟, 王磊 申请人:鲁东大学