专利名称：鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法
技术领域：
本发明涉及中华乌塘鳢种群的鉴别方法，特别涉及鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷 酸多态性标记和鉴别方法。
背景技术：
中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)又名乌鱼、文鱼、笋壳鱼、土鱼、蟹虎，隶 属于鲈形目(Perciformes)，鰕虎鱼亚目(Gobioidei)，塘鳢科(Eleotridae)，乌塘鳢属 (Bostrychus)，其野生群体广泛分布在我国长江口以南至东南亚一带的潮间带海区，是我 国东南沿海名贵的海产品，目前，市场价格可达160元/kg(张健东，中华乌塘鳢的生长，生 长模型和生活史类型.生态学报[J]，200222 (6) =841-846) 0目前，中华乌塘鳢在广东、广 西、福建、浙江均有养殖，但苗种主要来源于自然海区。其中，我国南海海域尤其是珠江口以 南海区的种群因具有抗病力强、体型好、生长快以及耐热等优点，成为养殖苗种的首选，价 格显著高于来自珠江口以北海区的中华乌塘鳢野生苗，然而由于苗种阶段难于在外形上对 野生苗种的来源进行准确鉴别，许多不法分子以次充好，以北方苗代替南方苗出售给养殖 户以牟取暴利。目前用于准确鉴别珠江口以南和珠江口以北中华乌塘鳢的方法还未见报 道。
发明内容
本发明的目的在于提供鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记。本发明的另一目的在于提供中华乌塘鳢种群的鉴别方法。所述鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记位于中华乌塘鳢线粒体基因组 中脯氨酸tRNA基因5’端的第四个碱基，分布在珠江口以南的中华乌塘鳢，其种群线粒体 基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第四个碱基为T，分布在珠江口以北的中华乌塘鳢，其种 群线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第四个碱基为C，中华乌塘鳢线粒体基因组中 脯氨酸tRNA基因的全序列为tcaaagaagg gagattctaa ctcccacctc tagctcccaa agctagaatt ctaaattaaa 60ctattctttg70所述中华乌塘鳢种群的鉴别方法包括以下步骤1)提取中华乌塘鳢的基因组DNA ；2)以步骤1)所得的基因组DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯 氨酸tRNA基因，获得PCR扩增产物；3)将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自 珠江口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以 南的中华乌塘鳢种群。在步骤2)中，所述PCR扩增的引物为tRNA-proH和tRNA-proL，所述tRNA-proH和 tRNA-proL的序列如下
tRNA-proH 5' -gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc-3'tRNA-proL 5' —acgggatggt ggttcgtggt at_3，；所述PCR扩增的反应体系为总体积为25 μ L，PCR缓冲液10mmol/L，dNTP 0. 2mmol/L, Mg2+L 5mmol/L, tRNA-proH 0. 32mmol/L, tRNA-proL 0. 4mmol/L, Taq 酶 1U，模板 50ng,用双蒸水补足到25 μ L。所述PCR扩增的程序为95°C预变性5min ；前5个循环为每个循环于95°C变性 30s，67°C退火30s (退火温度每个循环后降低1°C )，72°C延伸30s ；后20个循环为每个循 环于95°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s ；最后一次循环结束后于72°C延伸5min。在步骤幻中，所述电泳分析可采用琼脂糖凝胶电泳分析。本发明利用中华乌塘鳢种群间的一个线粒体单核苷酸多态性位点差异，设计了一 对选择性扩增引物tRNA-proH和tRNA-proL，对中华乌塘鳢种群的DNA进行PCR扩增，并通 过检测PCR扩增产物的有无，从而辨别中华乌塘鳢种群的来源。该方法具有简单易行、准确 快捷、公正客观、经济实用等优点。
图1为本发明实施例中阳性检测反应PCR扩增产物的琼脂糖胶电泳图。在图1中， M为DNA分子量标记，2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp和IOObp为DNA分子量标记的大
小；HF表示中华乌塘鳢样品取自广东海丰，ZJ表示中华乌塘鳢样品取自广东湛江，XM表示 中华乌塘鳢样品取自福建厦门，表示中华乌塘鳢样品取自广东珠海，ND表示中华乌塘鳢 样品取自福建宁德，BH表示中华乌塘鳢样品取自广西北海，NB表示中华乌塘鳢样品取自浙 江宁波，DX表示中华乌塘鳢样品取自广西东兴，ZS表示中华乌塘鳢样品取自浙江舟山，YN 表示中华乌塘鳢样品取自越南海防。图2为本发明实施例中PCR扩增产物的琼脂糖胶电泳图。在图2中，M为DNA分 子量标记，2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp和IOObp为DNA分子量标记的大小；HF表示
中华乌塘鳢样品取自广东海丰，ZJ表示中华乌塘鳢样品取自广东湛江，XM表示中华乌塘鳢 样品取自福建厦门，Sl表示中华乌塘鳢样品取自广东珠海，ND表示中华乌塘鳢样品取自福 建宁德，BH表示中华乌塘鳢样品取自广西北海，NB表示中华乌塘鳢样品取自浙江宁波，DX 表示中华乌塘鳢样品取自广西东兴，M表示中华乌塘鳢样品取自浙江舟山，YN表示中华乌 塘鳢样品取自越南海防。
具体实施例方式本发明分别从珠江口以北的海丰、宁德、厦门、舟山、宁波，珠江口以南的东兴、北 海、湛江、珠海，以及越南等地取样，对中华乌塘鳢种群进行了鉴定。实施例11)选用取自湛江(珠江口以南)的中华乌塘鳢与海丰(珠江口以北)的中华乌塘 鳢，按常规方法采用酚氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学 出版社，2002年9月)提取中华乌塘鳢DNA ；2)设计合成一对选择性扩增引物tRNA-proH —gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc_3，
tRNA-proL 5' —acgggatggt ggttcgtggt at_3，；对中华乌塘鳢DNA进行2次PCR扩增反应第1次PCR扩增，即阳性检测反应PCR扩增程序为95°C预变性5min ；每个循环于 95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共进行；35个循环。第2次PCR扩增，即选择性PCR扩增程序为95°C预变性5min ；前5个循环为每个 循环于95°C变性30s，67°C退火30s (退火温度每个循环后降低1度)，72°C延伸30s ；后20 个循环为每个循环于95°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s ；最后一次循环结束后于 72°C 延伸 5min。2次PCR扩增的反应体系组成为25 μ L总体积，Buffer IOmM, dNTP 0. 2mM, Mg2+L 5mM, tRNA-proH 0. 32mM, tRNA-proL 0. 4mM, Taq 酶 IU，模板 50ng，用双蒸水补齐到 25 μ L0扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在阳性检测反应中，两个DNA样品皆存在 330bp的扩增产物，说明整个反应体系无其他干扰因素(参见图1)；选择性扩增中，若存在 330bp的扩增产物，则该DNA样品来自珠江口以北的海丰，若无任何扩增产物，则该DNA样品 来自珠江口以南的湛江(参见图2)。实施例2与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自珠海；珠江口以北样品 选用厦门。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常(即存在阳性扩增产物)的前提下， 选择性PCR扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自厦门，若无任何扩增产物， 则该DNA样品来自珠海(参见图1和2)。实施例3与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自北海；珠江口以北样品 取自宁德。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提下， 选择性PCR扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自宁德，若无任何扩增产物， 则该DNA样品来自北海(参见图1和2)。实施例4与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自广西东兴；珠江口以北 样品取自宁波。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提 下，选择性扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自宁波，若无任何扩增产物， 则该DNA样品来自广西东兴(参见图1和2)。实施例5与实施例1类似，其不同在于珠江口以南中华乌塘鳢取自越南海防；珠江口以北 样品取自舟山。电泳检测结果时，在保证阳性检测反应正常的(即存在阳性扩增产物)前提 下，选择性扩增中，若存在330bp的扩增产物，则该DNA样品来自舟山，若无任何扩增产物， 则该DNA样品来自越南海防(参见图1和2)。
权利要求
1.鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记，其特征在于，所述鉴别中华乌塘鳢种 群的单核苷酸多态性标记位于中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第四 个碱基，分布在珠江口以南的中华乌塘鳢，其种群线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的 第四个碱基为T，分布在珠江口以北的中华乌塘鳢，其种群线粒体基因组中脯氨酸tRNA基 因5’端的第四个碱基为C，中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因的全序列为tcaaagaagg gagattctaa ctcccacctc tagctcccaa agctagaatt ctaaattaaa 60ctattctttg70ο
2.中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤1)提取中华乌塘鳢的基因组DNA；2)以步骤1)所得的基因组DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯氨酸 tRNA基因，获得PCR扩增产物；3)将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江 口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以南的 中华乌塘鳢种群。
3.如权利要求2所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤2)中，所述 PCR扩增的引物为tRNA-proH和tRNA-proL，所述tRNA-proH和tRNA-proL序列如下tRNA-proH 5' -gtgtgagaag ggagattcta actcccaacc-3'tRNA-proL 5' -acgggatggt ggttcgtggt at_3，。
4.如权利要求2所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤2)中，所 述PCR扩增的反应体系为总体积为25 μ L，PCR缓冲液10mmol/L，dNTP 0. 2mmol/L, Mg2+L 5mmol/L, tRNA-proH 0. 32mmol/L, tRNA-proL 0. 4mmol/L, Taq 酶 1U，模板 50ng，用双 蒸水补齐到25 μ L。
5.如权利要求2所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤2)中，所述 PCR扩增的程序为95°C预变性5min ；前5个循环为每个循环于95°C变性30s，67°C退火 30s，退火温度每个循环后降低1°C，72°C延伸30s ；后20个循环为每个循环于95°C变性 30s，62°C退火30s，72°C延伸30s ；最后1次循环结束后于72°C延伸5min。
6.如权利要求2所述的中华乌塘鳢种群的鉴别方法，其特征在于在步骤3)中，所述电 泳分析采用琼脂糖凝胶电泳分析。
全文摘要
鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法。涉及中华乌塘鳢种群的鉴别方法，中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记位于中华乌塘鳢线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因5’端的第29个碱基，鉴别方法包括提取中华乌塘鳢的基因组DNA；以DNA为模板，PCR扩增中华乌塘鳢的线粒体基因组中脯氨酸tRNA基因，将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以北的中华乌塘鳢种群，若检测不出330bp的PCR扩增产物，则该样品来自珠江口以南的中华乌塘鳢种群。该方法具有简单易行、准确快捷、公正客观、经济实用的优点。
文档编号C12Q1/68GK102134604SQ20101061689
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者丁少雄, 张丽艳, 王军, 王航俊 申请人:厦门大学