专利名称：伊立替康的敏感性判断方法及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于判断癌对伊立替康、SN-38和/或其盐是否具有治疗反应性而使用的敏感性判断方法及其利用。
背景技术：
在抗癌剂中有烷基化剂、钼制剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生物质、抗癌性植物生物碱等种类。而在这些抗癌剂中，根据癌症的种类有显示效果的情况和不显示效果的情况。还已知即使是被确认有效种类的癌症，随着各个患者也有显示效果的情况和不显示效果的情况。将抗癌剂是否对于这样的各个患者的癌症显示效果称为抗癌剂敏感性。盐酸伊立替康(CPT-Il)是在日本开发的具有拓扑异构酶I (topoisomerase I)抑制作用机理的抗癌剂。在日本，CPT-11作为在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌中有效的药剂，在1994年1月获得批准，并且在1995年7月认可对于胃癌、结肠·直肠癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、恶性淋巴肿瘤的应用。特别在大肠癌领域中，CPT-Il作为多剂并用疗法的一线药物(first line drug)或二线药物(second line drug)占有世界性标准治疗药的位置，其有用性得到认可。对晚期 转移大肠癌的化学疗法，通过并用在20世纪90年代登场的CPT-11、奥沙利钼等的关键药物(key drug)和以至今是大肠癌治疗中心药剂的氟尿嘧啶(5-FU)为中心的氟化嘧啶制剂，以生存率为代表的临床表现被极大地改善。但是，尽管如此，现状仍旧是奏效效率约为50%左右，冒着严重的副作用的风险投与了抗癌剂的患者一半得不到效果， 判断各治疗反应性(应答 无应答)的抗癌剂敏感性预测方法的确立是当务之急。一般而言，事实是癌症化学疗法的疗程历经较长时间，在边观察副作用的表现边进行多个疗程反复治疗后，判断是得到效果还是应该继续投与，为此需要长时间和高额医疗费，也引起副作用出现。因此，对各个患者如果有能够在治疗前或治疗早期预测是否得到效果的手段，就能够减轻患者的负担和副作用出现，并能够削减医疗费。虽然CPT-Il其自身具有抗肿瘤活性，但在体内被羧酸酯酶(Carboxyl esterase) 活化，变换为相比于CPT-Il具有100 数千倍的强抗肿瘤活性的7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin) (SN-38)。可以认为通过 CPT-11 和 SN-38 同时在体内存在而呈现抗肿瘤效果。SN-38在肝细胞内，由UDP-葡糖醛酸转移酶(UGT UDP-glucronosyltransferase)受到葡糖醛酸共轭，成为没有细胞毒性的SN-38葡糖醛酸共轭体(SN-38G)，主要被排泄在胆汁中向肠道移动，此后在大便中排泄。排泄在肠道中的 SN-38G的一部分，由肠内细菌具有的β _葡萄糖苷酸酶脱共轭，再成为活性型的SN-38，经过肠道上皮的转运载体再吸收，边经过肠肝循环、在肠上皮细胞内的通过UGT的葡糖醛酸共轭化等步骤边受到代谢-排泄(非专利文献1)。可以认为此时，SN-38损害肠道粘膜、诱发痢疾。另外，确认也影响细胞分裂活跃的骨髓，引起红血球减少-白血球减少-血小板减少。严重痢疾和中性粒细胞减少等副作用，表明UGTlAl基因多态性引起的SN-38体内暴露量变化是一个原因。但是，由于从前体药物CPT-Il向活性代谢物SN-38的变换及其解毒，进一步在肠道循环过程中的SN-38再生成，CPT-11本身代谢与从代谢物的SN-38生成的体内动态的复杂性，所以关于治疗效果还没有可以通过药物动态预测治疗效果的报道。还有报道称外周血单个核细胞的羧酸酯酶mRNA表达量，与SN-38和SN-38G的AUC比相关但与肿瘤缩小效果无关(非专利文献2)。另外，在另一方面，作为关于CPT-Il敏感性或耐性的因素，报道了 SN-38标的的拓扑异构酶I (topoisomerase I)变异的有无和表达量，与从CPT-11向SN-38转换相关的羧酸酯酶活性，影响CPT-Il和SN-38的细胞内蓄积量的ABC转运载体类基因(多药耐药蛋白(MRP)-l、MRP-2、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)/ABCG2)、BCL2族基因(专利文献1)的参与，此外，也研究了细胞增殖抗原Ki-67、癌抑制基因TP53等与对使用CPT-Il治疗的反应性的关联。在临床研究中，最近被报道具有抗细胞凋亡作用的金属蛋白酶组织抑制剂-KTissue inhibitor of metalloproteinase-1, ΤΙΜΡ-l)的血浆中水平，与对转移结肠-直肠癌的CPT-11+5-FU并用疗法的临床预后有意义地相关(非专利文献3)。这样，虽然认识到 CPT-Il敏感性预测生物标记和敏感性判断方法的必要性且进行着许多研究，但也有报告称关于标的的拓扑异构酶I，与认为是5-FU敏感性预测因子的胸苷酸合成酶同样，没有发现与5-FU+CPT-11并用疗法的治疗反应性之间的明确的关联性等(非专利文献4)，还没有确立能够预测治疗反应性的明确的生物标记和敏感性判断方法。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开W02005/78100号小册子非专利文献非专利文献1 =Cancer Res 1991 ；51 :4187_4191.非专利文献2 =Clin Cancer Res 2005 ；11 :6901_6907.非专利文献3 =Clin Cancer Res 2007 ；13 :4117_4122.非专利文献4 :Int J Cancer 2004 ；111 :252_258.
发明内容
发明所要解决的课题本发明的课题在于提供能够判断各个患者治疗反应性的对伊立替康、SN-38和/ 或其盐的敏感性判断方法及利用其的新治疗手段。用于解决课题的方法因此，本发明的发明者们使用人培养癌细胞，通过全面地解析添加SN-38时的基因表达和对SN-38的敏感性，确定可以认为与敏感性相关的基因，实施由CPT-Il单独投与的人临床试验，深入研讨使用该基因的敏感性判断方法。其结果，发现通过在特定的计算式中代入7个该基因表达量，可以算出伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性，具体地可以算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)。基于这样的见解进一步研讨的结果，发现测定来自癌症患者的生物试样中的该基因表达量，如果代入计算式， 就可以判断该患者的癌症对伊立替康、SN-38和/或其盐是否有敏感性，另外，如果把从计算式得到的数值增量作为指标，就可能进行敏感性增强剂的筛选，如果再并用该敏感性增强剂和为敏感性增强对象的伊立替康、SN-38和/或其盐，该抗癌剂的治疗效果会飞跃性提高，从而完成了本发明。S卩，本发明提供伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法，其特征在于，测定检验体中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2基因和 TBX3基因的表达量，由下式⑴ (3)算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)。最佳肿瘤缩小效果(%) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD -29. 119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)总体生存期(日)=512.78-192. 11 XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55XG......(2)无进展生存期(日)=68.076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73 .077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)(式中，A表示AMDl基因的表达量，B表示CTSC基因的表达量，C表示EIFlAX基因的表达量，D表示C12orf30基因的表达量，E表示DDX54基因的表达量，F表示PTPN2基因的表达量，G表示TBX3基因的表达量。)另外，本发明提供伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断用试剂盒，其特征在于，包含㈧上述7个基因的表达量测定试剂和⑶用于通过式⑴ (3)算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)的使用说明。本发明还提供测定对伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性增强剂筛选方法，其中，测定检验体中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表达量，以使用(1) (3)算出的最佳肿瘤缩小效果(％)、总体生存期 (日)或无进展生存期(日)的任意1个数值的增量作为指标。另外，本发明还提供对由上述筛选方法得到的伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性增强剂。本发明还提供含有上述敏感性增强剂，并且含有伊立替康、SN-38和/或其盐的癌治疗用组合物。发明的效果如果使用本发明的伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法，就能够在抗癌剂投与前或在抗癌剂投与开始后早期，正确判断各个患者的抗癌剂治疗反应性，其结果就可以选择治疗效果更高的抗癌剂，作为其结果，能够防止伴随不能期待治疗效果的抗癌剂的继续投与，癌的恶化、副作用增大，还可以期待患者的负担减轻、医疗费的削减。另外，如果使用该判断方法，就可以筛选使伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性增强的药剂，如果并用敏感性增强剂以及其对象的伊立替康、SN-38和/或其盐，癌治疗效果就会飞跃性提尚ο
图1是表示使用5个公知基因和7个新基因表达量的体外SN-38效果预测式的图表。图2是表示由使用5个公知基因表达量的伊立替康单独投与得到的最佳肿瘤缩小效果(％ )预测式及其预测性界限的图表。
图3是表示由使用5个公知基因表达量的伊立替康单独投与得到的无进展生存期 (日)预测式及其预测性界限的图表。图4是表示由使用5个公知基因表达量的伊立替康单独投与得到的总体生存期 (日)预测式及其预测性界限的图表。图5是表示由使用7个新基因表达量的伊立替康单独投与得到的最佳肿瘤缩小效果(％ )预测式及其预测性有用性的图表。图6是表示由使用7个新基因表达量的伊立替康单独投与得到的无进展生存期 (日)预测式及其预测性有用性的图表。图7是表示由使用7个新基因表达量的伊立替康单独投与得到的总体生存期 (日)预测式及其预测性有用性的图表。
具体实施例方式在本发明中的伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法，可以通过测定检验体中的上述7个基因的表达量，使用该表达量由式(1) (3)算出最佳肿瘤缩小效果
)、总体生存期(日)或无进展生存期(日)而进行。在本发明中使用的7个基因，是被认为在使用人培养癌细胞的系统中与SN-38敏感性相关的基因，但在实际的人临床试验中的CPT-Il敏感性研究中，却不是单独反映CPT-Il敏感性的基因。因此，由多重回归分析(文献名禾尔 Shimokuni 等"Chemosensitivity prediction in esophageal squamous cell carcinoma :novel marker genes and efficacy-prediction formulae using their expression data. ”Int J Oncol 2006.5.)解析在临床试验中得到的检验体各基因的表达量，和各个患者的最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)、无进展生存期(日)，得知代入了上述7个基因的表达量的式(1) (3)，与最佳肿瘤缩小效果(％)、总体生存期(日)、 无进展生存期(日)具有非常高的相关性。因此，通过测定检验体中的上述7个基因的表达量，代入下式(1) (3)中，就能够判断伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性，具体而言， 就可以预测最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)、无进展生存期(日)。最佳肿瘤缩小效果(%) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD -29. 119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)总体生存期(日)=512.78-192. 11 XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55XG......(2)无进展生存期(日)=68.076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011 XC+8. 9798XD+73 .077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)(式中，A表示AMDl基因的表达量，B表示CTSC基因的表达量，C表示EIFlAX基因的表达量，D表示C12orf30基因的表达量，E表示DDX54基因的表达量，F表示PTPN2基因的表达量，G表示TBX3基因的表达量。)在这里，所谓AMDl基因，指的是表达GenBank登录编号(accession number) NM_001634所示的碱基序列的mRNA的基因及其同源序列，所谓CTSC基因，指的是表达GenBank登录编号NM_148170和NM_001814所示的碱基序列的mRNA的基因及其同源序列，所谓EIFlAX基因，指的是表达GenBank登录编号NM_001412所示的碱基序列的mRNA的基因及其同源序列，所谓C12orf30基因，指的是表达GenBank登录编号NM_024953所示的碱基序列的 mRNA的基因及其同源序列，所谓DDX54基因，指的是表达GenBank登录编号NM_024072所示的碱基序列的 mRNA的基因及其同源序列，所谓PTPN2基因，指的是表达GenBank登录编号NM_002828和NM_080422所示的碱基序列的mRNA的基因及其同源序列，所谓TBX3基因，指的是表达GenBank登录编号NM_005996和NM_016569所示的碱基序列的mRNA的基因及其同源序列。另外，所谓基因，其意思不仅包含双链DNA，而且是包含构成其的正义链和反义链的各单链DNA，另外，其长度没有任何限制。另外，作为核酸(多核苷酸)，可以例示RNA、DNA， DNA可以列举cDNA、基因组DNA、合成DNA，RNA可以列举mRNA、rRNA、siRNA。在这里，在多核苷酸中也包含由多个碱基序列构成的寡核苷酸。在使用本发明的对伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法判断敏感性中， 可以测定检验体中的上述7个基因的表达量，并带入到式(1) (3)中。在这里，作为检验体，可以列举来自患有癌的被检验者(癌症患者)的生物试样，例如，可以列举血液、血清、 血浆、尿、肿瘤组织 细胞、腹水、胸水、脑脊髓液、大便、咯痰等，但特别优选肿瘤组织。检验体通过适当公知的方法处理，也能够作为组织提取液、组织标本等使用。另外，作为本发明对象的癌症，可以列举以咽喉癌为代表的嘴唇、口腔和咽喉癌， 以食道癌、胃癌、结肠·直肠癌等为代表的消化器官癌，以肺癌为代表的呼吸器官和胸腔内脏器官癌，骨骼和关节软骨癌，以皮肤的恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌及其它皮肤癌、中皮肿瘤为代表的中皮和软组织癌，以乳房癌、子宫癌、卵巢癌为代表的女性性器官癌、以前列腺癌为代表的男性性器官癌，以膀胱癌为代表的尿道癌，以脑肿瘤为代表的眼、脑和中枢神经系统癌，甲状腺和其它内分泌腺癌，以非霍奇金淋巴肿瘤和淋巴性白血病为代表的淋巴组织、造血组织和相关组织癌以及以这些为原发灶的转移组织癌等，可以优选对于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠 直肠癌、鳞状细胞癌、恶性淋巴癌利用，特别优选对于结肠·直肠癌(大肠癌)利用，但特别优选未用化学疗法治疗的癌。基因表达量的测定，使用可以检出本发明的基因和来自基因的mRNA的探针和引物,通过DNA杂交法(southern hybridization)、DNA微阵列、实时PCR法、RT-PCR法测定标的基因拷贝数和表达量等而进行。另外，由该基因编码的多肽也可作为测定对象列举，只要是反映基因表达量的就没有特别限定，但优选以来自该基因的mRNA作为测定对象。在这里，所谓基因表达量的测定，也包含确认有无基因的表达。这里说明PCR法。作为测定对象使用mRNA时，根据需要，对检验体进行了通过过滤、离心分离、色谱等公知方法的前处理后，例如，使用胍-氯化铯超速离心法、酸性胍-酚·氯仿法(AGPC法)、磁珠法、硅胶柱法等通用方法，可以从检验体提取RNA。另外， 也可以使用市售的试剂盒(QIAGEN RNeasy Kit、TRIZOL等)提取RNA。mRNA的测定，例如，可以通过如下方法求出(1)使用与目的mRNA能够特异地杂交的核酸片段和来自检验体的RNA，求出PCR法的扩增产物量，⑵求出与目的mRNA能够特异地杂交的核酸片段和来自检验体的RNA的杂交效率，或(3)使用其它公知方法的定量方法。
在这里，在使用PCR法时，“与目的mRNA能够特异地杂交的核酸片段”的设计，可以通过比较目的基因具有的碱基序列和其它基因具有的碱基序列，选择对目的基因的mRNA 特异的序列而进行。在这里，目的基因的mRNA的碱基序列，例如，可以通过参照数据库 (GenBank等)得到。另外，使用软件(Clustal X等)对比碱基序列，通过目测等手段，能够发现特异的序列。该核酸片段的长度没有特别限制，但优选由5 50碱基构成的核酸片段，更优选由18 25个连续碱基构成的核酸片段。作为可以与目的基因的mRNA杂交的核酸片段，不仅能够使用这样设计的序列，还能够使用按照公知的技术常识能够适当设想的与该碱基序列互补的碱基序列，和在目的基因的mRNA测定中能够同样使用的同源碱基序列，例如，由a)该碱基序列中取代、添加或缺失1 10个，优选1个或数个碱基的碱基序列，b)与该碱基序列具有90%以上、优选95% 以上、更优选99%以上同源性的碱基序列，c)与该碱基序列互补的碱基序列组成的DNA与在严谨条件下杂交的碱基序列组成的核酸片段。另外，这样的核酸片段，在其两端或一端、优选在5’端添加任意数、优选100个、更优选20个、更加优选10个以下碱基的核酸片段。这样设计的核酸片段，例如，能够按照其碱基序列由DNA合成仪人工合成。作为该断片，优选在合成后其特异性被确认的断片，在这里，作为特异性的确认，例如，在以目的 mRNA为模板时，能够通过相比于适当的对照，确认可以得到特异的PCR扩增产物而进行。作为这样的核酸片段，例如如果是AMDl基因，可以列举由GenBank登录编号 NM_001634碱基序列的一部分或与其互补的碱基序列组成的核酸片段、或由与这些同源的碱基序列组成且功能上等价的核酸片段。在这里，作为由与这些同源的碱基序列组成且功能上等价的核酸片段，例如，可以列举以下表示的在(a) (c)中所示，在目的基因mRNA的测定中能够使用的核酸片段。AMDl基因以外的情况也同样。(a)在NM_001634所示的碱基序列一部分或与其互补的碱基序列组成的核酸片段中，缺失、取代或添加1个或数个碱基的核酸片段。(b)与NM_001634所示的碱基序列一部分或与其互补的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选99%以上同源性的碱基序列组成的核酸片段。(c)由与由NM_001634所示的碱基序列一部分或与其互补的碱基序列组成的DNA在严谨条件下杂交的碱基序列组成的核酸片段。另外，在这里，碱基序列的同源性通过使用GENETYX 的同源性解析程序算出。另外，所谓“严谨条件”，意指在2个DNA断片在由Sambrook J等记载的标准的杂交条件下相互杂交(Expression of cloned genes in Ε. coli (Molecular Cloning A laboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62 和 11. 45-11. 61)。使用这样制作的核酸片段和来自检验体的RNA，能够通过进行PCR法，优选进行包含制作来自mRNA的cDNA的步骤的实时RT-PCR法，测定检验体的mRNA。在这里，RT-PCR 法可以使用两步法RT-PCR(Two-M印RT-PCR)和一步法RT-PCR(0ne_St印RT-PCR)等公知的方法进行，但特别从简便且防止交叉污染的观点出发，优选One-M印RT-PCR。这样的One-M印RT-PCR法，例如，可以使用市售的试剂盒进行OiIAGEN One-Step RT-PCR kit 等)。作为在RT反应中使用的具有逆转录活性的酶，可以使用M-MHV逆转录酶(reverse transcriptase)等各种逆转录酶。另外，在扩增DNA的PCR反应中使用的DNA聚合酶优选在90°C以上的温度具有耐热性的DNA聚合酶。这样的PCR反应通过如下进行例如，在90 98°C进行将双链DNA变成单链的热变性反应，在37 72°C进行引物与模板cDNA杂交的退火反应，在50 75°C进行DNA聚合酶作用的延伸反应的温度条件下，将此作为一个循环，进行1 数十次这样的循环。另外， 优选反应条件的1个例子为热变性95°C · 30秒，退火60°C · 30秒，延伸反应72°C · 40秒。 另外，PCR反应时，优选将2种引物作为1组使用，此时，两者必须为正义链和反义链的组合。本发明的核酸片段能够作为探针使用，也能够与其它公知的通用引物、寡聚核苷酸组合使用。另外，作为包含成为该RT-PCR反应模板的mRNA的检验体试样，作为RNA总量，优选包含Ipg 1 μ g的RNA的检验体试样，更优选包含2ng 50ng的RNA检验体试样。在进行适当的PCR反应时，通常“PCR扩增产物量”、“PCR循环数”和“PCR的模板量”之间具有相关关系。因此，如果参考通过这样进行PCR反应而扩增的产物量和PCR循环数适当计算，就能够求出目的基因的mRNA量，即能够求出目的基因的表达量。PCR扩增产物量和PCR循环数的决定没有特别限定，可以通过所有的方法进行，但例如，可以通过特别规定到达任意设定的一定量的DNA量时的PCR循环数来进行。这样的特别规定，例如，能够通过使用“合并标记PCR产物的PCR法，和进行标记的经时监测的PCR 法”，特别规定到达设定的一定荧光强度时的PCR循环数而进行。在这里，作为标记，例如可以列举由荧光色素的标记，作为标记的测量，可以列举荧光强度的测量。另外在这里，作为由荧光色素的标记，例如，可以列举由嵌入性荧光色素的标记，作为嵌入性荧光色素，可以列举STOR(R)Green I。嵌入性色素因为具有由在双链核酸中嵌入而荧光强度增强的性质， 所以发出反映扩增的PCR产物强度的荧光。另外，由荧光色素的标记，也能够通过由荧光色素标记的TaqMan探针和Moleculer Beacon等的使用而进行。TaqMan探针和Moleculer Beacon是在由PCR扩增的区域内部序列具有同源性的寡聚核苷酸上结合荧光色素和猝光剂的探针，在PCR反应中共存使用。由于通过探针中结合的荧光色素和猝光剂的相互作用， 发出对应PCR反应的荧光，所以能够通过测定在各PCR阶段的荧光强度，进行扩增的PCR产物的经时的观察。另外，如上所述，在检验体中的目的基因的mRNA量，例如，也能够由在目的mRNA上可以特异杂交的核酸片段和来自检验体的RNA的杂交效率的情况求出。在这里，在目的基因mRNA上可以特异地杂交的核酸片段，例如，能够使用如上所述设计和制作的核酸片段。另外，作为这样的核酸片段，优选带有标记的核酸片段。在这里。 作为标记，可以列举酶、顺磁性离子、生物素、荧光色素、发色团、重金属或放射性同位素，作为更优选的标记可以列举酶，在这里，作为酶，可以列举辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。这样的标记，能够由公知的方法进行。如果测定含有来自检验体的RNA的试样和这样的核酸片段的杂交程度，就能够由公知的换算方法，得知在检验体中的目的基因的mRNA量。这样的杂交程度的测量没有特别限定，可以按照公知的方法进行，但例如，能够通过在核酸片段上添加的标记的测量而进行。即，在使用由荧光色素标记的核酸片段时，能够通过测量荧光强度进行。另外，目的基因表达量的测定，也能够将在目的基因及其mRNA的碱基序列上能够特异地杂交的核酸片段作为探针使用而进行。例如，如果是AMDl基因，由上述GenBank登录编号匪_0016；34记载的碱基序列一部分(例如GCATGTGAGTGTTCCGACTTCATCTGTTCC)或与其互补的碱基序列组成的核酸片段、或由与这些同源的碱基序列组成且功能上等价的核酸片段也可以作为探针使用。这些探针在任意固相中固定化，可以作为DNA芯片、基因芯片、 cDNA微阵列、寡聚DNA阵列等利用。另外，作为探针，在上述列举物以外，也可以使用为了能够特异检出目的基因及其 mRNA的碱基序列，从目的基因及其mRNA的碱基序列选择多处适当处，并用多个在该区域上可以特异地杂交核酸片段而设计的探针。在探针的固定化中使用的固相，如果是能够固定化多核苷酸的固相就没有特别限制，例如，可以列举玻璃板、尼龙膜、微球、硅芯片、毛细管等。另外，也可以标记固相。在标记中没有特别限制，例如，可以列举荧光色素、放射性同位素等。多核苷酸向固相的固定，既可以是在固相上载置预先合成的多核苷酸的方法，另外也可以是在固相上合成目的多核苷酸的方法。固定方法，例如，如果是DNA微阵列，利用市售的点样仪(spotter)等，根据固定化探针的种类，可以使用适当公知的方法(由喷墨法的多核苷酸的印记、原位合成、光刻法)。使从由上述方法制成的DNA芯片等和从培养细胞、组织、组织切片或血液的裂解物等检验体制备的RNA为基础制备的标记DNA或RNA、或从这些检验体直接制备的标记DNA 或RNA杂交，将所形成的探针和标记DNA或RNA的双链的量作为来自于该探针标记物的信号测定，就能够测定目的基因的表达量。在这里，信号的检测可以由通常方法，例如，能够用放射线检测器和荧光检测器等测定进行。在上述方法以外，也能够由微球法测定目的基因的表达量。例如，在分别施加了不同荧光标记的微球上固定对于来自各个目的基因的mRNA的探针，使之与从培养细胞、组织、组织切片或血液的裂解物等检验体制备的目的基因的mRNA杂交，通过检测其荧光，识别各个目的基因，同时，对于与在微球上固定的探针杂交的来自目的基因的mRNA，杂交标记探针，通过检测其探针的标记测定mRNA量，也能够同时测定多个目的基因的表达量。使用上述的探针，还能够使用DNA杂交法(southern hybridization)、RNA杂交法(northern hybridization)、FISH法、CGH法等公知的方法，测定目的基因的拷贝数·表达量。另外，将由目的基因编码的多肽作为测定对象时，可以通过使用了对该多肽的特异抗体的公知的免疫染色法(ELISA法、蛋白质印迹法(Western blot)、EIA法、RIA法、IHC法等)，测定目的基因的表达量。在判断对伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性中，测定来自抗癌剂投与前和投与中的癌症患者的生物试样中的基因表达量，由上式(1) ( 算出最佳肿瘤缩小效果 (% )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)，当为确定基准值以上的数值时，能够判断该癌症有抗癌剂敏感性，当为小于确定基准值的数值时，能够判断该癌症没有抗癌剂敏感性。 在这里，规定的基准值能够根据对象的癌症患者状态和癌症种类，根据与伊立替康、SN-38 和/或其盐的组合使用的药剂种类等，按照后述实施例适当设定，例如，单独投与伊立替康时，关于最佳肿瘤缩小效果(％ )优选为50%，关于总体生存期(日)优选为400日，关于无进展生存期(日)优选为100日。在抗癌剂投与前，由上式(1) (3)得到的数值小于规定的基准值时，能够判断该癌症对伊立替康、SN-38和/或其盐没有敏感性，不能期待其药效，继续投与这样的不能期待药效的抗癌剂时，有癌症恶化、副作用增大的危险。这样，本发明的敏感性判断方法，因为不仅在抗癌剂治疗反应性的判断有大的贡献，而且在防止伴随不能期待药效的抗癌剂的继续投与的副作用增大中也有大的贡献，所以，特别适于在抗癌剂投与前的癌症患者利用。另外，也能够作为用于积极地选出能够期待治疗效果的患者的判断方法使用。另外，由于通过测定来自抗癌剂投与中的癌症患者的生物试样中的目的基因的表达量，在每个治疗循环中测定由上式(1) C3)得到的数值，进行监测，能够经时地评价在该癌症中的敏感性，所以也成为是否应该继续治疗的判断方法。在对抗癌剂不具有敏感性时，因为可以认为不能期待该药效，只表现由抗癌剂引起的副作用，所以，在本发明中的敏感性判断方法，也能够作为用于避免伴随不必要的副作用表现或无效的继续治疗的癌恶化和副作用增大的判断方法使用。作为判断敏感性的参数，在最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)以外，也能够使用表示有效性参数的总有效期(日)、稳定期(日)、治疗成功期(日)，表示副作用参数的伊立替康、SN-38及其代谢物的血中浓度及其消失半衰期、生物体内利用率、浓度时间曲线下面积、清除率、分布容积等。本发明的方法也能够使用用于实施这样的方法的试剂盒，S卩，使用敏感性判断用试剂盒进行。在这里，作为这样的敏感性判断用试剂盒，含有(A)上述7个基因的表达量测定试剂，和(B)用于算出上述最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期 (日)的操作步骤。在这里，在(A)上述7个基因的表达量测定试剂中，例如，包含(Al)记载用于目的基因的表达量测定的方法的操作步骤、(A2)在用于目的基因的表达量测定的方法中使用的试剂、(A3)固定化了在目的基因的mRNA上可以特异地杂交的核酸片段的DNA芯片。另一方面，在⑶的操作步骤中，除了(Bi)用于由式⑴ (3)算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)的操作步骤以外，可以列举(B2)用于判断有无伊立替康、SN-38和/或其盐敏感性的基准值等。在该基准中，包含最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)、无进展生存期(日)的基准值、影响基准值的要素及其影响的程度等，这些基准值可以由对象的癌症患者的状态和癌的种类、与伊立替康、SN-38和/或其盐组合使用的药剂种类等适当设定。使用该基准值，可以如上所述判断。本发明的试剂盒不限定于这些，指的是聚集了在进行这样的方法的全部或一部分的步骤中必须物质的全部或一部分。在这里，“在进行步骤中必须的物质”中，例如可以列举缓冲液等。另外，如果以由上式⑴ (3)得到的最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日) 或无进展生存期(日)的任意1个的数值增量作为指标，就能够筛选对伊立替康、SN-38和 /或其盐的敏感性增强剂。即，在体外或体内，使这些数值增加的物质增强抗癌剂敏感性。 例如，在载癌动物中的抗癌剂投与前后，增强这些数值增量的物质是增强抗癌剂的敏感性的物质(抗癌剂敏感性增强剂)。另外，在体外，在各种癌细胞株中，在伊立替康、SN-38和 /或其盐的存在下，增强这些数值增量的物质是增强抗癌剂敏感性的物质(抗癌剂敏感性增强剂)。如果是抗癌剂敏感性增强剂，因为这些数值的增量比肿瘤缩小或细胞杀伤效果更早出现，所以能够在更短时间的研究中判断该物质作为抗癌剂敏感性增强剂是否有用，在伴随筛选的劳力和费用的减少方面也可以期待大的效果。如果并用这样得到的抗癌剂敏感性增强剂和敏感性增强对象的伊立替康、SN-38 和/或其盐，该抗癌剂的治疗效果就会飞跃性提高。本发明的组合物能够以口服投与或非口服投与的任意1种使用，但优选非口服投与。在投与时，将含有抗癌剂敏感性增强剂和敏感性增强对象的抗癌剂的组合物与适合于口服投与、直肠内投与、注射等投与方法的固体或液体的医药用无毒性载体混合，能够以常用的医药品制剂的形态投与。在这里，含有抗癌剂敏感性增强剂和敏感性增强对象的抗癌剂的组合物，既可以是包含这两种成分的一个组合物，也可以分别是各个制剂的组合。另外，这些成分也可以分别为各个投与路径。作为这样的制剂，例如，可以列举片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等固体制剂，溶液剂、 悬浊剂、乳剂等液剂，冷冻干燥剂等。这些制剂可以由制剂上常用手段制备。作为上述医药用无毒性载体，例如，可以列举淀粉、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、 聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。另外，根据需要， 也可以适当添加稳定剂、润湿剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂、赋形剂等常用的添加剂。另外，在上式(1) (3)中的第1项数值和各基因的系数，以由实时RT-PCR法得到的各基因的表达量为基础决定，但如果由实时RT-PCR法得到的各基因的表达量和由实时RT-PCR法以外的别的方法得到的基因的表达量测定值具有一定的相关，则在上式(1) (3)的第1项数值和各基因的系数中，也能够追加使用将由实时RT-PCR法和其以外的别的方法得到的测定值调整的系数，在该式中代入由实时RT-PCR法以外的别的方法得到的基因表达量即可。实施例以下，列举实施例更加详细地说明本发明的内容，但本发明不受这些实施例任何制约。实施例1 (与使用癌细胞株的SN-38敏感性相关的基因鉴定)1.从人癌细胞株、人非肿瘤性培养细胞的总RNA的制备从2种人白血病细胞株(骨髓性白血病细胞株K562及其获得性多剂耐性细胞株K562/D0X)、9种肺癌细胞株(小细胞肺癌细胞株PC-6、其SN-38获得耐性细胞株PC-6/ SN2-5及其CPT-Il获得耐性细胞株PC-6/DQ2-2、肺腺癌细胞株PC-9及其CDDP (顺钼)获得耐性细胞株PC-9/⑶DP、肺腺癌细胞株PC-14及其⑶DP获得耐性细胞株PC-14/⑶DP、肺扁平上皮细胞癌株LC-S及肺腺癌细胞株A549)、7种消化器官癌(大肠癌4株HCC-48、HCC_50、 C0L0201、C0L0320DM、胃癌2株HSC-42、MKN45、食道癌1株HEC-46)、1种口腔上皮类表皮细胞株(KB)使用RNeasy Mini kit(Qiagen公司生产)，按照附属的操作步骤，提取总RNA， 在-80°C保存。总 RNA 使用 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies 公司生产)和 RNALabChip (Agilent Technologies公司生产)，确认18S和28S rRNA的峰鲜明且高品质以后，供给微阵列解析。2.使用微阵列的全面基因表达解析和通过实时RT-PCR法的定量性基因表达解析使用包含20784克隆、阳性对照与阴性对照的RIKEN human 21K阵列及包含19881 克隆、阳性对照与阴性对照的寡聚核苷酸的CodeLink Uniset Human 20K I Bioarray (GE Healthcare公司生产)，分析上述19种人培养肿瘤细胞株的基因表达谱。为了构筑RIKEN human 21K 阵列而使用的标的 DNA 是从 ResGen (Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)购入的 cDNA克隆的甘油菌(glycerol stock)。在cDNA微阵列中，将C0L0201细胞作为参照样品， 分别通过使用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的随机引物的逆转录标记样品细胞株的聚(A)RNA，在寡聚核苷酸微阵列中，用Cy5标记所有检验体，由一色法评价。在使用RIKEN human 21K阵列的解析中，求出各点的lo&(Cy3/Cy5)，从其中减去阵列的全部点信号lo&(Cy3/Cy5)的中央值，作为各个基因标准化的相对表达量。在使用寡聚核苷酸微阵列的解析中，将在上述中得到的信号强度数据使用GeneSpring GX(Agilent公司生产)微阵列基因表达解析软件，进行标准化(Normalization)解析。即，从点信号减去背景信号，其值小于0. 01的作为0. 01，将除以阵列的全部点信号的中央值得到的值分别作为基因标准化的相对表达量。 另夕卜，使用 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)、ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems)定量评价基因表达量。3.对伊立替康、SN-38的敏感性评价关于全面进行基因表达解析的19种人培养肿瘤细胞株，使用MTT (甲基噻唑基溴化四唑，methylthiazol tetrazolium bromide)法进行对伊立替康和SN-38的敏感性评价。即，在96微孔板(Nunclon ；Nunc, Roskilde, Denmark)的各孔中，和80 μ L培养液(加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液)一起接种4X IO3个细胞，在M小时、37°C、5% CO2的条件下，在保温箱内培养，此后，更换培养液(加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液)，在各种浓度的SN-38或伊立替康和37°C、5% CO2的条件下，在保温箱内培养。在培养72小时后，取出培养液，在各孔中加入100 μ L的PBS (磷酸缓冲液)，以1500rpm离心5分钟，抽滤除去上清。在各孔中加入IOyL的0.4% MTT试剂和IOyL的0. IM琥珀酸钠，在37°C、5% CO2的条件下培养2小时，此后，加入150yL的DMS0，充分用移液枪混合(pipetting)后， 用微孑L板检测仪(Maxline Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测定 570 650nm处的吸光度。求出从药剂处理群各孔的吸光度只减去培养液吸光度平均值得到的值的平均值，再除以从对照群(药剂未处理群)各孔的吸光度，只减去培养液的吸光度平均值得到的值的平均值，在其上乘100，求出增殖抑制率(％ )，在半对数图表中对各浓度作图，制成增殖抑制曲线，由此求出50%细胞增殖抑制浓度(IC5tl)，作为敏感性比较的指标 (表 1)。[表 1]通过MTT法的50%细胞增殖抑制浓度(IC5tl)
权利要求
1.一种伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法，其特征在于测定检验体中的AMD 1基因、CTSC基因、EIFIAX基因、C12orf 30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表达量，通过下式⑴ (3)算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期 (日)或无进展生存期(日)，最佳肿瘤缩小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)总体生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)无进展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表达量，B表示CTSC基因的表达量，C表示 EIFlAX基因的表达量，D表示C12orf30基因的表达量，E表示DDX54基因的表达量，F表示 PTPN2基因的表达量，G表示TBX3基因的表达量。
2.如权利要求1所述的判断方法，其特征在于 检验体是来自患有癌的被检验者的生物试样。
3.如权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于 检验体是来自患有大肠癌的被检验者的生物试样。
4.如权利要求1 3中任一项所述的判断方法，其特征在于 基因的表达量是来自该基因的mRNA量。
5.一种伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断用的试剂盒，其特征在于含有(A)测定检验体中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54 基因、PTPN2基因和TBX3基因表达量的试剂，与⑶用于通过下式(1) ⑶算出最佳肿瘤缩小效果(％ )、总体生存期(日)或无进展生存期(日)的使用说明，最佳肿瘤缩小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)总体生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)无进展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表达量，B表示CTSC基因的表达量，C表示 EIFlAX基因的表达量，D表示C12orf30基因的表达量，E表示DDX54基因的表达量，F表示 PTPN2基因的表达量，G表示TBX3基因的表达量。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于 检验体是来自患有癌的被检验者的生物试样。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于 检验体是来自患有大肠癌的被检验者的生物试样。
8.一种对伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性增强剂的筛选方法，其特征在于测定检验体中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf 30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表达量，以使用下式(1) (3)算出的最佳肿瘤缩小效果(％)、总体生存期(日)或无进展生存期(日)中的任意1个数值的增量作为指标，最佳肿瘤缩小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)总体生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)无进展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表达量，B表示CTSC基因的表达量，C表示 EIFlAX基因的表达量，D表示C12orf30基因的表达量，E表示DDX54基因的表达量，F表示 PTPN2基因的表达量，G表示TBX3基因的表达量。
9.一种对由权利要求8所述的方法得到的伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性增强剂。
10.一种癌治疗用组合物，其特征在于含有权利要求9所述的敏感性增强剂，并且含有伊立替康、SN-38和/或其盐。
全文摘要
提供能够判断各患者治疗反应性的对伊立替康、SN-38和/或其盐的敏感性判断方法和利用其的新的癌症治疗手段。伊立替康、SN-38和/或其盐敏感性的判断方法，其特征在于，测定检验体中的AMD1基因、CTSC基因、EIF1AX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2基因和TBX3基因的表达量，由式(1)～(3)算出最佳肿瘤缩小效果(％)、总体生存期(日)或无进展生存期(日)。
文档编号C12Q1/02GK102325905SQ201080008810
公开日2012年1月18日 申请日期2010年3月12日 优先权日2009年3月13日
发明者桧山桂子, 西山正彦, 谷本圭司 申请人:学校法人埼玉医科大学, 株式会社益力多本社