专利名称：单细胞核酸分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分析小细胞群或单细胞的核酸，如基因组DNA或RNA(如非编码 RNA或mRNA)的方法。
背景技术：
快速及可靠地分析小样品或单细胞的基因组DNA或RNA (如非编码RNA或mRNA) 的障碍是常规聚合酶链式反应(PCR)的重复性已经不适于保证所有感兴趣的目标核酸被充分扩增以被检测。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供分析单细胞核酸的方法。在特定实施方式中，所述单细胞是哺乳动物细胞，如植入前胚胎的细胞、干细胞、疑似癌细胞、致病生物的细胞和/ 或犯罪现场获得的细胞。在示例的实施方式中，所述细胞是人卵裂球(如来自八细胞期胚胎)或人干细胞。例如，一种用于基因型分析单细胞的示例的方法需要(a)对单细胞的基因组进行全基因组扩增以产生扩增的基因组；(b)预扩增所述扩增的基因组以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(基因座)的扩增子；和(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。在一些实施方式中，实施全基因组扩增(WGA)以使得达不到反应平台期。典型地， WGA进行多于两个扩增循环，并且在特定实施方式中，小于大约10个循环(如，大约4和8 个循环之间，包括4和8个循环)。合适的WGA技术包括引物延伸PCR(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR、连接介导 PCR(LMP)、基于T7的DNA线性扩增(TLAD)和多重置换扩增(MDA)。一种分析单细胞RNA的示例的方法需要(a)从单细胞的RNA制备DNA ；(b)预扩增所述DNA以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(目标RNA)的扩增子；和(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。在特定实施方式中，通过逆转录或扩增mRNA制备cDNA。在其它实施方式中，通过逆转录或扩增非编码RNA制备DNA。例如，所述非编码RNA可以是小核仁RNA (snoRNA)、微小 RNA(miRNA)、小干扰 RNA(siRNA)禾Π / 或与 Piwi 蛋白相作用 RNA(piRNA)。可以对从单细胞的基因组DNA或RNA产生的核酸进行预扩增。当从RNA(如通过逆转录)制备DNA时，然后可以在同样的反应混合物中实施预扩增。在一些实施方式中，使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(如基因座)的引物对实现预扩增。在特定实施方式中，预扩增可以进行8-18个循环。在特定实施方式中，扩增混合物中不存在探针。在一些实施方式中，通过预扩增产生的扩增子可以通过进一步扩增而被检测。在特定实施方式中，所述进一步扩增通过使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(基因座)的引物对而实现。这些引物对可以和用于预扩增的那些引物对相同或不同。在示例的实施方式中，可以进行所述预扩增，且得到的预扩增混合物可以在扩增之前分布在微流体装置的分离室中。合适的微流体装置包括(至少部分地包括)由弹性材料制成的那些。在一些实施方式中，通过聚合酶链式反应(PCR)完成所述预扩增和/或扩增。当通过PCR完成所述扩增时，扩增产物的存在可以通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)测定。 在这样的实施方式中，通用的qPCR探针，如双链DNA (dsDNA)染料可以用在扩增混合物中以检测扩增产物。可选地或另外地，可以使用一种或多种目标特异的qPCR探针以检测扩增产物。在示例的实施方式中，使用荧光核酸酶检测测定扩增产物的存在。例如，可以使用双标记的荧光寡核苷酸探针检测扩增产物的存在。在预扩增和/或扩增中使用的引物对可以扩增单核苷酸多态性(SNP)。在特定实施方式中，这些可以与一种或多种遗传缺陷的存在相关联。
图1 达到94个单独细胞的BioMark基因型分析软件SNP基因型分析簇图。图2 来自96个独特SNP TaqMan检测对94个单细胞的BioMark基因型分析软件的全SNP簇图。图3 产生于源自多种总RNA起始水平的特定目标扩增(STA)模板的mi RNA 30C 检测线性“标准曲线”，如在实施例2B中描述的进行分析。用Ct对相对浓度表示数据。EFF 显示了稀释系列的PCR效率。图4 取自同样STA稀释，但来自不同的总RNA起始量的U6检测线性的标准曲线， 如在实施例2B中描述的进行分析。检测证明了来自通过STA的RT步骤和最终在集成流体通路(IFC)中的显著的反应线性。根据Ct值比总RNA数量的ng表示数据。EFF显示了稀释系列的PCR效率。图5 =HiiRNA表达数据的48. 48Ct热度图(实施例2B)。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA进行15-18个循环。图6 :miRNA表达数据的96.96Ct热度图。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA 进行15-18个循环。
具体实施例方式在如评估与体外受精(IVF)相关的样品、CTC和肿瘤一致性研究中，分析核酸(如小样品的基因组DNA)的能力是重要的。单细胞的基因型是多种情况，包括发育生物学、突变检测和细菌学中所感兴趣的。例如，在理解分化、发育、疾病和对多种刺激的细胞应答的分子基础中，编码RNA(mRNA)和非编码RNA的表达模式同样是感兴趣的。在一些实施方式中，本发明包括基于全基因组扩增(WGA)的应用的方法，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。WGA的应用在预扩增步骤之前提供了多拷贝基因组，增加了所有感兴趣的目标核酸的完全预扩增的可能性。在其它实施方式中，制备RNA的DNA表现型，例如，从mRNA制备cDNA，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。定义除非另有说明，在本权利要求书和说明书中使用的术语如下述所定义。术语“核酸”指核苷酸多聚体，且除非另有限制，包括已知的天然核苷酸的类似物， 所述类似物能够以与天然存在核苷酸相似的方式发挥作用(如杂交)。所述术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如，基因组DNA ；互补 DNA (cDNA)，其是mRNA的DNA表现型，通常通过信使RNA (mRNA)的逆转录或通过扩增获得； 合成地或通过扩增产生的DNA分子；和mRNA。所述术语核酸包括双链核酸或三链核酸，以及单链分子。在双链核酸或三链核酸中，所述核酸链不需要共延伸(即，双链核酸不需要沿两条链的全部长度双链延伸)。所述术语核酸还包括它们的任何化学修饰，如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可以包括添加化学基，所述化学基对个别核酸碱基、磷酸二酯键或整个核酸合并了额外的电荷、极性、氢键、静电交感和特性。这样的修饰可以包括如2’位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰的碱基修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，骨架修饰，如异碱基异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非常规碱基对组合，等等。更具体地，在一些实施方式中，核酸可以包括多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)和嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型核酸，以及其它包含非核苷酸骨架的聚合物，如聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚吗啉(购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis, Oregon，及Neugene)聚合物，和其它合成的序列特异的核酸聚合物，假设所述聚合物包含在结构上允许碱基配对和碱基堆积(如在DNA和 RNA中所发现的)的核碱基(nucleobase)。所述术语核酸还包含连接的核酸(LNA)，在美国专利号6，794，499,6, 670，461,6, 262，490和6，770，748中描述，出于它们关于LNA的公开内容，通过引用的方式全文结合至本文。所述核酸可以源自完全地化学合成过程(如固相介导的化学反应)，源自生物来源(如分离自产生核酸的任何物种)，或源自包括通过分子生物学方法处理核酸的过程，如 DNA复制、PCR扩增、逆转录，或源自这些过程的组合。本文中使用的术语“目标核酸”指在本文描述的方法中被检测的特定核酸。目标核酸包括，例如，在基因型分析研究中的感兴趣的基因座(如，单核苷酸多态性)、在表达研究中的感兴趣的mRNA、以及非编码RNA。初始地(即，在实验干涉之前)以RNA形式发现的目标核酸也是本文定义的“目标RNA”。非编码RNA包括非必要翻译成蛋白的那些RNA种类。这些包括但不限于转运 RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及RNA如小核仁RNA(snoRNA ；如与甲基化或假尿苷酸化关联的那些)、微小RNAOniRNA ；其调节基因表达)、小干扰RNA(siRNA ；其涉及RNA干扰(RNAi)途径，其中它们干扰特定基因的表达，但同样已经显示出作为抗病毒剂和在基因组的染色质结构成形中显示)和与Piwi蛋白相作用RNA(piRNA ；其通过与Piwi蛋白相互作用形成RNA-蛋白复合体，这些piRNA复合体已经与生殖系细胞中的逆转座子和其它遗传元件的转录基因沉默关联，特别是精子发生的那些)和长非编码RNA (长ncRNA ；它们是非编码转录本，典型地长于大约200个核苷酸)。本文中使用的术语“目标核苷酸序列”指具有目标核酸的核苷酸序列的分子，如， 通过扩增目标核酸获得的扩增产物或基于mRNA目标核酸的逆转录而制备的cDNA。本文中使用的术语“互补的”指在两个核苷酸之间配对的能力。即，如果核酸给定位置的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸氢键结合，则这两个核酸被认为是在那个位置彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补(沃森-克里克或非经典配对)可以是“部分地”，其中仅一些核苷酸结合，或者当在单链分子之间存在全部互补，其可以是完全的。核酸链之间的互补程度明显影响核酸链之间的杂交效率和强度以及后续的堆积作用。“特异杂交”指在限定的严格条件下，核酸结合至目标核苷酸序列而不实质结合至在杂交混合物中存在的其它核苷酸序列。本领域技术人员公认放松杂交条件的严格性能够容许序列错配。在特定实施方式中，在严格杂交条件下完成杂交。所述短语“严格杂交条件”一般指在限定的离子强度和PH值下比特定序列的解链温度(Tm)低大约5°C至大约20°C或 25°C范围内的温度。如在本文中所使用的，所述Tm是双链核酸分子群变成半解离成单链的温度。计算核酸Tm的方法是本领域已知的(见，如Berger和Kimmel (1987)METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 152 =GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego =Academic Press, Inc.和 Sambrook等(1989)MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL第 2 版第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory)，均通过引用的方式结合至本文)。如由权威参考文献所显示的，Tm值的简单估测可以通过等式Tm = 81.5+0.41(%G+C)计算，其中核酸处于 IM NaCl 7jC溶液中(见，如，Anderson 禾口 Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交物的解链温度(和因此的严格杂交的条件) 由多种因素影响，如所述引物或探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和所述目标核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等等)，以及盐的浓度和其它成分(如， 甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)。这些因素的影响是公知的并在本领域的权威参考文献中被讨论。适于完成大部分序列的特异杂交的示例的严格条件是至少大约 60°C的温度和pH7的大约0. 2摩尔的盐浓度。术语“寡核苷酸”被用于指相对短的、通常短于200个核苷酸、更具体地短于100个核苷酸、更具体地短于50个核苷酸的核酸。典型地，寡核苷酸是单链DNA分子，但是也可以产生双链寡核苷酸。术语“引物”指在适当的缓冲液和合适的温度、在适当的条件(即，存在四种不同的三磷酸核苷和用于聚合的试剂(如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶))下能够与核酸杂交 (也被定义为“退火”)并作为核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位置的寡核苷酸。所述引物的合适长度依赖于所述引物的计划用途，但引物典型地至少6个核苷酸长以及，更典型地范围在10至30个核苷酸长度，或甚至更典型地15-30个核苷酸长度。其它引物可以稍微长一些，如30-50个核苷酸长。在本文中，“引物长度”指与互补的“目标”序列杂交并引导核苷酸合成的寡核苷酸或核酸部分。短引物分子通常需要较冷的温度以与所述模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不必反映所述模板的精确序列但必须充分互补以与模板杂交。 所述术语“引物位置”或“引物结合位置”指与引物杂交的目标核酸片段。引物可以包括核苷酸标签，如，添加至它的5’末端。本文中使用的术语“核苷酸标签”指添加至目标核苷酸序列的预确定的核苷酸序列。所述核苷酸标签可以编码一则关于目标核苷酸序列的信息，如所述目标核苷酸序列的性质，所述序列源自的染色体，或者所述目标核苷酸序列源自的样品的性质。核苷酸标签通常不用作第一轮扩增的引物结合位置。如果引物或其一部分与核酸中的核苷酸序列特异杂交，则引物被称为与另一条核酸退火。引物与特定核苷酸序列杂交的陈述并不意味着暗示所述引物完全地或专门地与那条核苷酸序列杂交。术语“引物对”指一组引物，包括与将要被扩增的DNA序列的5’末端的互补序列杂交的5’ “上游引物”或“正向引物”和与将要被扩增的序列的3’末端杂交的3’ “下游引物”或“反向引物”。本领域技术人员将意识到，所述术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”并不意味着限定，而是在特定实施方式中提供示例性的方向。如果一种引物对可以被用于特定扩增给出的扩增混合物中特定的目标核苷酸序列，则所述弓I物对被称为是“独特的”。“探针”是能够通过一种或多种类型化学键，一般是通过互补碱基配对，通常是通过氢键形成(但也通过同序号金属络合物(co-ordinal metal complexe))结合互补序列的目标核酸而因此形成双链结构的核酸。所述探针与“探针结合位置”结合或杂交。可以用可检测的标记物标记所述探针以允许容易地检测所述探针，特别是当所述探针已经与它的互补目标杂交时。但是，可选地，所述探针可以是未标记的，但是可以通过特异结合被标记的配基而检测到，直接地或间接地检测到探针。探针的大小可以明显变化。通常，探针的长度是至少6至15个核苷酸。其它探针至少是20、30或40个核苷酸长。其它探针是稍微更长的，至少是50、60、70、80或90个核苷酸长。其它探针更长，至少是100、150、200或更多个核苷酸长。探针还可以是任何上述值所限定的任何范围内的任何长度(如，长度是15-20 个核苷酸)。引物同样可以作为探针起作用。所述引物或探针可以与目标核酸序列完全互补或可以是小于完全互补。在一些实施方式中，在至少7个核苷酸的序列上、更典型地在10-30个核苷酸范围的序列上、和通常至少14-25个核苷酸的序列上，所述引物与目标核酸序列的互补序列具有至少65%的一致性，更通常地具有至少75%的一致性、至少85%的一致性、至少90%的一致性、或至少 95^^96% ,97^^98%或99%的一致性。应当理解，通常期望一些碱基(如引物的3，碱基) 与目标核酸序列的相应碱基完全互补。引物和探针典型地在严格杂交条件下与目标序列最特异退火。根据本发明的教导的扩增包括至少一种目标核酸的至少一部分典型地以模板依赖方式被拷贝的任何方法，包括但不限于，用于线形地或指数地扩增核酸序列的广泛范围技术。用于实施扩增步骤的示例性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、后续Q-复制酶扩增的连接、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多元扩增、滚环扩增(RCA)等等，包括它们多种形式和组合，例如但不限于，OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR (同样被认为是组合的链式反应-CCR)等等。在其它资源中，这些技术的描述可以在以下中找到Ausbel等；PCR Primer :A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed. , Cold Spring Harbor Press (1995) ；The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002) ；Msuih 等，J. Clin. Micro. 34 :501-07 (1996) ；The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rap ley, ed. , Humana Press, Totowa, NJ. (2002) ；Abramson 等， Curr Opin Biotechnol. 1993 年 2 月；4 (1) :41_7，美国专利号 6，027，998 ；美国专利号 6，605，451 ,Barany 等，PCT
发明者埃米·汉密尔顿, 林敏 , 阿兰·米尔, 马丁·皮耶普日克 申请人:弗卢伊蒂格姆公司