基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的免疫原性组合物、疫苗和诊断方法

专利名称：基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的免疫原性组合物、疫苗和诊断方法
技术领域：
本发明一般地涉及新鉴别出的犬瘟热病毒(⑶V)的分离株(isolate)。具体地，本发明提供了改进的CDV免疫原性组合物、疫苗和诊断方法，它们含有或考虑了这些新发现的分离株，并描述了基于基因构成来选择用于免疫原性组合物、疫苗和诊断方法中的广谱分离株的系统方法。
背景技术：
犬瘟热病毒(CDV)是一种影响所有年龄的狗的单链RNA麻疹病毒。CDV会造成多系统感染，所述感染可能涉及眼、呼吸道、胃肠道、体被和神经系统，且通常是快速致命的。尽管该疾病对于狗而言是破坏性的问题，其它物种也易感该病毒，例如，浣熊、狐狸、山狗、狼、 各种毛皮动物和大型非驯养宠物，诸如狮子、豹、猎豹和老虎。在过去，已经证实疫苗可以有效地减少CDV感染的发病率。但是，似乎存在CDV发病率的再现，甚至在充分接种疫苗的动物中。CDV的血凝素(H)蛋白是一种参与宿主细胞-病毒结合的病毒表面蛋白，该蛋白的突变会影响宿主细胞-病毒相互作用。认为H蛋白是CDV的致病因子。H蛋白的氨基酸序列在CDV分离株中表现出显著的(例如约10%)变化，该变化的系统发生分析用作将病毒分离株分成7个谱系的基础美洲-1、美洲_2、北极样、亚洲-1、亚洲-2、欧洲和欧洲野生 (wildlife) (McCarthy, A. J. , Μ. A. Shaw,禾口 S. J. Goodman. 2007. Proc. Biol. Sci. 274:3165-3174)。抗H蛋白的抗体会提供抗感染保护，因而可能是疫苗效能的基础。但是， 抗体不一定在谱系之间交叉反应。因此，基于特定分离株的疫苗可能为疫苗受体提供或不提供针对其它分离株感染的保护。在下述情况下，这是特别有问题的1)诸如CDV等RNA 病毒表现出高突变率，和2、狗在国家之间的全球运输增加，这会促进新谱系向以前不知道它们的领域中的引入。此外，对于用特定CDV分离株接种的狗而言，暴露于遗传上遥远的 CDV可能导致输入性CDV病毒停留在免疫特殊部位(例如脑、神经节、脊髓、中枢神经系统、 自主神经系统、鼻空腔(plenum)和膀胱上皮)，允许遗传上遥远的⑶V传播和扩散而不被检测出，因为神经学征状可能被兽医从业人员忽略，这是由于缺乏诊断测试灵敏度和神经学患者长期治疗的费用。不幸的是，目前在使用中的CDV疫苗在约60年来没有更新(Woma等人， 2010. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin gene of current wild-type canine distemper viruses from South Africa: Lineage Africa. Vet. Microbiol. doi:10. 1016/jvet-mic. 2009. 11. 013)，且没有与这些变化保持同步。这些过时的疫苗的使用，可能是最近的CDV感染暴发的原因，因为这些疫苗不可能提供针对新出现的CDV谱系的感染的保护。此外，PCR测序已经揭示，在一种商业疫苗中使用的疫苗分离株被错误鉴别 (Demeter 等人，2009 Controversial results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain. Vet. Microbiol.在线公开)，这使确定如何最好地检测、监测和预防CDV感染和传播的问题进一步复杂化。显然，需要调查CDV临床病例的增加的流行病学研究，也需要开发考虑了新出现的CDV分离株的新的免疫学和疫苗组合物和诊断方法。

发明内容
在一个方面，本发明提供了新鉴别出的犬瘟热病毒(CDV)的分离株。因此，本发明另外提供了更新的免疫原性组合物和疫苗组合物。本发明的疫苗组合物被设计为提供针对新出现的CDV形式的广谱保护。另外，本发明提供了更新的检测CDV感染的诊断方法和试剂盒。所述诊断方法和试剂盒会提供检测该病毒的新进化形式的能力。本发明的组合物和诊断方法和试剂盒至少部分地基于以前未知的CDV变体的发现，并考虑了现有的疫苗制剂和诊断方法不能胜任的病毒突变形式的出现。在另一个方面，本发明提供了用于选择抗原 (例如，病原性分离株或其一部分)的系统方法，所述抗原对应着抗原的广谱来源(例如病原体分离株或其一部分)的基因构成，并用于这样的组合物和诊断方法中。本发明另外提供了欧洲野生(EW)谱系的一种分离的犬瘟热病毒(CDV)，其包含 CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号PTA-10596)的特征。在另一个实施方案中，本发明提供了从⑶V株⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏号PTA-10596)或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出的CDV减毒株。在该类型的一个具体实施方案中，可以通过噬斑法纯化CDV减毒株。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含含有⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏号PTA-10596)的特征的分离的⑶V或其后代。在另一个实施方案中，本发明提供了美洲-2 (AM-2)谱系的一种分离的犬瘟热病毒(CDV)，其具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号PTA-10597)的特征。在另一个实施方案中，本发明提供了从⑶V株⑶V 08021509⑶V_AM_2 (ATCC保藏号PTA-10597)或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出的CDV减毒株。在该类型的一个具体实施方案中，可以通过噬斑法纯化CDV减毒株。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号PTA-10597)的特征的分离的⑶V或其后代。本发明也提供了在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法。 一种这样的方法包括给所述对象施用免疫原性组合物或疫苗，其包含含有⑶ν 9041474B ⑶V-EW (ATCC保藏号PTA-10596)的特征的分离的⑶V或其后代。在另一个这样的实施方案中，所述方法包括给所述对象施用免疫原性组合物或疫苗，其包含具有CDV 08021509 ⑶V-AM-2 (ATCC保藏号PTA-10597)的特征的分离的⑶V或其后代。本发明也提供了诊断试剂盒。一个这样的实施方案包括寡核苷酸引物，其特异性地用于扩增在SEQ ID N0: 42中所述的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述诊断试剂盒包含寡核苷酸引物，其特异性地用于扩增在SEQ ID N0: 43中所述的核苷酸序列。本领域技术人员会认识到，这样的引物是基于要扩增的目标核苷酸序列(例如被靶向的序列)的核苷酸序列。在有些实施方案中，引物与靶序列的独特序列同源或互补。本发明另外提供了本发明的重组的和/或分离的核酸分子。一种这样的核酸编码 SEQ ID NO: 44的氨基酸序列和/或其核酸互补体。在另一个这样的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互补体。在另一个这样的实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互补体具有大于99. 5%同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述重组的和/或分离的核酸分子编码SEQ ID NO: 45的氨基酸序列和/或其核酸互补体。在另一个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 43 的核苷酸序列和/或其互补体。在另一个这样的实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID N0: 43的核苷酸序列和/或其互补体具有大于95%同一性的核苷酸序列。本发明另外提供了表达载体，其可以包含任一种本发明的分离的核酸分子。在一个这样的实施方案中，所述表达载体包含编码SEQ ID N0: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码SEQ ID N0: 45的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。本发明另外提供了免疫原性组合物和疫苗，其可以包含任一种本发明的表达载体。在一个这样的实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含表达载体，该表达载体包含编码SEQ ID N0: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含表达载体，该表达载体包含编码SEQ ID N0: 43的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。本发明另外提供了本发明的所有分离的和/或重组的蛋白、多肽、肽、融合蛋白和嵌合蛋白。在一个这样的实施方案中，所述多肽包含SEQ ID N0: 44的氨基酸序列。在另一个这样的实施方案中，所述多肽由SEQ ID N0: 42的核苷酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了免疫原性组合物和疫苗，其包含编码血凝素蛋白的⑶V病毒体。在有关的实施方案中，所述血凝素可以部分地由包含SEQ ID N0: 1-33 所述的核苷酸序列的核酸编码。在其它有关的实施方案中，本发明提供了通过给对象施用一种或多种这样的免疫原性组合物或疫苗，在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法。本发明另外提供了选择用于免疫原性组合物中的一种或多种病原体分离株的方法，其中所述分离株使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、 多肽或肽。一种这样的方法包括下述步骤1)对于多种病原体分离株中的每种分离株，测定编码所述选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列；2)对于在测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；3)从所述密码子选择频率数据，鉴别出目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个目标氨基酸残基的最常用的密码子；和4)从多种病原体分离株中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的一种或多种分离株。在本发明的一个实施方案中，所述病原体是犬瘟热病毒。在另一个实施方案中，本发明提供了选择用于免疫原性组合物中的核酸(其可以来自病原体的分离株)的一个或多个核苷酸序列的方法。所述核酸使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽。所述方法包括下述步骤1)(例如从多种病原体分离株中)测定编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的多个核苷酸序列；2)对于在测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；3)从所述密码子选择频率数据，鉴别出目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个目标氨基酸残基的最常用的密码子；和4)从多个核苷酸序列中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的核苷酸序列。


图 1.分离株 07091030 (SEQ ID NO: 1，CDV 的 H 基因的核苷酸(nt) 438-1302)。 该分离株来自具有癫痫发作史、并表现出具有多个胞浆内包含体的嗜中性粒细胞的狗。该 ⑶V分离株在表达犬信号传递淋巴细胞-活化分子的Vero细胞系(Vero + SLAM)中形成大的、多核的合胞体。基于H蛋白序列，这是欧洲野生谱系分离株。该CDV分离株可以特别地用作例如攻击病毒。图 2·分离株 O7O9IO3I (SEQ ID NO: 2，H 基因的核苷酸 440_1494)。图 3·分离株 O7O9IO32 (SEQ ID NO: 3，H 基因的核苷酸 440-12 )。图4.分离株07101508 (SEQ ID NO: 4，H基因的核苷酸427_13；35)。该分离株与欧洲野生(EW)遗传谱系具有高同一性，但是来自具有Onderst印ort疫苗接种史的南加利福尼亚狗。该分离株在Vero+SLAM细胞中生成大合胞体。该分离株与来自小熊猫(lesser panda)和丹麦貂(Danish mink)的CDV具有高同一性，但是不与Ondersteport疫苗分离株密切相关。图5.分离株07100609 (SEQ ID N0: 5，N基因的核苷酸833-1213)。编码来自海洋哺乳动物(海豹)的该CDV-样病毒的基因的核衣壳序列与来自美国的犬分离株 164071 (EU716337)相匹配。图 6.分离株 07110098 (SEQ ID N0: 6，H 基因的核苷酸 439-U86)。图 7.分离株 07111080 (SEQ ID N0: 7，H 基因的核苷酸 630-1501)。图 8·分离株 O8OlO939 (SEQ ID N0: 8，H 基因的核苷酸 44:3-1 3)。图 9.分离株 08011277A (SEQ ID N0: 9，H 基因的核苷酸 423-1556)。图 10.分离株 08011277B (SEQ ID N0: 10，H 基因的核苷酸 1530-410)。图 11.分离株 08011277C (SEQ ID N0: 11，H 基因的核苷酸 433-1230)。图12.分离株08011277D (SEQ ID N0: 12，核衣壳基因的核苷酸833-1578)。不能扩增该分离株的H基因。扩增的缺少指示在引物结合序列中的遗传变异(并因此，缺少同源性)。核衣壳基因序列与CDV分离株的序列相匹配。图 13.分离株 08011671 (SEQ ID N0: 13，H 基因的核苷酸 422-1589。图 14.分离株 08021509 (SEQ ID N0: 14，H 基因的核苷酸 441-686)。图 15.分离株 08030074 (SEQ ID N0: 15，H 基因的核苷酸 447-U82)。图 16.分离株 08030776 (SEQ ID N0: 16，H 基因的核苷酸 422-1541)。图 17.分离株 08030777 (SEQ ID N0: 17，H 基因的核苷酸 411-1537)。图 18.分离株 08031346 (SEQ ID N0: 18，H 基因的核苷酸 436-1059)。图 19.分离株 08040383 (SEQ ID N0: 19，H 基因的核苷酸 1486-620)。
图 20.分离株 08050180A (SEQ ID NO: 20，H 基因的核苷酸 418-1552)。图 21.分离株 08060351 (SEQ ID NO: 21，H 基因的核苷酸 412-1536)。图 22·分离株 O8O6O352 (SEQ ID NO: 22，H 基因的核苷酸 408_1553)。图 23.分离株 08080696 (SEQ ID NO: 23，H 基因的核苷酸 423-7 )。图 24.分离株 O8O8OMl (SEQ ID NO: 24，H 基因的核苷酸 3S7-I522)。图 25.分离株 08081112 (SEQ ID N0: 25，H 基因的核苷酸 411-1207)。图 26.分离株 08120827 (SEQ ID N0: 26，H 基因的核苷酸 413-1535)。图 27.分离株 08120857 (SEQ ID N0: 27，H 基因的核苷酸 724-1522)。图 28·分离株 09011024 (SEQ ID NO: 28，H 基因的核苷酸 578_161；3)。图 29.分离株 09020504-3 (SEQ ID N0: 29，H 基因的核苷酸 418-1549)。图 30.分离株 0904U89 (SEQ ID N0: 30，H 基因的核苷酸 889-1646)。图 31.分离株 09041303 (SEQ ID N0: 31，H 基因的核苷酸 394-1526)。图32.分离株09041474A (SEQ ID NO: 32，H基因的核苷酸410-1539)。在田纳西州的大庇护所(shelter)内的充分接种疫苗的狗(用商业的Ondersteport CDV疫苗接种疫苗2次)发生了上呼吸道疾病、高热、绿鼻涕、咳嗽和最终的神经学征状(例如颤搐)。55只狗中有约20只死亡，包括从它得到分离株09041474A和09041474B的4月龄的雌性狗(参见图37)。图 33·分离株 09040826 (SEQ ID NO: 33，H 基因的核苷酸 418_1δ46)。图34A-F.显示来自野外分离株的犬瘟热病毒血凝素(H)密码子序列的密码子表，使用BioEdit程序，将所述序列与⑶V-H疫苗和参照株密码子序列相比对。序列 Ondersteport = CDV疫苗序列；ΑΥ964110 =参照欧洲野生(Eff)株)；AF112189 =参照美洲-2 (ΑΜ-2)株；ΑΥ962112 =参照北极(Ar)株。用阴影表示密码子中的差异。图35.显示美国和GenBank参照序列中的许多最近的美国⑶V分离株的遗传亲缘关系的系统树(标有下划线)。使用MEGA4. 1程序(可以在位于megasoftware. net 的网站免费得到；Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4. 0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599)，构建系统树。图36.显示来自⑶V感染的狗(0ADDL: 07091030)的⑶V的红细胞包涵体的血膜。 在嗜中性粒细胞和淋巴细胞内可以看到CDV包涵体(箭头)。(水性Romanowsky染色；条 =10微米)。图37.来自09041474B的H基因的完整序列(SEQ ID N0: 42)，包括终止密码子。图38.来自08021509的H基因的完整序列(SEQ ID N0: 43)，包括终止密码子。图39.来自09041474B的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID N0: 44)。图40.来自08021509的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID N0: 45)。
具体实施例方式本发明提供了引起针对CDV的免疫原性应答的组合物、设计为提供针对CDV感染的保护的疫苗组合物、和CDV诊断方法。所述组合物含有新发现的CDV变体。所述新变体会反映CDV的进化趋势，并提供目前在美国循环的主要CDV菌株的指示。所述变体部分地分离自以前已经针对CDV接种疫苗的狗，但是所述狗仍然感染了 CDV并患病，即所述狗是疫苗接种失败的受害者。为了终止或缩短CDV的传播，并防止疫苗接种失败，应当将这些新变体中的一种或多种掺入新的疫苗方案中。本发明也提供了新诊断方法，其用于检测新的 CDV分离株以及用于区分由疫苗施用造成的犬瘟热和由新出现的病毒(其未包含在疫苗中， 且疫苗不能提供针对它的保护)造成的犬瘟热。另外，本发明提供了分析RNA病毒野外分离株和新出现的病原体的方法，以便确定哪种分离株可能用于包含在广谱免疫原性的和疫苗组合物中。几种新的分离株属于欧洲野生CDV谱系；其它属于美洲-2 (AM-2)和北极遗传谱系。已经分离了 34种⑶V病毒，在细胞培养物中繁殖，并已经对病毒的H基因进行部分地或完全地测序。这些病毒来自美国的不同州(例如俄克拉荷马州、佛罗里达州、乔治亚州、 加利福尼亚州、密苏里州、得克萨斯州、堪萨斯州和田纳西州)。图1-33显示了与来自分离株的H基因互补的cDNA的部分序列；图37和38分别显示了分离株09041474B和08021509 的完整H基因序列，包括终止序列(二者都是TGA)；且图39和40分别显示了来自分离株09041474B和08021509的H蛋白的对应的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中，在来自 09041474B的序列的位置5处的氨基酸是谷氨酰胺，在来自08021509的序列的位置5处的氨基酸是精氨酸。本发明也提供了重组的和/或分离的核酸，其编码任一种本发明的H-蛋白，但是它们不包含信号序列(在H蛋白的氨基端处的前12个氨基酸残基)和/或终止密码子，和 /或包含替代信号序列和/或替代终止密码子。在本发明中也包括包含这样的核酸的表达载体，以及由这些核酸编码的表达的重组多肽(包括分离的重组多肽)。图34A-F显示了与⑶V-H疫苗序列和参照株相比对的来自几种野外分离株的⑶V 血凝素(H)序列。该数据的分析用作开发分析和选择用于疫苗中的广谱病原体分离株的相对优选的密码子选择(RPCU)方法/概念的基础。该方法是基于在本文中公开的病原体中的新识别的RPCU模式。尽管该方法可以广泛地适用于许多病原性生物体(下文详细讨论)，本文描述了用于分析RNA病毒分离株的一种示例性应用。本文使用的“分离株”(例如其可以是病原体，例如，RNA病毒)已经从生物样品基本上分离和纯化，且可以已经在合适的细胞培养物中进行传代和/或繁殖。或者，所述分离株可以已经从纯的培养物(例如从 ATCC保藏物)得到。为了实现RPCU方法，从在一个或多个目标群体中得到的动物对象(包括人)的生物样品分离出代表性数目的目标分离株。在特定目标地理区域或地区内，和/或从疑似携带病原体的动物对象，可以得到分离株。合适的生物样品是在病原体感染的急性期内收集的、含有最高浓度病毒的生物样品，且包括不同的组织样品、体液或排泄物(痰、唾液、血液、尿、粪便、拭子[为多类样品的通用术语]等)。通过RPCU可以分析的合适的病原体 (例如新出现的病原体)的实例包括、但不限于各种病毒，诸如RNA病毒、单链DNA病毒、 流感病毒、HIV病毒等；各种细菌性病原体，诸如分枝杆菌属、耶尔森菌属、立克次体属和巴尔通体属物种；各种真菌；和各种原生动物病原体，诸如疟疾、锥虫属、弓形虫属、内阿米巴属、贾第虫属和隐孢子虫属物种等。本领域技术人员会认识到，病原体分离株的“代表性数目”可以变化，但是通常是在至少20-25、通常至少30-35的范围内，且可以无限制地是分离株(或序列)的任意数目，这取决于生物样品的可用性、可进行该目的的资源的可用性等。
“目标群体”通常是易感目标病原体的个体的群体，且可以包括当被病毒感染时表现出疾病征状的个体，或可以是几乎不具有或不具有征状、但是仍然被病原体感染的携带病毒的“载体”。目标地理区域或地区可以是例如被地理和/或法律边界限定的区域或地区，例如，国家、洲、州、县等；或被地理屏障隔开的区域，诸如水体(河、湖、海等)、山脉、沙漠等； 或具有共同的气候或气象模式(例如类似的平均温度或降水、有或没有雪和冰等)的区域/ 地区。选择所有分离株共有的至少一种目标蛋白、多肽或肽，进行详细的基因序列分析。 通常，这样的目标蛋白、多肽或肽是已知具有免疫原性的。“免疫原性的”是指，当所述蛋白、 多肽或肽存在于宿主中时(例如当包含所述蛋白、多肽或肽的病原体感染宿主时)，所述蛋白、多肽或肽在宿主中引起免疫应答(例如抗体生产)。通过本领域技术人员已知的几种方法中的任一种，可以确定主要的免疫原，所述方法包括对来自康复患者的血清进行蛋白印迹分析，所述康复患者已经恢复，并被保护免于病原体的进一步感染。本领域技术人员会认识到，使用RP⑶，可以分析一种或超过一种这样的蛋白、多肽或肽，但是选择至少一种。另夕卜，可以系统地选择更多用于分析，但是基于例如蛋白印迹分析占优势的那种可以是良好的起点。通过MALDI-T0FF，可以对未知的免疫原性的蛋白测序。这有助于设计引物来扩增序列。选择合适的蛋白、多肽或肽以后，使用非常确定的技术，例如聚合酶链式反应 (PCR)测序等，测定编码所述蛋白、多肽或肽的核苷酸序列。或者，使用该方法对比的序列可以从生物样品直接得到而无需分离病毒，或者它们可以是从数据库(例如GenBank或其它)得到的已知序列。然后对核苷酸序列进行分析，以鉴别三联密码子和比对在正确的翻译(阅读)框中的密码子。使用多种核苷酸分析程序中的任一种，可以进行序列分析，包括但不限于使用BioEdit软件的CLUSTAL W分析，由Baylor医学院提供的多序列比对程序(MAP)等。通常，分析的序列是cDNA序列，尽管所述方法不限于使用cDNA，例如，也可以分析DNA、RNA等。 任选地，在分析中包括来自一个或多个参照序列(例如RNA病毒参照株)的对应序列。通常，参照株会代表例如以前在研究的群体和/或区域中占优势(例如以高频率存在)的病原体类型(例如病毒谱系)。这样的参照株可以是例如已经在针对RNA病毒感染的疫苗中使用的RNA病毒。参照序列的优选候选物是，当使用例如BLASTn和BLASTp程序分析时，表现出与病原体(例如新出现的病原体)的核苷酸和蛋白序列的最高同源性和同一性水平的那些。同源性和/或同一性水平可以是至少约90%或95%或甚至至少约99%或更大。以可以容易地对比的形式(包括但不限于以表格形式，例如，在Excel表中)，在框架内比对指定来自分离株(和任选地，一个或多个参照序列)的氨基酸的三联密码子。本领域技术人员熟知，三联体密码是众多的，超过一个密码子可以编码相同的氨基酸。对于与目标蛋白、多肽或肽中的氨基酸残基相对应的每个位置，指出编码来自每个分离株的残基的3个核苷酸的身份，并在所有分离株中进行对比。例如，在假定的目标蛋白中，如果位置 50是亮氨酸，该残基的可能的密码子包括tta和ttg。指出在所有分离株的位置50处的实际密码子，并与在所有其它分离株中存在的密码子相对比。从该对比，可以确定相对优选的密码子选择(RP⑶)。例如，如果75%的分离株使用“tta”来编码Leu残基且25%的分离株使用“ttg”，则tta的RPCU值是75%，ttg的RPCU值是仅25%。因而，tta是在该残基处优选的(即最常出现的或使用的)密码子。以此方式，确定对于目标序列的每个目标残基而言最常使用的或优选密码子。可以针对序列的所有残基，或仅针对残基的子集(例如已知参与关键的病原体活性的残基，或已知属于表位或抗原区的一部分的残基，或与毒力有关的残基等)，进行该分析。RPCU方法的目标是鉴别出用于广谱疫苗制品中的分离株，所述分离株的核苷酸序列具有高百分比的优选密码子。这可以通过几种方法中的任一种来实现。例如，可以测定仅包含最优选密码子的理论的“理想”序列，并可以将分离株的实际序列与该理论序列相对比。计算每个分离株和理想序列之间的同源性水平。与理想序列表现出最高同源性水平 (例如量、百分比等)的分离株是使用最高数目的优选密码子的分离株。该分离株与理想物最好地“拟合”，并被选作疫苗组分。或者，可以不测定理想序列，但是如上所述制表或计算在每个位置的密码子选择，并通过本领域技术人员已知的其它方法(例如通过简单的目检)，在序列之间进行对比，以从分离株中鉴别出使用非常高水平或最高水平的优选密码子数目的序列。不受理论的约束，该选择与下述理解相一致当在编码残基的3-核苷酸序列中发生突变时，只有当含有该突变的病原体(例如RNA病毒)与不含有该突变的病原体相比具有某种选择优势时，该突变才可能永存或变得分布广泛的(widespread)。例如，有些密码子比其它密码子更快速地或更高准确度地翻译，具有这样的突变的病原体可能比非突变型病原体更成功地再生和感染新宿主。因此，由于自然选择，这些密码子最终以更高的频率存在于病原体群体中。具有高百分比的常用密码子的分离株可能具有与所述密码子有关的累积优点，且可能表现出由所述密码子赋予的有利特征，因而，当包含在疫苗制品中时，可能提供广谱保护。RPCU考虑了与基因组核酸相互作用的病原体(诸如病毒)的内部蛋白表位(Pepin KM, J Domsic,禾口 R McKenna. 2008. Genomic evolution in a virus under specific selection for host recognition. Infection, genetics, and evolution.: 825-834)。RP⑶会影响诸如⑶V等RNA病毒的生物学功能。密码子(核苷酸的三联体)是最基础的生物学单位，因为它们编码氨基酸，所述氨基酸形成蛋白的功能单位，包括表位(例如约6-7个氨基酸)和抗原区或序列基序，它们直接地参与引起针对抗原蛋白(诸如CDV的 H蛋白)的宿主免疫应答。因而，基于RPCU来选择CDV分离株，会反映病毒的表型/功能， 诸如病毒的基因表达、H-蛋白表达和滴度。密码子选择也可以影响蛋白表达的宽度，并从而影响在其中表达病毒或蛋白的组织。在初步分析中，CDV的H蛋白表达的基于凝胶的PCR 分析证实，与大多数EW分离株相比，大多数美洲-2分离株具有一致地更低的(低约8-10 倍)H-基因PCR产物表达。该结果可能反映了大多数EW CDV分离株中稳健的且生物学上有利的H-基因密码子组成，这导致犬群体中更高的EW CDV分离株频率。在下面的实施例 4中，显示了该方法适用于⑶V RNA病毒。本领域技术人员会认识到，可以开发计算机执行的软件(电脑程序)来执行RPCU 方法。这样的软件包括或编码指令，所述指令造成计算机执行RPCU方法，且可以包括，例如，用于输入序列和其它有关数据(例如分离株的名称、密码子比对特征等)的装置、用于显示输入的数据的装置、用于表示分析结果的装置(例如显示在屏幕上，或以合适的形式输出[“硬拷贝”]结果，例如作为序列、作为一种或多种数字指示器(诸如“序列#4”或 “#4”作为最好的结果)，以图形形式、表格形式等)。在计算机程序中也可以包含用于统计分析的工具，且所述分析可以提供结果的分级，即该程序可以以从可能最合适的那些至最低可能的那些的方式排列候选序列，和/或可以简单地提供一个或多个最高排序(最合适的)序列。计算机程序可以包括指令，所述指令用于实现执行分析所用的算法。RPFU方法因而是选择和/或得到用于免疫原性组合物和疫苗中的病原体分离株的方法。可以选择或以其它方式得到(例如，通过标准的基因工程技术进行修饰)这样的分离株，其具有编码目标蛋白、多肽或肽(通常是免疫原)的优选密码子。RPFU方法可以包括下述步骤从来自被病原体感染的多个不同动物的生物样品， 得到多个病原体(例如RNA病毒)分离株；选择与所述RNA病毒有关的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽；针对多个分离株中的每个分离株，测定编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列；在编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的每个核苷酸序列中，鉴别编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中的目标氨基酸残基的密码子；通过对比编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，测定目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每个目标氨基酸残基的密码子选择数据的频率；从所述的密码子选择数据的频率，鉴别出目标免疫原性的蛋白、 多肽或肽中每个目标氨基酸残基的最常用的密码子；并从多个病原体分离株中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的分离株。在有些RNA病毒中，通过 RPCU软件，可以分析免疫原的拟-群体。图35显示了分离株的遗传亲缘关系的系统树，它基于H基因的序列。在该树中， 非常密切相关的CDV分离株群体已经出现，即属于欧洲野生谱系的“优势CDV群体”。通过用2个其它谱系(北极和美洲，即“次要CDV群体”)的其它次要的CDV病毒进行挑战，可以检查这些欧洲野生病毒。保护性地抗欧洲-野生以及北极和美洲-2谱系病毒中的一种或另一种(或两种)的一种或多种广泛反应性的优势分离株可以用于制备CDV免疫原性组合物，用作对目前在美国或其它合适的地方循环的所有CDV谱系有效的疫苗。换而言之，所述免疫原性组合物应当引起针对欧洲野生谱系病毒和针对北极和美洲-2谱系病毒中的一种或两种的免疫反应(例如抗体生产)。本发明的疫苗应当保护性地抗欧洲野生谱系病毒、 和抗北极和美洲-2谱系病毒中的一种或两种。在这样的免疫原性组合物或疫苗中使用的 CDV含有核酸序列，所述核酸序列编码以前仅在欧洲野生病毒中发现且认为是其特有的抗原(抗原区、抗原决定簇等)，以及以前仅在北极或美洲谱系病毒(或优选地，北极和美洲-2 谱系病毒)中发现且认为是其特有的抗原。这样的病毒的一个实例是分离株09041474B，其完整血凝素基因序列如SEQ ID NO: 42所述。使用几个标准来选择该CDV分离株作为疫苗候选物。首先，形成一组当前的 ⑶V分离株(在历史上，基于公开的报道，仅可以得到几个分离株。此外，研究⑶V疫苗接种失败问题的报道很少)。其次，进行血凝素测序和⑶V基因分型。使用BALSTn、CLUSTAL-W 的全核苷酸分析和系统发生分析允许对谱系中的CDV分离株进行聚簇和表征，并确定 09041474B属于EW谱系。然后，根据上述的相对优选的密码子选择(RP⑶)分析方法，使用密码子选择表(显示在图34A-F中)来选择⑶V疫苗分离株09041474B。来自分离株09041474B的H基因序列(完整序列，图37)在几个方面不同于参照 EW序列(图34A-F中的AY964110)。首先，使用组织样品，得到AY964110的H基因的核苷酸序列，即未分离具有该序列的CDV病毒。相反，从已经在细胞培养物中培养和繁殖的分离的 ⑶V，得到来自本文所述的09041474B的H基因序列。2个序列的密码子选择也不同。对于 09041474B,在位置187处的密码子是CGA，在位置201处的密码子是CTG，在位置236处的密码子是CCT，在位置303处的密码子是TCA。进一步与AY964110相比较，在09041474B序列中，在位置303处的密码子编码丝氨酸，而不是亮氨酸(参见图34A-F)。分离株09041474B 在细胞培养物中表现出稳健生长，且在施用具有该序列的病毒体的对象中引起免疫应答方面，在位置303处的丝氨酸可能赋予优点。标记为09041474B⑶V-EW的09041474B⑶V分离株的保藏物(完整的活病毒，在2-3的低传代)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)， Manassas, VA，保藏号为PTA-10596，保藏日期为2010年1月21日。第二种目标⑶V分离株 08021509 (美洲-2，标记为 08021509 CDV-AM-2)也保藏在 ATCC，保藏号为 PTA-10597， 保藏日期为2010年1月21日。两种保藏物都是完整病毒。本发明包括病毒，其具有保藏的分离株的特征，例如本文公开的核苷酸序列；毒力和繁殖性质；合胞体性质(例如大小、 形状、数目、外观([例如边界清楚的、模糊的等)、合胞体中核的数目等；以及其它。在本发明的有些实施方案中，采用多价的CDV免疫原性组合物和/或疫苗(例如欧洲野生和美洲-2)。这2个⑶V谱系可以组合在单个制品中，或作为2个单独的剂量单独施用，例如，如果它们干扰CDV免疫的诱导。本发明提供了本文公开的所有分离株，以及从所述分离株和/或从本文所述的分离株的抗原部分(例如包含在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所述的核苷酸序列的核酸和/或由它们编码的蛋白、多肽或肽)制备的疫苗和免疫原性组合物。本发明的疫苗可以以任何合适的方式配制，包括但不限于使用完整病毒(例如杀死的或减毒的，如下面详细描述的)。 在该实施方案中，本文公开的任一种新颖的CD病毒可以用于制备疫苗。通常，可以如下鉴别这样的病毒从具有CDV感染征状的狗(特别是以前已经接种CDV疫苗的狗)的组织样品中分离出病毒，对病毒基因组测序，并与已知序列进行对比(即与本发明之前分离的CDV、 特别是目前在疫苗中使用的CDV分离株进行对比)。具体地，这样的新的病毒分离株可以具有H基因序列，该序列含有与分离株09041474B (—种示例性的分离株)相同或同源的区域。通常，这样的病毒具有这样的H基因(或其一部分)，其与本文公开的核酸序列或其互补体具有至少约75%、优选约80%、更优选约85%、最优选约90%或甚至95、96、97、98、99 或100%同源性(和/或同一性)。在本发明的一个具体实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 42 (即，分离株09041474B的序列)具有大于99%同源性(和/或同一性)。在一个有关的实施方案中，所述CDV分离株包含这样的 H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 42 ( S卩，分离株09041474B的序列)具有大于99. 5% 同源性(和/或同一性)。在另一个实施方案中，所述⑶V分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 43 (即，分离株08021509的序列)具有大于95%同源性(和/或同一性)。在一个有关的实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 43 (即，分离株08021509的序列)具有大于99%同源性(和/或同一性)。或者，这样的病毒可以编码H蛋白，该H蛋白含有与本文公开的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少约75%、优选约80%、更优选约85%、最优选约90%或甚至95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列。本领域技术人员熟知计算％同源性或％同一性的方法。这样的变体病毒可以具有编码与本文公开的那些不同的序列的H基因，所述不同是因为分离株中的天然变化，或由于故意引入(例如通过基因工程技术)的变化。换而言之，所述病毒可以是重组的。在其它实施方案中，仅本文所述病毒的抗原部分存在于本发明的免疫原性的或疫苗组合物中。使用例如在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所示的编码抗原性肽或蛋白的核酸，或来自那些序列的肽或蛋白的抗原性表位或区域，可以配制这样的组合物。例如，本发明的疫苗制品可以包含含有本文所述序列或其互补体的核酸序列和/或由这样的序列编码的蛋白、多肽或肽。另外，也包括具有这样的序列的某些变化的疫苗。尽管所述序列代表 cDNA，本发明也包括对应的ssRNA、ssDNA、双链(ds) DNA、dsRNA、互补的DNA和任意形式的 RNA (例如mRNA、RNA/DNA杂合体等)，其基于或源自这些序列或与这些序列互补。这样的序列可以是有义或反义序列。此外，也预见到与本文公开的CDV的核酸序列表现出至少约 90%同源性或甚至约95、96、97、98或99%或更大同源性的序列用于疫苗中。这样的序列的差别可以是例如，在一个或多个位置处含有编码相同氨基酸的替代密码子，以便使表达最大化。另外，也预见到这些序列的编码例如H蛋白的表位或抗原区的部分，以及与这样的氨基酸序列表现出70%或甚至更优选约80、90或95%或甚至更大同一性(例如96、97、98或 99%同一性)的序列。通常，约6-8个氨基酸构成表位。这样的序列的差别可以是例如， 含有保守的或非保守的氨基酸置换或删除(尤其是氨基或羧基端删除)、或各种插入等，只要得到的蛋白/肽具有本文所述的抗原性。这样的抗原区的长度优选是至少约10个氨基酸，但是可以更长，例如包括整个蛋白诸如H蛋白。此外，也预见到在严谨条件(尤其是高严谨性条件)下与本文公开的序列(或那些序列的一部分)杂交的核酸序列。严谨条件是指允许核酸序列与特定序列杂交的杂交条件。一般而言，高严谨条件是指这样的杂交条件在约65°C、在包含约1 M盐(优选6 χ SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其它溶液中，允许至少50个核苷酸和优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列与特定序列杂交，并在65°C、在包含约1 M盐或更低(优选0.2 χ SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其它溶液中洗涤。这些条件允许检测具有约90% 或更高序列同一性的序列。本发明包括的核酸，例如具有在SEQ ID NO: 1_33和42_43中所述的核苷酸序列 (和本文所述的它们的变体)的那些，可以以不同的方式得到。例如，可以从天然来源诸如从病毒分离株得到它们；或者，可以合成地生产它们。本领域技术人员会理解，本领域存在合成地生产非常大的序列(例如整个病毒或细菌基因组(例如支原体属))的能力，本发明包括包含本文公开的序列的任意起源或产品的序列、以及从所述序列表达的蛋白、多肽和/ 或肽。本发明也提供了重组构建体诸如重组病毒、载体和表达载体，它们表达本文所述的蛋白/多肽/肽(即由SEQ ID NO: 1-33和42-43所述的核酸序列编码的氨基酸序列， 或其变体)。这样的构建体包括已经如下生产的那些例如，通过将一种或多种本文公开的序列克隆进载体或宿主(例如质粒、粘粒、诸如腺病毒和痘病毒载体等病毒载体、或细菌载体等)中。在一个实施方案中，所述构建体是包括以前指出的核酸和/或其片段的表达载体。在本发明中使用的重组表达载体通常是自主复制的DNA或RNA构建体，其包含编码本发明的⑶V血凝素和/或其抗原性片段的核酸，其通常可操作地连接到能够调节所述核酸在适合的宿主细胞中的表达的合适的遗传控制元件上。遗传控制元件可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，且通常包括转录启动子、任选的控制转录开始的操纵基因、用于升高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合部位的序列、和终止转录和翻译的序列。表达载体也可以含有允许载体独立于宿主细胞地复制的复制起点。通过本领域技术人员已知的几种方法中的任一种，可以构建重组表达载体。例如，已知可以取出目标序列(例如从起始分离株诸如病毒中)并连接进合适的表达载体中的基因工程技术。或者，可以合成地制备表达载体的一部分或整个表达载体；或可以采用连接和合成方法的组
I=I ο另外，可以在本文所述的构建体中包含其它有用的元件。例如，所述构建体可以编码各种序列，诸如组氨酸标签或用于促进蛋白分离的其它标签，诸如谷胱甘肽-S移换酶 (GST)，和麦芽糖结合蛋白；各种接头或间隔物序列；各种佐剂和增加蛋白的抗原性的序列 (例如半抗原)；引入希望的/方便的限制性酶切割位点或编码希望的蛋白酶切割位点的序列；编码荧光的或其它可检测的标记的序列，或标志或标记序列(例如绿荧光蛋白(GFP)或其部分)；指导编码的蛋白的定位、输出或加工的各种序列(例如前导序列)；异源信号序列(即在自然界中通常与CDV H蛋白无关的信号序列)；等。本领域技术人员知晓其它可能性，且也意图包括在本发明中。当在构建体中包含这样的序列时，如果它们与本文所述的病毒序列似乎邻近的，可以将整个编码序列翻译成融合或嵌合蛋白/多肽/肽，且可以对翻译后修饰敏感或不敏感(取决于序列)。本发明也提供了本发明的表达的重组蛋白/多肽 /肽和它们的对应的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。在具体实施方案中，也分离了这样的重组蛋白/多肽/肽和它们的对应的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。另外，本发明提供了包含这样的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞任选地是原核生物或真核生物宿主细胞。通过常规方法，可以在原核或真核细胞中表达编码本发明的 ⑶V血凝素的核酸。本发明的疫苗和免疫原性组合物可以包含本文所述的序列的任一种来源，例如病毒分离株、减毒的病毒、重组构建体等。几种制备适用于针对CDV的疫苗接种的疫苗的方法是本领域已知的。参见，例如，Appel等人的美国专利4，193，990和4，193，991，Carmichael 等人的美国专利4，303，645，Wood等人的美国专利4，971，793 ；Valdes等人的美国专利 5，882，652，和Parrish等人的美国专利5，885，585和5，814，510，它们各自提供了合适的疫苗配制方案的变化。这些专利各自的完整内容通过引用并入本文。通常，为了生产疫苗， 采用含有本发明的遗传序列(天然地，或由于基因工程)的病毒或其它载体。这样的病毒载体的实例包括这样的病毒和病毒体(例如CDV)，其“被杀死”、灭活或以其它方式减毒，因而在与合适的生理载体一起施用它的动物中不会造成严重的疾病征状。通过使用化学试剂诸如福尔马林、二乙烯胺、β丙内酯，通过使用Y辐照或热，或通过本领域已知的其它方法， 可以灭活CDV病毒(使其不能复制)。可以如下实现减毒例如通过在合适的宿主细胞中重复传代病毒分离株，并随后分离得到的克隆分离株。在有些实施方案中，减毒的病毒保留在宿主内复制的能力，尽管这不是严格地必然的。优选地，给药不会引起疾病征状。但是， 本领域技术人员会认识到，许多有效的疫苗组合物在给药后会造成某种不适或相对次要的痛苦。但是，保护免于充分发展的疾病的益处远远超过该可能性。减毒的病毒可以是天然地含有本发明核酸序列的病毒(例如CDV)，或所述病毒可以是重组体，其中通过基因工程将所述核酸序列插入病毒中。在重组疫苗的情况下，可与将核酸序列掺入除了 CDV以外的病毒中，以形成异型重组疫苗。这样的病毒的实例包括、但不限于，各种疱疹病毒、腺病毒、 痘病毒、非病原性的“孤儿病毒”、肠病毒诸如肠道病毒和本领域众所周知的其它病毒。另夕卜，可以在细菌、酵母或寄生物重组系统中表达H基因。在一个优选的实施方案中，所述病毒是活的、减毒的(修饰的)高滴度CDV，且所述核酸是ssRNA。另外，也预见到其它形式的疫苗。例如，也预见到“空”病毒体颗粒疫苗(没有核酸)，以及包含抗原性病毒体或没有装配成壳体的其它CDV蛋白的疫苗。另外，本发明的疫苗可以是多价的，包括多种病毒。或者，通过重组技术，通过交换编码区(这是本领域技术人员已知的)，可以构建遗传地工程化成含有编码来自2种或更多种新颖CDV的蛋白的核酸的单个病毒。在本文所述的组合物中使用的CDV通常是减毒的且安全的，即当施用给合适的宿主动物时，不产生或产生极少的疾病征状。CDV疫苗应当不会在宿主的脑脊液中引起抗体生产。但是，减毒的CDV的施用仍然会导致针对CDV免疫原(诸如H蛋白)的免疫应答(例如保护性的免疫应答)。最常用的生产减毒的活病毒疫苗的方法是，在细胞培养物中连续传代病毒。例如，可以在原代犬细胞培养物中，或在不携带癌基因的犬细胞系中，传代病毒， 尽管也可以使用其它细胞系(例如鸡胚胎或成纤维细胞、VER0-SLAM细胞、婴仓鼠肾细胞系以及其它仓鼠细胞系(Sultan S, NT Lan, T Ueda, R Yamaguchi, K Maeda, and K Kai. 2009. Propagation of Asian isolates of canine distemper virus (CDV) in hamster cell lines. Acta Veterinaria Scandinavica 51:38 doi: 10.1186/1751-0147-51-38) 等)。通常，对于第一次传代，用选择的CDV接种物，感染细胞培养物。得到明显的病毒复制证据(例如，感染的细胞中病毒-诱导的细胞病变效应[CPE])以后，使用第一代的细胞培养培养基或感染的细胞或二者的等分试样来感染第二代细胞培养物。重复该过程，直到病毒基因组中的一种或多种突变造成足够的减毒，使得病毒可以安全地用作疫苗。传代次数可以稍微变化，例如使用至少约20次、通常约50次传代，但是可以使用多至例如150次传代。此时，病毒被充分地减毒(即，毒力或造成疾病的能力降低)至用于疫苗制剂中。通常通过将天然宿主暴露于逐渐更大的传代水平的病毒，以经验为主地确定减毒的程度。通过在逐渐降低的温育温度重复传代，使用或不使用诱变化学试剂，也可能减弱 ⑶V病毒。通常，在37°C繁殖⑶V病毒。但是，在连续降低的温育温度传代例如50次以后， 生成例如病毒的克隆株，其不再具有在核心体温(37°C)或以上复制的能力。这样的病毒保留在通常表现出更低温度的身体区域(例如鼻腔)中复制的能力，但是不会在核心体温复制。例如，在一个实施方案中，冷适应的温度CDV在约至约34°C的温度在组织培养细胞中繁殖，但是在非允许的约37°C的温度不繁殖(美国专利申请2006121521，Dowling和 Younger,其整个内容通过引用并入本文)。这些病毒因此可以非常安全地用于动物使用的 CDV疫苗中，所述动物包括野生和高度敏感的物种(诸如大型猫科动物、水貂和雪貂)。本领域技术人员众所周知其它合适的疫苗组分(例如药理学上可接受的载体)，以及用作疫苗的这样的组合物的制备。通常，这样的组合物被制备成液体溶液或悬浮液，但是也预见到固体形式例如片剂、丸剂、散剂等。也可以制备适合于在给药前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性成分可以与药学上可接受的、并与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油等或其组合。另外，组合物可以含有小量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂等。如果需要施用口服形式的组合物，可以加入各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何这样的附加成分，从而提供适合于给药形式的组合物。可翻译的核酸在制剂中的最终量可以变化。但是，一般而言，该量是约1_99%。所述组合物可以另外包含佐剂，所述佐剂的合适的实例包括、但不限于，Seppic, Quil A、铝胶(Alhydrogel)、水包油乳剂、磷酸铝、聚羧乙烯、Emulsigen等。通过本领域技术人员众所周知的许多合适的方式中的任一种，可以施用本发明的免疫原性的/疫苗制品，所述方式包括但不限于通过注射、口服、鼻内、气管内、摄入含有抗原的食品、通过肌肉内、皮下、静脉内、透皮和真皮内途径、滴眼剂或使用喷雾器或无针器械等。但是，在一个优选的实施方案中，所述给药模式是通过注射。另外，所述组合物可以单独施用，或与其它药剂或免疫原性组合物组合施用，例如作为多组分疫苗的一部分。具体地，所述免疫原性的CDV可以与下述物质相组合狂犬病病毒、伯氏疏螺旋体iBorrelia burgdorferi)、犬埃里希体(Mhrlichia ca/？众)、犬细小病毒、犬腺病毒、 犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬巴贝虫iMbesia can is )、嗜吞噬细胞无浆体Urmp Iasma /7A^"OC_FtoMi7i )、贾第虫属物种、利什曼原虫属物种、钩端螺旋体属物种或它们的任意组合等。此外，施用可以是单个事件，或可以不同的时间间隔施用多个加强剂量(属于相同或不同株)，以增加免疫应答。另外，施用可以是预防性的(即在已经暴露于病毒或疑似已经暴露之前，或在事实之后，即在已知的或疑似的暴露之后)或治疗性的(例如在发生与病毒感染有关的疾病征状以后)。本发明也提供了不同类型的重组载体和/或表达载体，其含有和表达本文公开的核酸序列(或其编码抗原性肽和/或多肽的部分)。这样的载体和表达系统的实例包括、但不限于各种细菌(例如埃希氏大肠杆菌(federidia coli))或基于益生菌的(例如乳杆菌属)表达载体；腺病毒载体、杆状病毒、毕赤酵母和其它酵母表达系统；痘载体诸如浣熊痘载体；等。这样的重组载体和表达系统也可以用于疫苗制品中。或者，它们可以用于其它目的，诸如用于所述序列的实验室操作，或用于研究或诊断目的。本发明提供了通过给对象施用本发明的组合物，在有此需要的对象(例如哺乳动物)中免疫或预防CDV感染征状的方法。通常，以足以在小狗和/或成年狗中提供主动免疫的量，施用所述CDV疫苗。优选地，所述免疫应答可以保护性地抗将来暴露于CDV，即与未接种疫苗的对照相比，所述组合物的施用会预防与CDV感染有关的疾病征状。但是，如果免疫应答简单地减轻或减少疾病征状的严重性，即使所有征状未消除，也可以获得更多益处。在本发明的一个优选实施方案中，使用本发明的疫苗接种的动物是驯养的狗，包括成年狗和小狗。但是，也预见到其它潜在⑶V宿主的疫苗接种。其它潜在宿主包括其它犬属诸如野生犬属(例如狼、野狗物种等)、更大的猫科动物物种(驯化的或野生的)、水貂、小熊猫、狐狸、狮子和虎、雪貂、兔、山羊等、以及其它一般的肉食动物。雪貂高度易感 CDV0因而，可以使用高度减毒的、修饰的活病毒疫苗或重组CDV疫苗。根据美洲雪貂协会 (American Ferret Association，MD)，可以将3种CDV疫苗施用给8、11和14周龄的健康雪貂。尽管所述疫苗当然地用于驯养的动物，野生的或部分地驯化的动物也可以从这样的疫苗接种获益，例如在动物园或保护区、公园、研究场所等中的动物。尤其可以用杀死的CDV疫苗接种野生动物，因为它们对修饰的活病毒疫苗更易感，例如通过使用含有疫苗组分的可食用诱饵。通过接种本文提供的疫苗制品，携带⑶V变体(无论所述病毒是否在宿主中造成疾病征状)的任意动物可以获益。给病毒感染后无征状的动物(即沉默载体)接种疫苗是有益的，以便减少病毒向更易感群体的传播。本发明也提供了抗体，其特异性地或选择性地结合本文公开的CDV的抗原性决定簇或抗原区。在有些实施方案中，所述抗体是中和抗体，其可以中和病毒并从而预防感染。 这样的有差别的抗体可以是多克隆的或单克隆的，尽管单克隆抗体通常是优选的。所述抗体可以属于犬起源。通过将病毒(例如杀死的病毒、蛋白或编码蛋白的核酸)注射进小鼠或另一种合适的宿主(诸如兔或犬宿主)中，可以制备单克隆抗体。在3次强化后，收获脾， 并与骨髓瘤细胞融合。通过ELISA、HA-HI和间接的荧光抗体实验，可以筛选生产单克隆抗体的克隆。保存与本文所述的病毒或与从所述病毒分离的蛋白反应的克隆，用于开发CDV 诊断试验。通过将一种或多种跨氨基酸密码子的肽(它们是优选的抗原靶标例如H蛋白)注射进兔子中，可以制备多克隆抗体。本发明也提供了用于检测本文所述的CDV变体的诊断方法和试剂盒。这样的试剂盒包括，例如，特异性地扩增(例如通过聚合酶链式反应，PCR)本文公开的核酸序列的寡核苷酸引物。或者，这样的试剂盒可以包括抗体(例如单克隆的或多克隆的)，所述抗体选择性地或特异性地结合所述新颖的CDV变体展示的独特抗原性决定簇。所述试剂盒可以用于监测⑶V状态，例如，易感⑶V的任意动物、尤其是犬的⑶V状态。所述试剂盒特别适用于监测从一个区域出口或运输到另一个区域的小狗和狗的CDV状态。在一个实施方案中，本发明的诊断测试和方法被用于检测CDV在已经充分接种疫苗、但是仍然已经发生CDV感染征状的狗(或其它动物)中的存在。使用本发明的方法，可能确定疾病的病原因子的基因型， 并确定疾病征状是由疫苗株造成的，还是由疫苗接种未中和的遗传变体的重复感染造成的 (即所述疫苗没有提供针对遗传变体的保护)。下面的实施例进一步例证了本发明，所述实施例不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例实施例1. 7种⑶V分离株的初步研究
犬瘟热病毒(CDV)是一种高度传染性的病毒，其造成狗的多系统疾病。接收了来自美国的狗中的7个⑶V病例。这些⑶V分离株在表达犬信号传递淋巴细胞-活化分子(SLAM) 的Vero细胞系中形成大的、多核的合胞体(下面描述)。基于血凝素基因序列，来自3个州 (CA、MO和0K)的⑶V分离株形成2个⑶V遗传组组I (主要的，6/7)由与⑶V的欧洲野生谱系密切相关的⑶V分离株组成。组II (次要的，1/7)在遗传上与⑶V的北极-样谱系有关。但是，两个⑶V组都在遗传上不同于目前的疫苗菌株，后者属于老的(1930-1950) ⑶V分离株的美洲-1谱系。在该研究中，使用H基因序列，进行来自美国的7种CDV分离株的进化和遗传分析。使用体外细胞培养系统，研究H基因序列变化的生物学效应。死前样品包括眼拭子、 鼻拭子和用EDTA抗凝的末梢血。将所述拭子接收进1-2 ml冷的生理盐水，在收集后M h 内，放在冰上过夜递送。未测试尿样。死后样品来自扁桃体、脑、膀胱和肺(Kubo，T., Y.Kagawaj H. Taniyamaj 禾口 A. Hasegawa. 2007. Distribution of inclusion bodies in tissues from 100 dogs infected with canine distemper virus. J. Vet. Med. Sci. 69:527-5 )。将大约2-5 g每个组织接收进试管中，放在冰上过夜递送，用于病毒学检测。 从来自美国3个州的7个CD疑似病例(俄克拉荷马，4个；密苏里州，1个；和加利福尼亚， 2个)，得到样本。为了直接的荧光抗体检测，以8-μπι厚度切割组织，并用丙酮(75%)-甲醇(25%) 混合物在室温固定。Veterinary Medical Research and Development(VMRD), Pullman, WA, USA供给预滴定的、批次之间检验过的缀合物，用于兽医诊断用途。作为质量控制/质量保证的一部分，在用于阴性和已知的阳性CDV对照之前，测试缀合物。加入现成即可使用的、预稀释的、荧光素异硫氰酸酯-标记的抗-CDV单克隆抗体(VMRD，Pullman, WA)或多克隆抗体缀合物(VMRD，Pullman, WA)以后，在37°C温育切片30 min。洗涤未结合的抗体缀合物以后，用伊文思蓝复染色切片15 min0在缓冲的甘油(pH 9.4)中固定化以后，通过荧光显微术，检查切片。阳性的细胞显示出在细胞质中的苹果绿荧光，阴性细胞是红棕色。为了分离，将来自CDV-感染的样品的组织剁碎，冻融两次，以释放病毒，并在 8,000 χ g离心。通过0.22 μ m注射过滤器，过滤澄清的上清液。Vero细胞系源自在日本的正常成年非洲绿猴(Cfer印iiAecm)的肾。如％1^等人以前所述(kki，F., N. 0no, R. Yamaguchi,禾口 Y. Yanagi. 2003. Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD 150) and their adaptability to marmoset B95a cells. J. Virol. 77:9943-9950)，通过用犬信号传递淋巴细胞活化分子(SLAM，也称作⑶150)转染Vero细胞，衍生出重组细胞系。在37°C， 温育接种物(约1 ml/25-cm2培养瓶)1 h，每20分钟进行摇动。在接种表达犬SLAM的重组Vero细胞系以后，加入含有5%胎牛血清的约3. 5 ml Dulbecco氏改良的伊格尔培养基 (Cellgro, Hendron, VA)。每天检查细胞的细胞病变效应(多核的-合胞体形成)(kki， 同上)。已经发现，表达犬SLAM的Vero细胞可以用于⑶V的初步分离(Lan，N. T., R. Yamaguchi, K. Uchida, S. Sugano,禾口S. Tateyama. 2005. Growth profiles of recent canine distemper isolates on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule (SLAM). J. Comp. Path. 133:77-81)。为了从样本提取总RNA (宿主和病毒RNA)，使用QIAmp病毒RNA提取试剂盒 (Qiagen Inc. , CA)。使用Nonodrop 分光光度计(Nanodrop Technologies, CA),通过Aa50/ A28tl,检查RNA的质量和数量。为了检测⑶V RNA，使用基于核衣壳(N)基因的逆转录酶(RT) -PCR (Kim, Y. H·, K. W. Cho, H. Y. Youn, H. S. Yoo,和 H. R. Han. 2001. Detection of canine distemper virus (CDV) through one step RT-PCR combined with nested PCR. J. Vet. Sci. 2:59-6；3)。该方法会提供高灵敏度，这是由于靶基因的嵌套扩增(nested amplificationXN基因的高拷贝数、和⑶V分离株中N-基因的保守序列。简而言之，使用正向引物(引物 1:5，-ATTTGGGATTGCTTAGGA-3，，SEQ ID N0: 34)和反向引物(引物 2: 5，-GGCGCTCATCTTGGACAT-3，，SEQ ID N0: ；35)，扩增第一轮产物。该方法是在 45°C反转录1小时、95°C 3 min ;30个在94°C变性30 S、在退火30 S、并在72°C延伸1 min的 PCR循环；最后在72°C延伸7 min，将反应混合物保持在4°C。对第一轮反应的小部分(1_微升)产物进行第二轮扩增，其中使用引物3 (5‘-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3‘, SEQ ID NO: 36) 和引物 4 ( 5，-GGTCCTCTGTTGTCTTGG-3，，SEQ ID NO: 37)。第二轮的方法是在 95°C变性3 min ;30个在94°C变性30 S、在退火30 S、并在72°C延伸1 min的循环。最后在 72°C延伸7 min，并在电泳之前，将反应混合物保持在4°C。第二轮扩增子的大小是419碱基对，这通过在琼脂糖凝胶分析中包含分子大小标准品来验证。为了 CDV基因分型，使用H基因作为靶标(Martelh，V. , G. Elia, M.S. Lucente, N. Decaro, Ε. Lorusso, K. Banyai, Μ. Blixenkrone-MolIer, N. Τ. Lan, R. Yamaguchi, F. Cirone, L. Ε. Carmichael,禾口 C. Buonavoglia. 2007. Canine distemper virus (CDV) by hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks. Vet. Microbiol. 122:32-42)。正向引物(引物 204+,核苷酸 388-409，5，-GAATTCGACTTCCGCGATCTCC-3，，SEQ ID NO: 38)和反向引物 (引物 232b-，核苷酸 1543-1519，5，-TAGGCAACACCACTAATTTRGACTC-3，，SEQ ID N0: 39) 产生1160碱基对的扩增子。H-基因RT-PCR方法是在50°C反转录30 min，并在94°C 2 min。PCR 方法是；35 个 94°C 1 min,50°C 1 min 和 72°C 3 min 的循环，最后在 72°C延伸 10 min，将反应混合物保持在4°C。在检测(N基因)和基因分型(H基因)RT-PCR方法的每个运行中，包含阳性和阴性CDV对照。对于H基因序列的系统发生分析，在俄克拉荷马州俄克拉荷马城的俄克拉荷马医学研究基金会(Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK)处，对扩增子测序。对序列进行核苷酸的基础局部比对搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool for Nucleotides (BLASTN))分析(Altschul, S. F. , Τ. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller,禾口D. J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nuc. Acid Res. 25:3389-3402)，并与来自全球不同物种和地理区域的CDV分离株的GenBank H基因序列相对比。记录H基因序列的同一性百分比。此外，对H基因序列进行系统发生分析，并与保藏在GenBank中的疫苗CDV分离株(Onderst印ort、Convac, Lederle和Snyder Hill CDV分离株)的H基因序列进行序列对比。与已知序列的前100 个匹配比对被用于进行系统发生分析，其中使用Jukes-Cantor方法(NCBI，MD)进行邻域连接。使用水性Romanowsky染色，对来自2个CD病例样品(0ADDL 07091030和OADDL 07091031)的末梢血膜进行染色，并通过光学显微术进行检查。两种血膜都揭示在嗜中性粒细胞和淋巴细胞的细胞质内的众多嗜酸性粒细胞性结构，与CDV包涵体相一致(图36)。 通过在两个病例中直接的荧光-抗体检验，证实CDV包涵体的存在。在含有犬SLAM/⑶150的Vero细胞系中，成功地分离出了 7个⑶V阳性样品中的 6个。CDV分离株的细胞病变效应的特征在于，在接种后1-2天形成的多核合胞体。通过血凝素基因的RT-PCR，进一步检测⑶V的存在。1个⑶V样品(0ADDL 07061535)仅通过H基因的RT-PCR和测序进行检验；没有足够的样品用于病毒分离。基于H基因的RT-PCR和随后的测序，在CDV分离株(0K-1、0K-2、0K-3、0K-4、CA_1 和CA-2 ；主要组I)中，与来自密苏里州的犬⑶V分离株19876的同一性水平最高，所述犬 CDV分离株19876与丹麦貂CDV分离株在遗传上最相关(Pardo，I. D. R.，G. C. Johnson, 禾口 S. B. Kleiboeker. 2005. Phylogenetic characterization of canine distemperviruses detected in naturally infected dogs in North America. J. Clin. Microbiol. 43:5009-5017)。因而，它是该研究中的主要CDV变体(7个分离株中的6个)。 这6个⑶V分离株属于⑶V分离株的欧洲野生谱系。但是，发现1个分离株(M0-1 ；次要组 II)在遗传上与来自密苏里州的犬⑶V分离株21沈0最类似(Pardo，同上)，后者与小熊猫CDV分离株密切相关。该CDV分离株属于CDV分离株的北极-样谱系。在表1中总结了关于2007 OADDL⑶V分离株的信息，在图1_7中提供了这些分离株的H基因的部分核苷酸序列。表1. OADDL犬瘟热病毒(⑶V)分离株
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1I -不完全疫苗接种；NV =未接种疫苗；V =接种疫苗
2所有分离株与当前的疫苗分离株(Onderst印ort、Lederle和Convac)具有小于90% 同一性
3所有分离株与美国MO 19876 CDV分离株具有小于90%同一性，但是MO-I除外，其属于北极谱系
4在支持疗法后，动物完全恢复 5Eff =欧洲野生；A =北极 6nd =没有进行。CDV分离株中的血凝素糖蛋白相差大约10%，包膜蛋白H决定了病毒的细胞病理学禾口趋性(von Messling, V. G. Zimmer, G. Herrler, L. Haas,禾口R. Cattaneo. 2001)。 在初步分析中，将OADDL⑶V分离株与GenBank中的所有H序列相对比，发现⑶V分离株簇集在地理上不同的谱系中。例如，所有阿根廷⑶V分离株形成一个独特簇。基于地理学和H基因种系发生，南美洲⑶V分离株未被包含在最近的⑶V分离株分析中(McCarthy， 同上)。但是，它们形成一个独特的南美洲簇。在最近的文章中，术语基因型、簇和谱系已经被不同的研究人员互换使用，但是关于CDV种系发生的结果在所有研究中是类似的(Martella，V.，F. Cironej G. Eliaj E. Lorussoj N. Decaroj M. Campoloj C. Desarioj M. S. Lucentej A. L Bellaciccoj M. Blixenkrone-Mollerj L E. Carmichaelj 禾口C. Buonavoglia. 2006. Heterogeneity within the hemagglutinin genes of canine distemper virus (CDV) strains in Italy. Vet. Microbiol. 116:301-309; McCarthy, supra； Mochizuki. M.，Μ. Hashimoto, S. Hagiwaraj Y. Yoshidaj 禾口 S. Ishiguro.1999. Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan. J. Clin. Microbiol. 37:29364942)，包括本分析，因为所有研究人员使用GenBank登记序列。已经提出，⑶V 的特定基因型的一个成员在H基因序列的核苷酸中具有超过95%同一性(Mochizuki，同上)，且因而，基因型内变化小于5% (Martella,同上)。从来自俄克拉荷马的3-月龄雌性混合品种接种疫苗的狗得到CDV分离株OK-I (0ADDL 07061535)，所述狗具有结膜炎史、鼻涕和体重减轻。所述狗尚未完成疫苗接种的完整过程，且具有漫游和咬食垃圾史。该⑶V分离株与⑶V分离株19876 (GenBank登录号 AY964110. 1)具有最大同一性(98%)。基于H基因分析，⑶V分离株19876与0K-1 —起属于CDV分离株的欧洲野生谱系。从来自俄克拉荷马的11-月龄未接种疫苗的西伯利亚雪撬犬的组织库，得到CDV 分离株0K-2 (0ADDL 07091030)。在尸检后，结膜和气管上皮含有胞质内的、嗜酸性包涵体，其被透明的晕圈包围。在扁桃体中，存在显著的淋巴消耗和许多在上皮中的包涵体。该分离株与CDV分离株19876 (犬起源，密苏里州)具有最大同一性(98%)，与来自匈牙利(GenBank 登录号 EF095750. 1)、丹麦貂 C47759. 1)和小熊猫(AF178039. 1)的 CDV 分离株、CDV株A75/17 (AF164967. 1)和来自德国雪貂分离株的麻疹病毒(X84999. 1) 具有94%同一性。来自美国的CDV分离株A75/17被视作野外CDV分离株的毒力原型 (Simon-Martinez,同上)。H基因与疫苗分离株(Convac、Lederle 禾口 Ondersteport)的同一性水平是89%。从在俄克拉荷马庇护所中的狗，得到⑶V分离株0K-3 (0ADDL 07091031)。得到血液管(blood tube)，但是不可得到该病例的其它历史。在末梢血膜上的白细胞中，观察到与 ⑶V —致的包涵体，并通过直接荧光-抗体检验来进一步证实。通过病毒分离，血样是⑶V 阳性的。对H基因测序，且与⑶V犬分离株19876 (GenBank登录号AY964110. 1)具有99% 同一性，与来自匈牙利(EF095750. 1)、丹麦貂(Z47759. 1)和小熊猫(AF178039. 1)的CDV 分离株、⑶V病毒株A75/17、⑶V分离株0H641和德国雪貂麻疹病毒株(X84999. 1)具有 95%同一性。从来自俄克拉荷马动物庇护所收养的狗的组织库(膀胱和肺)，得到CDV分离株OK-4 (0ADDL 07091032)。该CDV分离株与CDV分离株19876 (GenBank登录号 AY964110. 1)具有最大同一性(96%)。以递减次序，它与来自匈牙利(EF095750. 1)、小熊猫 (AF178039. 1)和丹麦貂(Z47759. 1)的⑶V分离株具有93%同一性；与疫苗分离株具有84%
同一性；与海豹瘟热病毒具有70%同一性。从死于CD的来自加利福尼亚的10-周龄雄性接种疫苗的美洲牛头犬的组织库，得到⑶V分离株CA-I (0ADDL 07101508)。4个同胞仔中的3个死于⑶，具有呼吸道征象、角化过度和癫痫发作。在3个死亡的同胞仔中，可以得到1个同胞仔的尸检报告。尸检时，它的肺是坚硬且充血的。4个同胞仔之一的尸检结果是完全正常的。H基因序列与犬起源CDV 分离株19876 (GenBank登录号AY964110. 1)具有98%同一性。所述⑶V分离株与匈牙利 CDV分离株、小熊猫分离株(AF178039. 1)和CDV株A75/17 (AF164967)具有94%同一性。 CDV H基因序列与CDV分离株01-2641 (AY526496. 1)具有93%同一性。该CDV分离株的H 基因缺少在所有疫苗CDV分离株中存在的I3St I位点(Demeter，Ζ.，B. Lakatos, Ε. Α.Paladej Τ. Kozmaj P. Forgachj 禾口Μ· Rusvai. 2007. Genetic diversity of Hungarian canine distemper virus strains. Vet. Microbiol. 122:258-269)。从具有与CD —致的临床征象的CDV疫苗接种的10-周龄德国魏犬的鼻和结膜拭子，得到⑶V分离株MO-I (0ADDL 07110098)。所述狗发生‘口香糖，癫痫发作、增厚的脚垫、咳嗽、鼻涕和充血的肺。在安乐死之前收集拭子，并在细胞培养物中分离CDV。CDV分离株H基因与来自密苏里州的CDV分离株2U61和18133具有最大同一性(98%)，与来自意大利(48/05 和 179/94)和匈牙利(H06Bpl0S、H06Bp8F、H05Bp7F、H05Bp6F 和 H05BpBp5F)的 CDV分离株具有97%同一性。该CDV分离株的H基因序列与来自格陵兰狗的CDV分离株具有95%同一性，与⑶V 19876仅具有90%同一性。它与疫苗⑶V分离株具有89%同一性，与海豹瘟热病毒H基因具有70%同一性。此外，该CDV分离株缺少在所有疫苗CDV分离株中存在的I^st I限制位点(Demeter，同上)。基于系统发生分析，该分离株属于⑶V分离株的北极-样谱系。从具有呕吐、腹泻和淋巴细胞减少史的32-月龄的阉割的雄性的接种疫苗的边界柯利犬的鼻、咽、扁桃体和结膜拭子的组合，得到⑶V分离株CA-2 (0ADDL 07111080)。H 基因序列与CDV分离株19876具有最大同一性(96%)。该分离株与匈牙利CDV分离株、小熊猫⑶V分离株和丹麦貂⑶V分离株具有93%同一性；与⑶V株A75/17 (GenBank登录号 AF164967. 1)具有92%同一性；与德国雪貂⑶V分离株具有92%同一性。基于系统发生分析，该CDV分离株与欧洲野生谱系的CDV分离株聚簇。该狗在治疗后恢复，且已经在最后的 3个月中在临床上是健康的。在天然暴露于欧洲野生谱系的CDV分离株以后，该狗的存活可能是由于基于年龄的抗性、遗传抗性和用商业的CDV疫苗完整接种以后的免疫。在从CDV 感染恢复后3个月，通过⑶V血清中和，该狗具有1 16的⑶V滴度。发现6种OADDL 2007⑶V分离株中的5种会在表达犬SLAM受体的Vero细胞系中生成多核的合胞体。已经提出，合胞体大小与⑶V分离株的毒力程度有关(Cosby，S. L.， C. Lyons, S. P. Fitzgerald, S. J. Martin, S. Pressdee, I. V. Allen. 1981. J. Gen. Virol. 52:345-353)，因为它与⑶V在细胞之间传播的能力有关。在细胞培养物中的侵入性传播、在天然地表达SLAM/⑶150的犬淋巴细胞中生成大量包涵体的能力、和在接种疫苗的狗中造成致命感染的能力指示，欧洲野生谱系的这些犬分离株对狗是有毒力的。该实施例表明，EW谱系正在作为美国的优势CDV分离株而出现。实施例2.其它的⑶V分离株
使用在实施例1中所述的方法，鉴别出其它的CDV分离株，并列出在表2中。表2. OADDL犬瘟热病毒(⑶V)分离株
权利要求
1.一种分离的欧洲野生(EW)谱系的犬瘟热病毒(⑶V)，其包含⑶V 9041474B⑶V-EW (ATCC保藏号PTA-10596)的特征。
2.—种CDV减毒株，其从如权利要求1所述的CDV株或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出。
3.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求1所述的分离的CDV或其后代。
4.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤给所述对象施用如权利要求3所述的免疫原性组合物。
5.一种诊断试剂盒，其包含特异性地用于扩增在SEQ ID NO: 42中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
6.一种编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。
7.如权利要求6所述的分离的核酸分子，其包含SEQID NO: 42的核苷酸序列或其互补体。
8.—种表达载体，其包含如权利要求6所述的分离的核酸分子。
9.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求8所述的表达载体。
10.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列。
11.一种欧洲野生(EW)谱系的分离的犬瘟热病毒(⑶V)，其编码包含SEQ ID NO: 44 的氨基酸序列的多肽。
12.—种美洲-2 (AM-2)谱系的分离的犬瘟热病毒(⑶V)，其具有⑶V 08021509 CDV-AM-2 (ATCC 保藏号 PTA-10597)的特征。
13.—种CDV减毒株，其从如权利要求12所述的CDV株或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出。
14.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求12所述的分离的CDV或其后代。
15.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤给所述对象施用如权利要求14所述的免疫原性组合物。
16.一种诊断试剂盒，其包含特异性地用于扩增在SEQ ID N0: 43中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
17.—种编码SEQ ID N0: 45的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。
18.如权利要求17所述的分离的核酸分子，其包含SEQID N0: 43的核苷酸序列或其互补体。
19.一种表达载体，其包含如权利要求17所述的分离的核酸分子。
20.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求19所述的表达载体。
21.一种分离的多肽，其包含SEQ ID N0: 45的氨基酸序列。
22.—种欧洲野生(EW)谱系的分离的犬瘟热病毒(⑶V)，其编码包含SEQ ID N0: 45 的氨基酸序列的多肽。
23.一种免疫原性组合物，其包含编码血凝素蛋白的⑶V病毒体，所述⑶V病毒体包含核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一个或多个核苷酸序列。
24.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤给所述对象施用组合物，所述组合物包含编码血凝素蛋白的⑶V病毒体，所述⑶V病毒体包含核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一个或多个核苷酸序列。
25.一种选择用于免疫原性组合物中的病原体分离株的方法，其中所述分离株使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽，所述方法包括下述步骤对于多种病原体分离株中的每种分离株，测定编码所述选择的目标免疫原性的蛋白、 多肽或肽的核苷酸序列；对于在所述测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；从所述密码子选择频率数据，鉴别出所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个所述目标氨基酸残基的最常用的密码子；和从所述多种病原体分离株中，选择使用一种或多种所述最常用的密码子来编码所述目标蛋白、多肽或肽的分离株。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述病原体是犬瘟热病毒。
全文摘要
提供了免疫原性组合物和广谱疫苗，其含有从地理区域收集的犬瘟热病毒(CDV)的新鉴别出的分离物。所述新鉴别出的分离株表现出欧洲野生谱系CDV以及北极和美洲-2谱系CDV之一或二者的性质。因此，所述疫苗可以广泛地保护免于欧洲野生谱系CDV以及北极谱系CDV或美洲-2谱系CDV、或北极和美洲-2谱系CDV二者的感染。
文档编号C12N7/00GK102459578SQ201080014578
公开日2012年5月16日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月30日
发明者卡皮尔 S. 申请人:俄克拉荷马州大学评议会