专利名称：龙涎呋喃的生物催化产生的制作方法
龙涎呋喃的生物催化产生本发明涉及生物催化产生龙涎呋喃(ambroxan)的方法。具有十二氢萘并[2，Ι-b]呋喃骨架的化合物作为芳香化合物具有极大的经济重要性。其中应当提及的是化合物2，称为龙涎呋喃的左旋立体异构体[(-)-2]的(3aR，feS， 9aS，9bR) -3a，6，6，9a-四甲基十二氢-萘并-[2，l_b]-呋喃。龙涎呋喃原本获自抹香鲸的龙涎香，目前，主要通过两种途径获得龙涎呋喃。通常将硬尾醇(3)(香紫苏(硬膜鼠尾草(Salvia sclarea)的组成物)用作为半合成材料的原材料，因为其已经包含了化合物((-)- 的光学信息。在此，使用铬酸、高锰酸盐、H2O2或臭氧可以实施氧化降解[Stoll等人；Helv. Chim. Acta(1950), 33 :1251]。随后将得到的香紫苏内酯(4)(例如用LiAlH4或NaBH4)还原，以产生降龙涎香醚-1,4- 二醇(5) [Mookherjee 等人；Perfumer and Flavourist (1990), 15 :27]。通过使用 Hyphozyma roseoniger 的生物转化也可以从硬尾醇(3)中制备化合物(4) [EP 204009]。
权利要求
1.用于产生通式O)的龙涎呋喃衍生物，优选龙涎呋喃的方法，其中通过作为酶的具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的多肽，生物催化地反应通式(1)的高法呢醇衍生物，以得到相应的龙涎呋喃衍生物
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是由包含至少一种核酸分子的核酸分子编码的多肽，所述至少一种核酸分子选自a)编码包含SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的多肽的核酸分子；b)包含SEQID NO 1中显示序列的至少一种多核苷酸的核酸分子；c)编码序列与序列SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%同一性的多肽的核酸分子；d)根据(a)项至(c)项的核酸分子，其编码根据SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的序列的功能上等同的多肽或片段；e)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其通过使用根据序列号3和4的引物扩增来自cDNA文库或者来自基因组文库的核酸分子得到；f)核酸分子，其编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽，可以在严格条件下与根据(a)项至(c)项的核酸分子杂交；g)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其可以在严格杂交条件下，通过探针使用根据(a)项至(c)项的核酸分子或者其至少15nt，优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的部分片段，从DNA文库分离；h)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽的序列与序列SEQ ID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%的同一性;i)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码，并且已经分离，或者可以通过单克隆抗体分离；j)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽具有与由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码的多肽相似的或类似的结合位点。
3.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述酶以选自如下的形式存在a)具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的游离的，任选纯化的或部分纯化的多肽；b)具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的固定化的多肽；c)分离自细胞的根据a)项或b)项的多肽；d)完整细胞，任选休眠的或破裂的细胞，其包含具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的至少一种多肽；e)d)项描述的细胞的细胞裂解物或细胞勻浆。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞是微生物，优选地转基因微生物，其表达至少一种异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的多肽。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中用于产生龙涎呋喃的所述原材料是柠檬醛，所述柠檬醛在多个步骤中反应以产生高法呢醇。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在单相水系统中或者在双相系统中产生龙涎呋喃。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中分批地、补料分批地或者连续地产生龙涎呋喃。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在0至45°C(60°C )的温度和/或在4 至8的pH发生高法呢醇生成龙涎呋喃的所述反应。
9.根据前述权利要求之一所述的方法，其中高法呢醇-龙涎呋喃环化酶来自过表达高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的微生物，所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、罗尔其Jf 通菌属(Ralstonia)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(I^seudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红细菌属 (Rhodobacter)、链霉菌属(Str印tomyces)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、乳杆菌属 (Lactobacillus)禾口乳球菌属(Lactococcus)的细菌。
10.根据前述权利要求之一所述的方法，其中高法呢醇-龙涎呋喃环化酶分离自微生物，所述微生物选自Methylococcus capsalatus、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、弗兰克氏菌属(Frankia spec·)、、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) >Rhodopseudomonas palent、棺木弗兰克氏菌(Frankia alni)、炭疽芽抱杆菌 (Bacillus anthracis)、Burkholderia ambifaria，特别地运动发酵单胞菌和大豆根瘤杆菌。
11.根据前述权利要求之一所述的方法，其中高法呢醇-龙涎呋喃环化酶分离自大肠杆菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、Burkholderia glumae、浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)禾口 Methylococcus capsalatus、沼泽红假单胞菌、弗兰克氏菌属(Frankia spec. )、Rhodopseudomonas palent、棺木弗兰克氏菌(Frankia alni)、炭疽芽孢杆菌、Burkholderia ambifaria,特另Ij 地运动发酵单胞菌和大豆根瘤杆菌(Zymomonas mobilis)物种的过表达高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的转基因细菌。
12.具有高法呢醇龙涎呋喃环化酶活性的多肽的用途，用于生物催化高法呢醇反应以得到龙涎呋喃。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述多肽由包含至少一种核酸分子的核酸分子编码，所述至少一种核酸分子选自a)编码包含SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的多肽的核酸分子；b)包含SEQID NO 1中显示序列的至少一种多核苷酸的核酸分子；c)编码序列与序列SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%同一性的多肽的核酸分子；d)根据(a)项至(c)项的核酸分子，其编码根据SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的序列的功能上等同的多肽或片段；e)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其通过使用根据序列号3和4的引物扩增来自cDNA文库或者来自基因组DNA的核酸分子得到， 或者通过从头基因合成制备；f)核酸分子，其编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽，可以在严格条件下与根据(a)项至(c)项的核酸分子杂交；g)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其可以在严格杂交条件下，通过探针使用根据(a)项至(c)项的核酸分子或者其至少15nt，优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的部分片段，从DNA文库分离；h)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽的序列与序列SEQ ID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%的同一性;i)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码，并且已经分离，或者可以通过单克隆抗体分离；j)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽具有与由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码的多肽相似的或类似的结合位点。
14.基因构建体或载体，其包含编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的多肽的核酸分子，优选地包含至少一种核酸分子的核酸分子，所述至少一种核酸分子选自a)编码包含SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的多肽的核酸分子；b)包含SEQID NO 1中显示序列的至少一种多核苷酸的核酸分子；c)编码序列与序列SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%同一性的多肽的核酸分子；d)根据(a)项至(c)项的核酸分子，其编码根据SEQID NO 2、5、6、7、8、9、10或11的序列的功能上等同的多肽或片段；e)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其通过使用根据序列号3和4的引物扩增来自cDNA文库或者来自基因组DNA的核酸分子得到， 或者通过从头基因合成制备；f)核酸分子，其编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽，可以在严格条件下与根据(a)项至(c)项的核酸分子杂交；g)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其可以在严格杂交条件下，通过探针使用根据(a)项至(c)项的核酸分子或者其至少15nt，优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的部分片段，从DNA文库分离；h)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽的序列与序列SEQ ID NO 2、5、6、7、8、9、10或11具有至少46%的同一性;i)编码具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码，并且已经分离，或者可以通过单克隆抗体分离；j)编码具有高法呢醇—龙涎呋喃环化酶的活性的功能上等同的多肽的核酸分子，其中该多肽具有与由选自a)项至h)项中所述的那些核酸分子的核酸分子编码的多肽相似的或类似的结合位点。
15.宿主细胞，其包含根据权利要求14的基因构建体或载体。
全文摘要
本发明涉及通过具有高法呢醇-龙涎呋喃环化酶活性的多肽生物催化产生龙涎呋喃的方法，所述高法呢醇-龙涎呋喃环化酶是一类新的酶。
文档编号C12P17/04GK102449158SQ201080023461
公开日2012年5月9日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月5日
发明者A·霍尔斯特尔, B·豪尔, M·布罗伊尔 申请人:巴斯夫欧洲公司