专利名称：干细胞用于减少白细胞外渗的用途的制作方法
技术领域：
本发明总得来说涉及借助分泌可减少白细胞外渗的因子的细胞来减少炎症的方法。具体地，本发明涉及使用可分泌因子的细胞的方法，所述因子可下调细胞粘附分子在血管内皮细胞中的表达。下调细胞粘附分子的表达可减少白细胞粘附至内皮细胞，从而使得减少外渗。结果是减少了炎症。因此，本发明提供用于治疗与不合需要的炎性组分相关的病理学病症(包括心血管疾病)的方法。本发明还涉及用于筛选试剂的药物发现方法，所述试剂调节所述细胞的下调内皮细胞中细胞粘附分子表达的能力。本发明还涉及细胞库，其可被用于提供用于给予受试者的细胞，所述库包含在下调内皮细胞中的细胞粘附分子的表达和减少白细胞粘附和外渗方面具有所需能力的细胞。本发明还涉及包含具有特定所需能 力的细胞的组合物。本发明还涉及在给予所述细胞之前进行的诊断方法，包括用于评估待给予的细胞的所需能力的测定。本发明还涉及治疗后诊断测定以评估所述细胞对被治疗的受试者的作用。本发明还涉及药物组合物中具有需要能力的细胞。所述细胞是具有多能特性的非胚胎非生殖细胞。所述多能特性可包括多能标记物的表达和广泛的分化潜能。
背景技术：
羞症急性炎症的过程由受伤组织局部的血管初始，所述血管改变以允许血浆蛋白质和白细胞渗出进入周围组织中。流体进入所述组织的流动增加可导致与炎症相关的特征性肿胀。血管经受显著的血管变化，包括血管舒张、通透性增大和血流变缓，这些变化是由各种炎症介质的作用所诱导。增加的血管通透性可导致血浆移动进入所述组织，引起由于血液中细胞浓度的增加而产生的淤滞。淤滞使得白细胞沿着内皮边缘化(marginate)，这是它们向所述组织中的募集的关键过程。正常流动的血液可以防止上述过程的发生，因为沿着血管周边的剪切力会将血液中的细胞移动到血管中部。因此，所述变化使得白细胞穿过构成血管的内皮和基底膜外渗。一旦进入所述组织，所述细胞就沿着趋化梯度移动到达所述损伤位点，在这里它们能够尝试除去刺激物并且修复所述组织。白细胞穿过血管从血液至组织中的移动被称为外渗，并且可被分为多个大步骤(I)白细胞定位(localisation)并且募集至炎症位点局部的内皮-包括边缘化
和粘附至内皮细胞白细胞的募集是受体介导的。炎症的产物(例如组胺)可促进P-选择蛋白在内皮细胞表面上立即表达。该受体微弱地结合至白细胞表面的碳水化合物配体，使得它们随着键的形成和断裂而沿着内皮表面“滚动”。来自受损细胞的细胞因子可诱导E-选择蛋白在内皮细胞上表达，其与P-选择蛋白的功能类似。细胞因子也可诱导整联蛋白配体在内皮细胞上表达，这进一步使得白细胞慢下来。这些微弱结合的白细胞如果没有被受伤组织产生的趋化因子活化就能自由分离。活化可增加结合的整联蛋白受体对内皮细胞表面上配体的亲和性，将白细胞牢固地结合至内皮。(2)通过血细胞渗出过程的穿过内皮的迁移,被称作变移(transmigration):趋化因子梯度可刺激粘附的白细胞在内皮细胞之间移动并且穿过基底膜进入组织。
(3)白细胞通过趋化作用在组织中移动达到组织间质的白细胞通过表达的整联蛋白和CD44结合至细胞外基质蛋白质，以防止它们从位点上脱落。趋化物(chemoattractant)使得白细胞沿着趋化梯度朝向炎症源移动。白细胞外渗是白细胞从循环系统移出，朝向组织损伤或感染的位点的移动。该过程形成先天免疫应答的一部分，包括募集非特异性白细胞。单核细胞还可在不存在感染和组织损伤的情况下，在它们发育为巨噬细胞的过程中使用该过程。白细胞外渗主要出现在毛细血管后微静脉，此处血流动力学剪切力被最小化。可将该过程理解为多个步骤，下文概括为“趋化作用(chemoattraction)” “滚动粘附” “紧密粘附”和“(内皮)变移”。已经证明每当这些步骤中的任一步骤被抑制时，白细胞募集军即停止。趋化作用识别病原体并被其活化后，感染组织中的定居巨噬细胞释放细胞因子，例如IL-1、TNF-α和趋化因子。IL-I和TNF-α可引起感染位点附近血管的内皮细胞表达细胞粘附分子，包括选择蛋白。循环白细胞由于趋化因子的存在而朝向损伤或感染位点集中。滚动粘附像尼龙搭链一样，循环白细胞上的碳水化合物配体通过边缘亲和力与血管内壁上的选择蛋白分子结合。这使得白细胞慢下来并且开始沿着血管壁内表面滚动。在这种滚动中，在选择蛋白和它们的配体之间发生短暂的键形成和断裂。紧密粘附同时，由巨噬细胞释放的趋化因子活化所述滚动的白细胞并且使得表面整联蛋白分子从默认的低亲和性状态转换为高亲和性状态。这是通过整联蛋白的邻分泌活化促进的，其中所述整联蛋白的邻分泌活化是通过内皮细胞释放的趋化因子和可溶因子实现。整联蛋白在活化状态下与内皮细胞上表达的互补受体以高亲和性紧密结合。这使得白细胞固定不动，尽管有流动中的血流的剪切力。变签白细胞的细胞骨架以如下方式重组，即白细胞铺展在内皮细胞上。白细胞以这种形式伸出伪足并且通过内皮细胞间的空隙。白细胞变移是随着出现在白细胞和内皮细胞表面上的PECAM蛋白相互作用并且有效地将所述细胞拉动穿过内皮而发生。白细胞可分泌降解基底膜的蛋白酶，使得它们能够逸出血管一该过程被称为血细胞渗出。一旦白细胞处于间隙液中，就沿着趋化梯度朝向损伤或感染的位点移动。嗜中性粒细胞在炎症位点的积聚是由特定类的细胞粘附分子介导的，所述细胞粘附分子包括白细胞上的CD18整联蛋白和选择蛋白(内皮上的P-和E-选择蛋白，以及白细胞上的L-选择蛋白)。这一点得到了对患有白细胞粘附缺陷综合征的患者进行的研究的支持，所述患者的白细胞在CD18或选择蛋白碳水化合物配体表达方面有遗传缺陷(例如，II型白细胞粘附缺陷)。诜择蛋白选择蛋白在内皮细胞(通过组织巨噬细胞)的细胞因子活化后很快表达。活化的内皮细胞最初表达P-选择蛋白分子，但是到活化后2小时内，倾向于表达E-选择蛋白。内皮选择蛋白与白细胞跨膜糖蛋白(包括唾液酸化路易斯血型抗原X (Sialyl-Lewisx))上的碳水化合物 结合。P-选择蛋白P-选择蛋白在活化的内皮细胞和血小板上表达。P-选择蛋白的合成可由凝血酶、白细胞三烯B4、补体片段C5a、组胺、TNF-α或LPS诱导。这些细胞因子诱导内皮细胞中的怀布尔_帕拉德体(Weibel-Palade body)的外化,将预先形成的P-选择蛋白呈递于内皮细胞表面上。P-选择蛋白可作为配体结合PSGL-I。E-选择蛋白内皮白细胞粘附分子-I是由细胞因子刺激的内皮细胞表达。人们认为它负责通过介导细胞粘附至血管内壁而在炎症位点处积聚血液白细胞。它表现出与LYAMl的结构特征类似的结构特征，包括存在凝集素-或EGF-样结构域，之后有含6个保守半胱氨酸残基的短共有重复序列(short consensus repeat, SCR)结构
域。这些蛋白质是细胞粘附分子的选择蛋白家族的一部分(Watson et al.，_J. Exp.
Med. 172:263-272(1990) ; Collins et al.，—J. Biol. Chem. 266:2466-2473 (1991))。在P-选择蛋白合成后不久就是E-选择蛋白合成，其由例如IL-I和TNF-α的细胞因子诱导。E-选择蛋白可结合PSGL-I和ESL-I。L-选择蛋白=L-选择蛋白在一些白细胞上组成型表达，并且已知其作为配体与GlyCAM-I、MadCAM-I 和 CD34 结合。一些选择蛋白的表达受抑制可导致免疫应答减缓。如果L-选择蛋白没有产生，则免疫应答可能会慢10倍，因为P-选择蛋白(其也可由白细胞产生)会相互结合。P-选择蛋白可以以高亲和性相互结合，但是其发生的频率较低，因为受体位点密度比更小的E-选择蛋白分子低。这可增加初始的白细胞滚动速度，延长所述缓慢的滚动阶段。整联蛋白参与细胞粘附的整联蛋白主要在白细胞上表达。滚动的白细胞上的β 2整联蛋白与内皮细胞粘附因子结合，阻止细胞运动。LFA-I存在于循环白细胞上,可与内皮细胞上的ICAM-I和ICAM-2结合。Mac-I存在于循环白细胞上，可与内皮细胞上的ICAM-I结合。VLA-4存在于白细胞和内皮细胞上，可促进趋化作用;它还可与VCAM-I结合。通过细胞外趋化因子进行的细胞活化可导致预先形成的β 2整联蛋白从细胞储库中释放出来。整联蛋白分子迁移至细胞表面并且以高亲合力斑块(high-avidity patch)的形式聚集。细胞内整联蛋白结构域通过胞质因子的介导作用与白细胞细胞骨架缔合(associate),所述胞质因子例如胞踝蛋白、α -辅肌动蛋白和粘着斑蛋白。这种缔合作用引起整联蛋白四级结构的构象变化，使得配体可以到达结合位点。二价阳离子(例如，Mg2+)也是整联蛋白-配体结合所需要的。整联蛋白配体ICAM-I和VCAM-I是由炎症细胞因子活化，而ICAM-2是由一些内皮细胞组成型表达，但是会被炎症细胞因子下调。ICAM-I和ICAM-2共有两个同源N-末端结构域；两者可都与LFA-I结合。在趋化作用期间，β I整联蛋白与细胞外基质组分的结合会促进细胞运动VLA-3、VLA-4和VLA-5与纤连蛋白结合，VLA-2和VLA-3与胶原蛋白和其他细胞外基质组分
彡口口 细胞因子外渗受到由炎症应答产生的背景细胞因子环境的调节，并且与具体的细胞抗原无关。最初免疫应答中释放的细胞因子诱导血管舒张并且降低沿血管表面的电荷。血流被减缓，这促进了分子间结合。IL-I活化定居淋巴细胞和血管内皮。TNF- α增加血管通诱件并目.活化血管内皮。CXCL8 (IL-8)形成趋化梯度，其引导白细胞朝向组织损伤/感染位点移动(CCL2具有与CXCL8类似的功能，包括单核细胞外渗和发育为巨噬细胞);还活化白细胞整联蛋白。
可以得到总结炎症中的外渗过程的综述文章。参见Steeber, D. andTedder, T. , Immunologic Research, 22/2-3:299-317(2000);Steeber et aI. ,FSAEB J,9:866-873(1995);和 Wagner, D. and Frenette, P.，Blood,111:5271-5281 (2008)。CD15 (3-岩藻糖基_N_乙酰基-乳糖胺)是一个分化抗原簇-一种免疫学上重
要的分子。CD15是能够在糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上表达的碳水化合物粘着分子(不是蛋白质)。_可介导吞噬作用和趋化作用，存在于嗜中性粒细胞上；在患有何杰金病、一些B细胞慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病和大部分非淋巴细胞性白血病的患者中表达。它还被称为路易斯X和SSEA-I (阶段特异性胚胎抗原I)并且代表鼠多能干细胞的一种标记物，其中它在植入前胚胎中的细胞粘附和迁移中起重要作用。它由_(岩藻糖基转移酶4)和FUT9合成。CD15s对于E-选择蛋白和P-选择蛋白介导的白细胞粘附，唾液酸化路易斯血型抗原X寡糖决定子是白细胞反受体的必要组分。该低聚糖分子分布在粒细胞、单核细胞和天然杀伤细胞的表面上。在最终使得白细胞离开血管树(vascular tree)并且被募集至淋巴组织和炎症位点的过程中，白细胞粘附至这些选择蛋白的形成在是早期的且重要的步骤。Natsuka et al.，J. Biol. Chem. 269:16789-16794 (1994)和 Sasaki et al.，J. Biol.Chem. 269:14730-14737(1994)分离了编码人白细胞α-1，3-岩藻糖基转移酶——FUT7，其能够合成所述唾液酸化路易斯血型抗原X决定子——的cDNA。Natsuka等人发现，当FUT7在哺乳动物细胞中表达时，所述cDNA指导细胞表面唾液酸化路易斯血型抗原X部分的合成，而不是路易斯X、路易斯A、唾液酸化路易斯a或VIM-2决定子的合成。Sasaki等人证明了在体内FUT7合成所述可与E-选择蛋白结合的唾液酸化路易斯血型抗原X部分的能力，并且报道了 FUT7在白细胞中受限的表达。Chen et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. 103:16894-16899(2006)指出，活化的 T 细胞，尤其是Thl细胞表达唾液酸化路易斯血型抗原X，但是其他T细胞不表达。使用报告基因分析，他们证明了 TBET促进了 FUT7的转录，而GATA3抑制了 FUT7的转录。TBET干扰GATA3与其靶DNA的结合，但是GATA3还干扰TBET与FUT7启动子的结合。GATA3通过以磷酸化依赖的方式募集组蛋白脱乙酰基酶-3和HDAC5，并且通过与CBP/p300竞争结合至TBET的N端，调节FUT7的转录。通过ROG介导的对GATA3的抑制获得了 FUT7和唾液酸化路易斯血型抗原X在T细胞中的最大表达。Chen等人(2006)得出以下结论GATA3/TBET转录因子复合体可调节淋巴细胞归巢受体的细胞谱系特异性表达；糖缀合物受到该复合体调节以在Thl和Th2淋巴细胞亚群中实现细胞谱系特异性表达。选择蛋白P配体或P-选择蛋白糖蛋白配体(PSGLl)是髓样细胞和受激的T淋巴细胞上的P-选择蛋白的高亲和性反受体。因此，它在将这些细胞被锚定(tether)至活化的血小板或表达P-选择蛋白的内皮过程中起到关键作用。基于流式细胞术、免疫印迹和流式小室分析(flow chamber analyse),Fuhlbrigge et al. , Nature 389:978-981 (1997)提出由岩藻糖基转移酶-7介导的对PSGLl的差异翻译后修饰可调节皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)的表达，所述抗原在T细胞中可结合P-选择蛋白和E-选择蛋白。CLA-阳性T细胞是皮肤归巢记忆T细胞，所述细胞由它们与单克隆抗体HECA-452的反应性界定。CLA-阳性T细胞在很多炎性皮肤疾病(包括银屑病)中浸润皮肤病损。
发明内容
本发明广义上涉及用于减少炎症的方法。本发明更具体地涉及减少白细胞(嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)外渗的方法。本发明更具体地涉及减少白细胞从循环系统浸润至周围组织中的方法。本发明还涉及减少白细胞粘附至血管的方法。 本发明还涉及减少白细胞粘附至血管内皮的方法。本发明还涉及减少白细胞粘附至血管壁中内皮细胞的方法。本发明还涉及用于下调内皮细胞中粘附分子的表达的方法。本发明还涉及减少内皮细胞活化的方法。本发明还涉及减少血管内皮中的内皮细胞活化的方法。内皮细胞活化可能是因为暴露于炎症细胞因子。细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、白细胞介素-I (IL_1 )、双调蛋白、LPS和其他Toll样受体配体(致病性肽，例如fMLP;来自受损伤组织的肽，例如纤连蛋白片段)、凝血酶、组胺、氧自由基和IFN-Y。在本发明的上下文中，活化包括血管内皮细胞中细胞粘附分子的上调。本发明还涉及降低血管壁中的内皮细胞与白细胞上的粘附配体或部分结合的能力的方法。所述粘着配体或部分包括但不限于PSGL-UESL-1、⑶15s、α4-整联蛋白、⑶44、β 2-整联蛋白、L-选择蛋白、⑶99和JAM。白细胞包括但不限于嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。淋巴细胞包括B细胞和T细胞。T细胞包括⑶4+、⑶8+、Y δ T细胞和天然杀伤细胞。在内皮细胞中表达并被下调的细胞粘附分子包括但不限于E-选择蛋白VCAM、ICAM (I、2 )、P-选择蛋白、CD99、PECAM-I、JAM、ESAM和骨桥蛋白(VCAM的共同受体)。在一个实施方案中，在具有外伤性脑损伤的受试者中，内皮细胞上的I-CAM和P-选择蛋白被上调。本发明涉及减少细胞粘附分子的表达。表达可以是细胞内和细胞外的，例如在内皮细胞表面上。因此，可减少表达，使得当培养内皮细胞时这些分子向细胞培养基中的分泌减少。细胞外和细胞表面表达包括在蛋白质水平上减少表达。细胞内表达包括减少所述细胞内的转录和翻译。根据本发明，全部上述效应(B卩，炎症、外渗、白细胞至内皮细胞的粘附、粘附分子的表达等)的减少可通过以下方式实现将所述白细胞和/或内皮细胞暴露于非生殖细胞，所述非生殖细胞具有胚胎干细胞的一些多能特性但来源自非胚胎组织。根据本发明，全部上述效应可通过给予细胞或由所述细胞条件化的培养基(medium conditioned by the cell)实现。细胞包括但不限于具有胚胎干细胞特性但来源自非胚胎组织的非胚胎非生殖细胞。这样的细胞可以是多能的并且表达多能标记物，例如oct4、端粒酶、rex-l、rox-l、sox-2、nanog、SSEA_l和SSEA-4中的一种或多种。其他多能性的特征可以包括分化为超过一个胚层(例如外胚层、内胚层和中胚层胚胎胚层中的两个或三个)的细胞类型的能力。这样的细胞可以在培养中被永生化或转化，或者不可以在培养中被永生化或转化。这样的细胞可以高度扩增，同时不 被转化，并且维持正常的核型。例如，在一个实施方案中，所述非胚胎非生殖细胞可进行至少10-40次(例如30、40、50、60或更多次)细胞倍增，其中所述细胞没有被转化并且具有正常的核型。所述细胞可以表达端粒酶活性以便能够实现超过30次(例如35、40、45、50或更多次)细胞群倍增(细胞倍增)。但是，如上所述，所述细胞还能够表达oct4、端粒酶、rex-l、rox_l、sox_2、nanog、SSEAl或SSEA4中的一种或多种。这样的细胞可以分化为内胚层、外胚层和中胚层胚胎细胞系中两种的每种的至少一种细胞类型，并且可以包括成为所有三种胚层的分化。此外，它们可以是致瘤的，或者可以不是致瘤的，例如不产生畸胎瘤。如果细胞被转化或者是致瘤的，并且需要将它们用于融合，则这样的细胞可被致缺陷(disable)以使它们不能在体内形成肿瘤，例如通过防止细胞增殖成为肿瘤的处理。这样的处理在本领域中是公知的。这样的细胞可以自然地达到本文所述的效应(即，达到该效应没有经过遗传学或药物学方法修饰)。但是，天然表达子可以被遗传学或药物学方法修饰以增加效能。鉴于这些细胞实现以上效应的特性，所述细胞可被用于筛选试剂的药物发现方法，所述试剂可调节所述细胞实现以上所述效应的能力。这样的试剂包括但不限于小的有机分子、反义核酸、siRNA DNA适体、肽、抗体、非抗体蛋白质、细胞因子、趋化因子和趋化物。然后，所述试剂可被用于增加所述细胞实现任意上述效应的效能。作为一个实例，该测定已经被用于鉴定用TNF-α、IFN- Y , IL-I β或它们的结合物对所述细胞进行的预处理，所述预处理用于产生抑制内皮细胞分子的上调或者下调这些分子的表达的细胞。一些细胞必须与活化的内皮细胞共同培养，以产生下调粘附分子表达(或抑制上调)的因子。因此，可将原初细胞(naive cell)(没有暴露于活化的内皮细胞)暴露于需要的试剂，然后测定对它们对内皮细胞活化、粘附部分的表达或任意上述效应的作用。由于本申请中描述的所述效应可以由从所述细胞分泌的因子引起，因此不仅所述细胞，而且培养所述细胞时产生的条件化培养基(conditioned medium)也可用于实现所述效应。这样的培养基将包含所述分泌的因子，并因此可被用于代替所述细胞或者被添加至所述细胞。因此，当可以使用细胞时，应理解所述培养基也是有效的，并且可被代替或添加。考虑到这些细胞实现上述效应的特性，可以建立细胞库，其包含因具有实现上述效应所需的效能而被选出的细胞。因此，本发明包括测定这类细胞的实现任意上述效应的能力，选择具有所需效能的细胞并将其建库。所述库可提供用于制备用于给予所述受试者的药物组合物的源。可以从所述库直接使用细胞，或者在使用前扩增细胞。因此，本发明还涉及在将这些细胞给予受试者之前进行的诊断方法，所述预诊断方法包括评估所述细胞实现一种或多种上述效应的能力。所述细胞可从细胞库中取出并且直接使用，或者在给药前扩增。在两种情况下，都会评估所述细胞的所需效能。或者，所述细胞可以来自于所述受试者并且在给药之前被扩增。在这种情况下，在给药之前还评估所述细胞的所需效能。尽管针对效力而选择的细胞必然会在所述选择操作过程中被测定，但是在给予所述受试者进行治疗之前再次测定所述细胞以确保所述细胞在所需水平上仍然有效，这是优选的并且是谨慎的。这在所述细胞已被储存——例如在细胞库中，其中细胞在储存期间很可能被冷冻一任意时长的情况下是特别优选的。
关于用所述细胞进行处理的方法，在所述细胞最初被分离和给予受试者之间可以有多个(即相继的)对于调节的测定。这是为了确保所述细胞在该时间范围内发生的操作之后仍然能够在所需水平上达到所述效应。例如，可在所述细胞的每次扩增之后进行测定。如果细胞储存于细胞库中，它们可在被从存储中释放之后进行测定。如果它们被冷冻，则可在解冻后对它们进行测定。如果来自细胞库的细胞被扩增，可在扩增之后对它们进行测定。优选地，可对最终细胞制品(即实际给予所述受试者的细胞制品)的一部分进行测定。本发明还涉及用于通过评估这类细胞实现一种或多种上述效应的效能来确定所述细胞剂量的方法。本发明还包括给予所述细胞之后评估效能的处理后诊断测定。所述诊断测定包括但不限于本文描述的任何这样的效应，即容易就所述效应对受试者进行测定。本发明还涉及包含具有所需效能的细胞群的组合物。这样的细胞群被发现可作为适于给予受试者的和/或在细胞库中的药物组合物，来自所述细胞库的细胞可被直接用于给予受试者或者在给予之前被扩增。本发明的方法和组合物可用于治疗涉及炎症的任意疾病，其中所述炎症的组分涉及白细胞通过细胞粘附分子至血管内皮的粘附。这包括心血管中的极性和慢性病症，例如，急性心肌梗死；中枢神经系统损伤,例如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤；周围血管疾病；肺部疾病，例如哮喘、ARDS ；自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、狼疮、硬皮病(scIerodoma);银屑病；胃肠疾病，例如移植物抗宿主病、克罗恩病。但是，应理解，对于以上任何病症的治疗，使用这样的细胞可能是适当的；即，在被给予以治疗所述病症前已经针对一种或多种本文描述的所述效应被评估并且针对所需效力水平被选择的细胞。
图I :人大动脉内皮细胞(HAEC)中MultiStem调节TNF-α导致的E-诜择蛋白、V-CAM和I-CAM上调。(A)将细胞培养至接近汇合时，用TNF-α将内皮细胞在两种情况下活化72小时，一种情况是仅内皮细胞，另一种情况是与MultiStem共培养。然后通过流式细胞术或PCR分析细胞的E-选择蛋白、V-CAM或I-CAM的表达。(B-E)TNF-a诱导的内皮细胞粘附分子表面表达在MultiStem存在的情况下以细胞剂量依赖性方式减小。当HAEC与MultiStem在TNF-a (10ng/ml)存在的情况下共培养72小时时，HAEC显示出E-选择蛋白(B、C)、V-CAM⑶和I-CAM(E)表达的细胞表面上调降低。测定表达E-选择蛋白和V-CAM的细胞数量，并且表示为用TNF-α诱导来表达这些标记的细胞的总数的百分比。对于I-CAM，所有的细胞都有一些水平表达，即使是在活化前。因此，计算了每细胞的信号强度，并将所述数据表示为TNF-α诱导的信号的百分比。图2 :MultiStem抑制人肺内皮细朐(HPMEC)中的细朐表面粘附分子h.调或者由IL-I β导致的细胞表面粘附分子上调(A)当与MultiStem在TNF-a (10ng/ml)存在的情况下共培养72小时时，HPMEC显示出E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM表达的细胞表面上调降低，类似于HAEC。细胞表面表达是通过FACS测量。⑶HAEC中另一种促炎因子——IL-I β对细胞表面标记物的诱导在以MultiStem共培养的HAEC中也降低。 图3 :MultiStem在转录水平h调节细朐粘附分子h调(A)通讨ELISA测量来自MultiStem和内皮细朐(HAEC或HPMEC)共培养物的培养某中可溶件E-诜择蛋白(sE~诜择蛋白)的水平。(B)在TNF-α存在或不存在的情况下与不同细胞剂量的MultiStem共培养72小时之后从HAEC中分离mRNA。对E-选择蛋白、V_CAM、I-CAM和GAPDH进行定量RT-PCR。与未处理对照细胞相比，MultiStem减少了 TNF-α诱导的E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的mRNA表达。图4 :与MultiStem不同，在用TNF-α活化时，MSC不会抑制内皮细朐中粘着分子的细胞表面表达。(A-C) TNF- α诱导的内皮细胞粘附分子表面表达在MSC存在的情况下不会改变，而与MultiStem的共培养可减少粘着分子表达。当在TNF-a (10ng/ml)存在的情况下与MSC共培养72小时时，HAEC显示E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM表达的细胞表面上调
没有变化。图5 :与至单独用TNF-a诱导的内皮细朐的结合相比，在TNF-α和MultiStem存在的情况下嗜中性粒细胞与共培养的内皮细胞的粘附减少。(A)在单独孵育或者与MultiStem孵育72小时后，将活化或未活化的内皮细胞用活化的嗜中性粒细胞孵育I分钟。然后洗涤细胞，并拍照。通过在每种条件下重复拍照3次并且对在每个高倍视野(IOX )中结合的嗜中性粒细胞数目计数来确定结合的嗜中性粒细胞的数目。(B)与对照内皮细胞相t匕，结合至与MultiStem共培养的内皮细胞的嗜中性粒细胞数目显著减少。(C)显示嗜中性粒细胞与MultiStem共培养的内皮细胞的结合减少的代表性照片。图6 AMI三天后，与赋形物(vehicle)处理的心脏相比，MultiStem处理的心脏中嗜中件粒细胞浸润显著减少。(A)通过永久性LAD结扎诱导急性心肌梗死。所有大鼠在接受AMI后，接受赋形物对照(PBS)或者大鼠MultiStem (I千万个细胞)的直接注射。通过在来自处理或未处理动物的心脏切片中显示弹性蛋白酶染色的细胞来测量嗜中性粒细胞浸润。表I显示来自每只动物的弹性蛋白酶阳性细胞的平均数目(每只动物检测了 4个切片)。(B)通过弹性蛋白酶染色测量嗜中性粒细胞浸润。在手术后3天，与MultiStem处理的动物的弹性蛋白酶染色(12. 185PMN/hpf)相比，对照组具有显著更高的弹性蛋白酶染色(35. 25PMS/hpf) (p=0. 005823)。(C)在MultiStem处理的动物和未处理的动物中，嗜中性粒细胞水平的代表性照片(由弹性蛋白酶染色测量的)。图7 :在炎症过稈中介导白细胞慕集的多个连续步骤。白细胞被捕获，并且开始在P-和-E-选择蛋白和它们的配体P-选择蛋白糖蛋白配体-I (PSGL-I)和E-选择蛋白配体-I (ESL-I)上滚动。一些白细胞(例如淋巴细胞或者造血干细胞和祖细胞)也开始在a 4整联蛋白及其内皮受体血管细胞粘附分子-I (VCAM-I)上滚动。L-选择蛋白对于淋巴组织中HEV上的淋巴细胞滚动是至关重要的。随着炎症发展，白细胞滚动速率减慢，允许整合来自选择蛋白配体和G-蛋白偶联受体(GPCR)的活化信号。这些活化信号导致缓慢滚动的白细胞极化，并且使得L-选择蛋白和PSGL-I聚簇在主极，所述主极可使白细胞通过继发性锚定进一步募集，所述继发性锚定是通过白细胞-白细胞相互作用进行的。白细胞活化增强整联蛋白亲和性和亲合力，导致牢固粘附于在内皮细胞上表达的细胞间粘附分子-I(ICAM-1)。粘附的白细胞不断地侧向迁移，以检查微血管系统并且寻找变移的可能位点。白细胞通常可以通过连接(细胞旁侧(paracellular))途径,或者通过内皮细胞途径(跨细胞途径)变移，所述连接途径是通过连接粘附分子(JAM)、CD99和血小板/内皮细胞粘附分子-I (PECAM-1)、内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)之间的相互作用进行。
具体实施例方式应理解本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂等，因为这些都可以变化。本文使用的术语目的仅是用于描述具体的实施方案，不意欲限制本发明的范围，其仅由权利要求界定。本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应以任意方式理解为限制所描述的主题。除非另有说明，本申请的方法和技术一般根据本领域中公知的常规方法以及本说明书通篇中所引用的和讨论的各种概括性的和具体的参考文献中描述的常规方法进行。参见，例如，Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed. , ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)和 Ausubel etal. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992),以及 Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)。定义“一”或“一种”在本文中是指一种或超过一种，至少一种。当本文使用复数形式时，
其一般包括单数形式。本文使用的术语“粘附”，当在体内时是指足以导致外渗的白细胞与内皮细胞的缔合。在本发明的上下文中，可被本发明的试剂减少或防止的所述粘附是以这样的足量出现的。在体外应用中，粘附的程度(亲合力)可以不必为上述水平。例如，在药物发现的情形中，可能需要检测具有较低数量级的亲合力的粘附(结合)。“细胞库”是已经被培养并且存储用于将来使用的细胞的行业命名。细胞可以被等分存储。它们可被从储库中直接取出使用或者可在存储后被扩增。这样方便，使得有可用于给药的“成品”细胞。所述细胞可能已经被储存在可药用赋形剂中，这样它们可被直接给予，或者当它们被从储库中取出时可与合适赋形剂混合。细胞可被冷冻，或者以其他保持活性的方式储存。在本发明的一个实施方案中，可创造这样的细胞库，即其中已经针对实现一种或多种所述效应的增强效能对所述细胞进行了选择，所述效能例如减少一种或多种粘附分子的表达。从所述储库中取出之后，并且在给予所述受试者之前，优选再次测定所述细胞的效能。这可以通过直接或者间接地使用本申请描述的或者本领域中已知的测定法进行。然后，具有所需效能的细胞能够被给予所述受试者用于治疗。“共给予”是指相互结合、一起、并列给药，包括同时或者顺序给予两种或多种试剂。
“包括(comprising)”是指(没有其他限制地)必需含有所述指示物，对于其他可以含有的事项没有任何限制或排除。例如，“包括X和I的组合物”涵盖包含X和I的任意组合物，无论所述组合物中存在何种其他组分。类似地，“包括步骤X的方法”涵盖其中进行X的任意方法，无论X是所述方法中的唯一步骤还是X仅是众多步骤之一，无论其中有多少其他步骤，也无论与所述其他步骤相比X多么简单或者复杂。“包含(Comprised of)”和使用相同词根“包括(comprise)”的类似短语在本文中均用作“包括(comprising)”的同义词，并且具有相同的含义。“包括(comprised of )” 是“包括(comprising)” 的同义词(见上文)。“条件化的细胞培养基(Conditioned cell culture medium)”是本领域中公知的术语，是指已经在其中培养细胞的培养基。本文中，这是指所述细胞被培养足够的时间以分泌可以有效达到本申请中描述的任意效应的因子，所述效应包括减少细胞粘附分子的表达；减少白细胞对内皮细胞的粘附；减少外渗等。
条件化培养基是指这样的培养基，即其中已经培养细胞以分泌因子进入所述培养基。为本发明的目的，可以通过足够数量的细胞分裂来培养细胞以产生有效量的此类因子，这样使得所述培养基可以减少细胞粘附分子的表达，从而减少白细胞的粘附，进而减少外渗等。通过本领域中已知的任意方法从所述培养基中除去细胞，所述方法包括但不限于离心、过滤、免疫耗竭(例如，经标记的抗体和磁化柱)和FACS分选。“下降”或“减少”是指降低所述效应或者完全阻止所述效应，例如减少白细胞外渗、粘附、粘附部分的表达或者本文描述的任意效应。“EC细胞”是从对称为畸胎癌的一类癌症的分析中发现的。1964年，研究人员指出畸胎瘤中的单个细胞可被分离并且在培养中保持未分化状态。这种类型的干细胞被人们称为胚胎癌细胞(EC细胞)。“有效量” 一般是指提供所需的局部或全身效应的量，例如，通过影响导致外渗的粘附而有效地改善不需要的炎症效应的量。例如，有效量是足以实现有益或所需临床结果的量。所述有效量可以在单次给药中一次全部提供，或者以分数次给药提供有效量的分次量提供。对于可被认为是有效量的量的准确确定可基于各个受试者的个体因素，包括其体型、年龄、损伤和/或待治疗的疾病和损伤，以及所述损伤出现或疾病开始以来的时间量。本领域技术人员能够根据这些本领域中常规的考虑因素确定对于给定受试者的有效量。本文使用的“有效剂量”与“有效量”的含义相同。“有效途径”一般是指用于将试剂递送至所需要的区室、系统或部位的途径。例如，有效途径是通过其可以给予试剂以在所需作用位点提供足以实现有益或所需临床结果的试剂量的途径。“胚胎干细胞(ESC)”是本领域中公知的，并且已经从很多不同的哺乳动物种中制备得到。胚胎干细胞是衍生自被称为胚泡的早期胚胎的内细胞团的干细胞。它们能够分化成为三种原胚层的所有衍生细胞外胚层、内胚层和中胚层。这些包括成人体内超过220种细胞类型的每一种。ES细胞可以成为身体中的任何组织，但胎盘除外。仅桑葚胚细胞是全能的，能够变成所有组织和胎盘。类似于ESC的一些细胞可以通过将体细胞核的核转移至去核受精卵中来产生。“外渗”是指液体从它的容器中泄漏出来。在炎症的情况下，它是指白细胞从毛细血管中移动至它们周围的组织中。这在发明的背景技术部分也讨论过。使用术语“包括”并不意欲进行限制。
“增加”是指在没有预先存在的效应的情况下完全诱导，或者提高所述效应的程度，所述效应例如白细胞外渗、粘附、粘附部分的表达或者本文描述的任意效应。“诱导的多能干细胞(IPSC或IPS细胞)”是已经被重编程的体细胞，例如，通过引入赋予体细胞分化程度较低的表型的外源基因来重编程。然后这些细胞能够被诱导分化成为分化程度较低的子代。可以使用最初于2006年发现的方法的修饰来衍生IPS细胞(Yamanaka, S. et al. , Cell Stem Cell，1:39-49 (2007))。例如，在一种情况下，为了产生IPS细胞，科学家用皮肤细胞起始，然后通过使用反转录病毒将基因插入细胞DNA的标准实验室技术修饰所述皮肤细胞。在一种情况下，所述掺入的基因是0ct4、Sox2、Lif4和c_myc,已知它们可以作为天然调节子共同发挥作用以保持细胞处于胚胎干细胞样状态。这些细胞已经记载于文献中。例如，参见 Wernig et al. , PNAS, 105:5856-5861 (2008) ; Jaenisch etal. , Cell, 132:567-582(2008) ;Hanna et al.，Cell, 133:250-264(2008);和Brambrink etal. ,Cell Stem Cell，2:151-159 (2008)。这些参考文献因其对IPSC和产生它们的方法的教导而以引用的方式纳入本文。通过特定的培养条件(暴露于特定的试剂)产生这样的细胞也是可能的。术语“分离的”是指不与以下成分缔合的细胞在体内与所述细胞缔合的一种或多种细胞或者一种或多种细胞组分。“富集的群”是指相对在体内或者在原代培养中一种或多种其他细胞类型，所需细胞在数目上相对增加。但是，本文使用的术语“分离的”并不表示仅有干细胞存在。相反，术语“分离的”是指细胞被从它们的天然组织环境中移出并且以高于所述正常组织环境的浓度存在。因此，含除干细胞之外，“分离的”细胞群可以进一步包其他细胞类型，并且可以包含其他的组织组分。这还可以表述为，例如细胞倍增。细胞可能已经在体外或离体进行10、20、30、40或更多次倍增，这样使得与在体内或在所述细胞的最初组织环境中(例如骨髓、外周血、月旨肪组织等)的其初始数目相比，所述细胞被富集。“MAPC”是“多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell)”的首字母缩略词。在本申请中，该术语用于命名一类细胞，即具有胚胎干细胞特征的非胚胎干细胞。它可以在分化时衍生超过一种胚层的细胞谱系，例如两种或全部三种胚层(即，内胚层、中胚层和外胚层)。MAPC可以表达端粒酶、Oct 3/4(即Oct 3A)、rex-l、rox-l、sox_2以及SSEA-4中的一种或多种。MAPC中的术语“成体”是非限制性的。它是指非胚胎体细胞。MAPC核型正常并且在体内不形成畸胎瘤。该首字母缩略词在PCT/US2000/21387中首次用于描述从骨髓分离的多能细胞。但是，这些细胞被从骨髓中分离之后，已经发现了具有多能标记物和/或分化潜能的其他细胞，为了本发明的目的，所述其他细胞可以在本文描述的效应方面与首次被命名为“MAPC”的细胞在功能上等价。术语“丨VIuUiSteinil<:_”是高度可扩增的、核型正常的且在体内不形成畸胎瘤的非胚胎非生殖细胞的商品名称。它可以分化为超过一种胚层的细胞谱系。所述细胞可以表达端粒酶、oct3/4、rex-1、rox_l、sox-2和SSEA4中的一种或多种。Mll丨i1Stem_'K)是根据本专利申请中公开的细胞培养方法制备的，具体地，降低氧量和增加血清量。“可药用载体”是用于本发明中使用的细胞的任意可药用介质。这样的介质可保持等渗性、细胞代谢、pH等。它适合体内给予受试者，并因此可用于细胞递送和治疗。术语“效能”是指细胞(或者来自所述细胞的条件化培养基)实现本申请描述的各种效应的能力。因此，效能是指各种水平的效能，包括但不限于(I)减少炎症；(2)减少白细胞浸润(嗜中性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞);(3)减少粘附，例如选择蛋白与白细胞上的唾液酸化路易斯血型抗原X的粘附，所述白细胞包括但不限于CD4+和CD8+淋巴细胞；和
(4)减少内皮细胞上细胞粘附分子的表达，所述粘附分子包括但不限于ICAM、VCAM、E-选择蛋白和P-选择蛋白。可培养并刺激“原始胚胎生殖细胞”(PG或EG细胞)以产生很多分化程度较低的细胞类型。 “祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的细胞，其具有它们的最终分化子代的特性的一些但非全部。确定的祖细胞(例如“心脏祖细胞”)将限于一种细胞谱系，但不限于具体的或终末分化的细胞类型。首字母缩略词“MAPC”中使用的术语“祖”并不将这些细胞限制于具体的细胞谱系。祖细胞可以形成比所述祖细胞分化程度更高的子代细胞。本文使用的术语“减少”是指阻止以及下降。在处理的情形中，“减少”是阻止或改善一种或多种临床症状。临床症状是如果不予处理将对受试者的生活质量(健康)产生消极影响的一种(或多种)症状。这还适用于生物学效应，例如减少外渗、下调内皮细胞上的粘附分子、减少白细胞至内皮细胞的粘附、减少白细胞向周围组织中的浸润、减少白细胞结合等，其最终结果会是改善炎症的有害效应。“选择”具有所需水平的效能(例如，减少一种或多种粘附分子的表达)的细胞可以指鉴别(如通过测定法)、分离和扩增细胞。这将产生具有比亲代细胞群更高效能的细胞群，所述细胞群分离自所述亲代细胞群。选择细胞将包括确定是否存在所需效应的测定，并且还将包括获得该细胞。所述细胞可能天然具有所述效应，因为所述细胞没有与诱导所述效应的试剂孵育，或者暴露于所述试剂。在进行所述测定前可能不知道所述细胞具有所述效应。由于所述效应可以依赖于基因表达和/或分泌，本领域技术人员还可以基于引起所述效应的一种或多种基因进行选择。选择可以是来自组织中的细胞。例如，在这种情况下，可将细胞从所需组织中分离，在培养中扩增，针对所需效应进行选择，并将选出的细胞进一步扩增。选择还可以是来自离体的细胞，例如培养中的细胞。在这种情况下，可针对所述效应测定培养中的一种或多种细胞，并且所得到的具有所述效应的细胞可被进一步扩增。还可针对增强的效应选择细胞。在这种情况下，从其中获得所述增强的细胞的细胞群已经具有所述效应。增强的效力是指与所述亲代群体中的情况相比，每细胞的平均效应量更高。从其中选出所述增强的细胞的亲代群体可以是基本纯系(homogeneous)的(相同的细胞类型)。从该群中获得此类增强的细胞的一种方法是制备单一细胞或细胞库，并且测定这些细胞或细胞库的所述效应，以获得天然具有所述效应的克隆(与用所述效应的调节剂处理所述细胞的情况相反)，然后扩增这些天然增强的细胞。然而，可用将会增强内源细胞途径的效应的一种或多种试剂处理细胞。因此，可处理基本纯系的群体以增强调节作用。
如果所述群体不是基本纯系的，那么，优选地，待处理的亲代细胞群包含至少100种可获得增强的效应的有效细胞类型，更优选至少1000种这样的细胞，甚至更优选至少10000种这样的细胞。处理之后，该子群体可通过已知的细胞选择技术从所述异质群体中回收，如果需要可以进一步扩增。因此，所需的效应水平可以是比在给定在先群体中的水平高的水平。例如，置于来自组织的原代培养物中并且通过培养条件分离并扩增的细胞可提供亲代群体，所述培养条件没有被特地设计为具有所述效应。这样的亲代群体可被处理以增强每细胞的平均效应，或者被筛选以得到所述群体中表达更高效应的一种或多种细胞。然后可将这样的细胞扩增以提供具有更高(需要的)效应的 群体。“自我更新”是指产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与其亲代细胞相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是“增殖”。“干细胞”是指可以进行自我更新(即，子代具有相同的分化潜能)并且也可以产生分化潜能更受限的子代细胞的细胞。在本发明的上下文中，干细胞还可以涵盖分化程度更高的细胞，其已经通过例如以下方式去分化通过核转移、通过与更原始的干细胞融合、通过导入特定的转录因子或者通过在特定条件下培养。参见，例如，Wilmut et al.
,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al. , Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.，Cell，126:663-676(2006);Okita etal. , Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.，Cell，131:861-872(2007)。去分化还可以通过给予一些化合物或暴露于在体内或体外可以引起去分化的物理环境而引起。干细胞还可以来自异常组织，例如畸胎癌和一些其他来源，例如胚状体(但是这些可被认为是胚胎干细胞，因为它们来自胚胎组织，尽管不是直接来自于内细胞团)。干细胞还可以通过将与干细胞功能相关的基因导入非干细胞中而产生，例如，诱导的多能干细胞。“受试者”是指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于人、狗、猫、马、牛和猪。术语“治疗有效量”是指确定可在哺乳动物中产生任何治疗反应的试剂量。例如，有效的抗炎治疗剂可以延长患者的存活，并且/或者抑制明显的临床症状。在本文使用的术语的含义范围内，治疗有效的治疗包括改善患者的生活质量的治疗，即使它们没有改善疾病结果本身。这样的治疗有效量很容易地由本领域普通技术人员确定。因此，“治疗”是指送递这样的量。因此，治疗可以防止或改善炎症的任意病理症状。本发明中广泛使用术语“治疗(“Treat”、“treating”或“treatment，，)”，其主要涵盖防止、改善、抑制或者治愈缺陷、机能障碍、疾病或其他有害的过程，包括干扰治疗的和/或由治疗导致的那些。干细胞本发明可以优选地使用脊椎动物物种的干细胞进行，所述脊椎动物物种例如人、非人灵长类、驯养动物、家畜和其他非人哺乳动物。这些包括但不限于下文描述的那些细胞。胚胎干细胞研究最透彻的干细胞是胚胎干细胞(ESC)，因为它具有无限的自我更新和多能分化潜能。这些细胞可以源自胚泡的内细胞团，或者可以源自植入后胚胎的原始生殖细胞(胚胎生殖细胞或EG细胞)。ES和EG细胞最初是从小鼠中得到，之后从很多不同的动物中得到，最近还从非人灵长类和人中得到。当ESC被导入小鼠胚泡或者其他动物的胚泡中时，ESC可以成为所述动物的所有组织。ES和EG细胞可通过用抗SSEAl (小鼠)和SSEA4 (人)的抗体阳性染色来鉴别。参见，例如，美国专利 No. 5，453，357,5, 656，479,5, 670，372,5, 843，780、5，874，301、5，914，268、6，110，739、6，190，910、6，200，806、6，432，711,6, 436，701、6，500，668,6, 703，279,6, 875，607,7, 029，913,7, 112，437,7, 145，057,7, 153，684 和7，294，508，各自因其对胚胎干细胞以及制备和扩增所述胚胎干细胞的方法的教导而通过引用的方式纳入本文。因此，ESC及其分离和制备方法是本领域中公知的。已经鉴定了许多影响胚胎干细胞在体内的效能状态的转录因子和外源性细胞因子。被描述涉及干细胞多能性的首个转录因子是0ct4。0ct4属于POU (Pit-Oct-Unc)转录因子家族，是能够活化基因转录的DNA结合蛋白，在启动子或增强子区域内包含被称为“八聚体基序”的八聚序列。0ct4在受精卵的分裂期时表达，直到卵圆柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化诱导基因(即，FoxaD3、hCG)并且活化促进多能性的基因(FGF4、UtfU Rexl)0Sox2-高迁移率族(high mobility group,HMG)框转录因子(box transcription
factor)的一个成员-与0ct4协作活化内细胞团中表达的基因的转录。0ct3/4在胚胎
干细胞中的表达维持在某些水平之间是必要的。0ct4表达水平>50%的过表达或者下调将改变胚胎干细胞命运，分别为形成原始内胚层/中胚层或滋养外胚层。在体内，0ct4缺陷的胚胎可发育至胚泡期，但是内细胞团细胞不是多能的。相反，它们沿着胚胎外滋养层谱系分化。Sall4——一种哺乳动物Spalt转录因子——是0ct4的上调调节子，因此对于在胚胎早期维持合适的0ct4水平是重要的。当Sall4水平下降至低于某一闕值时，滋养外胚层细胞将异位扩增至内细胞团中。多能性所需要的另一个转录因子是Nanog,是以Celtic部族“Tir Nan 0g”:永远年轻的土地,命名的。在体内，Nanog从致密桑葚胚期表达,之后被限制在内细胞团中，并且在植入期下调。Nanog的下调对于在原肠胚形成过程中避免多能细胞的不受控扩增和允许多向分化可能是重要的。第5. 5天分离的Nanog无效胚胎由无序胚泡构成，主要包含胚胎外内胚层和无法辨认的上胚层。非胚胎干细胞已在大部分组织中鉴别到干细胞。可能最清楚表征的是造血干细胞(HSC)。HSC是来自中胚层的细胞，其可以使用细胞表面标记物和功能特性来纯化。它们已经被从骨髓、外周血、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离到。它们起始造血作用并且产生多种造血谱系。当它们被移植进入致死量放射线照射的动物中时，它们能够再造红系嗜中性粒细胞-巨噬细胞(erythroid neutrophiΙ-macrophage)>巨核细胞和淋巴造血细胞库。它们还能被诱导进行一些自我更新的细胞分裂。参见，例如，美国专利No. 5，635，387,5, 460，964,5, 677，136、5，750，397,5, 681，599和5，716，827。美国专利No. 5，192，553报道了用于分离人新生儿或胎儿造血细胞或祖细胞的方法。美国专利No. 5，716，827报道了作为Thy-Γ祖细胞的人造血细胞，以及在体外再生它们的合适生长培养基。美国专利No. 5，635，387报道了用于培养人造血细胞和它们的前体的方法和装置。美国专利No. 6，015，554描述了重建人淋巴和树突细胞的方法。因此，HSC及其分离和扩增方法是本领域中公知的。本领域中公知的另一种干细胞是神经干细胞(NSC)。这些细胞可在体内增殖并且连续地再生至少一些神经细胞。当离体培养时，神经干细胞可被诱导增殖以及分化为不同类型的神经元和神经胶质细胞。当神经干细胞被移植至脑中时，其能够植入并且产生神经细胞和神经胶质细胞。参见，例如Gage F. H.，Science, 287:1433-1438(2000),Svendsen S. N. et al, Brain Pathology, 9:499-513 (1999)和 Okabe S. et al. , MechDevelopment, 59:89-102(1996)。美国专利No. 5，851，832报道了从脑组织中得到的多能神经干细胞。美国专利No. 5，766，948报道了由新生儿大脑半球产生神经母细胞。美国专利No. 5，564，183和5，849，553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的用途。美国专利No. 6，040, 180报道了在体外由哺乳动物多能CNS干细胞的培养物中产生分化的神经元。WO 98/50526和WO 99/01159报道了神经上皮干细胞、少突星型胶质细胞前体和谱系受限的神经元前体的产生和分离。美国专利No. 5，968，829报道了从胚胎前脑得到的神经干细胞。因此，神经干细胞以及制备和扩增它们的方法是本领域中公知的。本领域中已经大量研究的另一种干细胞是间充质干细胞(MSC)。MSC来自于胚胎 中胚层，可从多种来源分离到，主要包括成体骨髓、外周血、脂肪、胎盘和脐带血。MSC能够分化成为很多中胚层组织，包括肌肉、骨、软骨、脂肪和腱。关于这些细胞有大量的文献。参见，例如，美国专利 No. 5，486，389,5, 827，735,5, 811，094,5, 736，396,5, 837，539,5, 837，670和 5，827，740。还可见于 PUtenger，M. et al, Science, 284:143-147 (1999)。成体干细胞的另一个实例是脂肪来源的成体干细胞(ADSC)，其通常已被通过以下方式从脂肪分离吸脂术，之后使用胶原酶释放ADSC。ADSC在很多方面类似于源自骨髓的MSC，不同的是能够从脂肪中分离更多细胞。已经报道这些细胞可以分化成为骨、脂肪、肌肉、软骨和神经元。U. S. 2005/0153442描述了一种分离方法。本领域中已知的其他干细胞包括胃肠干细胞、表皮干细胞和肝脏干细胞，其也被称作“卵形细胞”(Potten, C.，et al. , Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998)
,Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997);Alison et al., Hepatology, 29:678-683(1998))。据报道能够分化成为超过一种胚胎胚层的细胞类型的其他非胚胎细胞包括但不限于来自脐带血的细胞(参见美国公布文本No. 2002/0164794)、来自胎盘的细胞(参见美国公布文本No. 2003/0181269)、来自脐带基质的细胞(Mitchell, K. E. et al. , StemCells，21:50-60(2003))、来自小胚胎样干细胞的细胞(Kucia，M. et al. , J PhysiolPharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006))、来自羊水干细胞的细胞(Atala, A.，J TissueRegen Med, 1:83-96 (2007))、来自皮肤来源的前体的细胞(Toma et al. , Nat CellBiol, 3:778-784 (2001))和来自骨髓的细胞(参见美国公布文本No. 2003/0059414和2006/0147246)，其各自因对这些细胞的教导而以引用的方式纳入本文。重编稈体细胞的方法已经使用了一些不同的方法(例如核移植、细胞融合和培养诱导的重编程)来诱导分化的细胞转化为胚胎状态。核转移包括将体细胞核注射进入去核卵母细胞，当所述卵母细胞被转移进入代理母亲中时，可以形成克隆(“生殖性克隆”)，或者当所述卵母细胞在培 养中外植时，可以形成遗传匹配的胚胎干(ES)细胞(“体细胞核转移”，SCNT)。体细胞与ES细胞的细胞融合致使产生显示多能ES细胞的全部特性的杂合体。培养中的体细胞的外植可选择用于可以是多能(pluripotent or multipotent)的无限增殖细胞系。目前,精原细胞干细胞是来源自出生后动物的多能细胞的唯一来源。用规定的因子转导体细胞可以启动重编程至多能状态。对这些试验方法有大量综述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067(2006)和 Yamanaka, S.，Cell Stem Cell，1:39-49 (2007))。核转移
核移植(NT)，也被称作体细胞核转移(SCNT)，是指将来自供体体细胞的核导入去核卵母细胞以产生克隆动物，例如多莉羊(ffilmut et al.，Nature, 385:810-813 (1997))。通过NT产生活的动物证明了体细胞的表观遗传状态(epigenetic state)(包括终末分化的细胞的表观遗传状态)，尽管是稳定的，但也不是不可逆地固定的，而是可以重编程至胚胎状态，其能够指导新生物体的发育。除了为阐释胚胎发育和疾病中涉及的基本表观遗传机制提供令人兴奋的实验方法外，核克隆技术具有用于患者特异性移植医学的潜在益处。体细胞和胚胎干细胞的融合将体细胞核表观遗传重编程至未分化状态，已经在通过胚胎细胞和体细胞融合产生的小鼠杂合体中被证明。多种体细胞与胚胎癌细胞(Solter, D.，Nat Rev Genet,7:319-327 (2006))、胚胎生殖细胞(EG)或 ES 细胞(Zwaka and Thomson, Development,132:227-233(2005))之间的杂合体有很多与亲本胚胎细胞相同的特性，表明多能表型在这样的融合产物中是主要的。对于小鼠(Tada et al. , Curr Biol, 11:1553-1558 (2001)),人ES细胞具有在融合之后重编程体细胞核的潜能(Cowan et al.，Science, 309:1369-1373 (2005) ;Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2006))。沉默多能标记物例如 0ct4 的活化，或者失活体细胞X染色体的再活化为所述杂合细胞中体细胞基因组的重编程提供了分子证据。已经提出DNA复制对于在融合后2天首次观察到的多能标记物的活化是必要的(Doand Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)),以及当与神经干细胞融合时，Nanog 在 ES细胞中的强制过表达可促进多能性(Silva et al. , Nature, 441:997-1001 (2006)) 培养诱导的重编稈已经从胚胎源得到了多能细胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的内细胞团(ICM) (ES细胞)、上胚层(EpiSC细胞)、原始生殖细胞(EG细胞)和出生后精原细胞干细胞(“maGSCsm”，“ES-样”细胞)。以下的多能细胞，与它们的供体细胞/组织一起，描述如下单性生殖ES细胞(parthogenetic ES cell)来自小鼠卵母细胞(Narasimha et al. , Curr Biol,7:881-884(1997));胚胎干细胞来自卵裂球(Wakayama et al. , Stem Cells, 25:986-993 (2007));内细胞团细胞(来源不适用)(Eggan et al.，Nature, 428:44-49 (2004));胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞来自原始生殖细胞(Matsui et al.，Cell，70:841-847 (1992)) ;GMCS、maSSC 和 MASC 来自精原细胞干细胞(Guan et al. , Nature, 440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara etal. , Cell,119:1001-1012(2004);和 Seandel et al. , Nature, 449:346-350 (2007))；EpiSC 细胞来自上胚层(Brons et al. , Nature, 448:191-195(2007);Tesar etal. , Nature, 448:196-199 (2007));单性生殖 ES 细胞来自人卵母细胞(Cibelli et al.
,Science, 295L819(2002);Revazova et al. , Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007))；人 ES 细胞来自人胚泡(Thomson et al.，Science, 282:1145-1147(1998)) ;MAPC 来自骨髓(Jiang et al. , Nature, 418:41-49(2002);Phinney and Prockop,StemCells, 25:2896-2902(2007));脐带血细胞(来自脐带血)(an de Ven et al. , ExpHematoI, 35:1753-1765 (2007));神经球(neurosphere)衍生的细胞来自神经细胞(Clarkeet al.，Science, 288:1660-1663 (2000))。来自生殖细胞谱系的供体细胞(例如PGC或精原细胞干细胞)已知在体外是单能性的，但是已证明多能ES样细胞(Kanatsu-Shinohara etal. ,Cell,119:1001-1012(2004))或 maGSC(Guan et al. , Nature, 440:1199-1203 (2006))在体外长时间培养后可被分离。尽管大部分这些多能细胞类型能够在体外分化和形成畸胎瘤，但依据更严格的标准，仅ES、EG、EC和精原细胞干细胞衍生的maGCS或ES样细胞是多能的，因为它们能够形成出生后嵌合体并且成为生殖种系。最近，多能成体精原细胞干细胞(MASC)可从成体小鼠的睾丸精原细胞干细胞中得到，并且这些细胞具有与 ES 细胞不同(Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007))但是与 EpiSC细胞类似的表达谱，所述EpiSC细胞来自植入后小鼠胚胎的上胚层(Bixms et al.，Nature, 448:191-195 (2007);Tesar et al. , Nature, 448:196-199(2007))。 通过规定的转录因子重编程Takahashi和Yamanaka已经报道了将体细胞重编程回ES样状态(Takahashi andYamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。在将 4 种转录因子 0ct4、Sox2、c-myc 和 Klf4 进行病毒介导的转导，之后针对0ct4靶基因Fbxl5的活化进行选择之后，他们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和成体成纤维细胞重编程为多能ES样细胞(图2A)。具有活化的Fbxl5的细胞是制造的iPS (诱导的多能干)细胞并且通过它们形成畸胎瘤的能力证明了它们是多能的，但是它们不能产生活的嵌合体。这种多能状态依赖于转导的0ct4和Sox2基因的连续病毒表达，而内源0ct4和Nanog基因或者不表达，或者以比ES细胞中低的水平表达，并且发现它们各自的启动子大量甲基化。这与以下结论一致，即虽然Fbxl5-iPS细胞与ES细胞并不一样，但是可能代表了重编程的不完全状态。尽管遗传实验已经确定了 0ct4和Sox2 对于多能性是必需的(Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004) ; Ivanona et al. , Nature, 442:5330538(2006);Masui et al., Nat Cell Biol,9:625-635(2007))，但是两种癌基因c-myc和Klf4在重编程中的作用仍较不清晰。这些癌基因中的一些实际上对于重编程来说是可省去的，因为已经在不存在c-myc转导的情况下得到了小鼠和人的iPS 细胞，尽管效率较低(Nakagawa et al. , Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008) ;fferninget al. , Nature, 448:318-324(2008);Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2007))。MAPCMAPC是“多能成体祖细胞”的首字母缩略词(非-ES，非-EG，非生殖细胞)。MAPC具有分化为至少两种(例如所有三种)原胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞类型的能力。存在于ES细胞中的基因也可存在于MAPC中(例如，端粒酶、Oct 3/4、rex-1、rox-1、sox-2)。Oct 3/4 (人中Oct 3A)看起来是ES和生殖细胞特异性的。MAPC代表比MSC更原始的祖细胞群(Verfaillie，C.M.，Trends Cell Biol 12:502-8(2002) ；Jahagirdar,B. N. , et al. , Exp Hematol, 29:543-56(2001);Reyes, M. and CM. VerfaiIlie, Ann N YAcadSci, 938:231-233 (2001) ; Jiang, Y. et al. , Exp Hematol, 30896-904(2002);和(Jiang, Y.et al. , Nature, 418:41-9. (2002))。人MAPC记载于美国专利7,015,037和美国申请No. 10/467,963。已经在其他哺乳动物中鉴定了 MAPC。例如，鼠MAPC也记载于美国专利7，015，037和美国申请No. 10/467，963。大鼠 MAPC 还描述于美国申请 No. 10/467，963。
这些参考文 献因记载了由Catherine Verfaillie首次分离的MAPC而以引用的方式纳入本文。MAPC的分离和培养MAPC分离方法是本领域中已知的。参见，例如，美国专利7，015，037和美国申请No. 10/467，963，这些方法连同MAPC的特征(表型)以引用的方法纳入本文。MAPC可从多个源分离，所述源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝脏、脊髓、血液或皮肤。因此，可能获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活检样品和其他器官，并且使用本领域技术人员知晓的阳性或隐性选择技术，依赖这些细胞表达(或者不表达)的基因(例如，通过功能性或形态学测定，例如上文引用的申请中公开的那些，所述申请以引用的方式纳入本文)分离所述细胞。美国专利7.015. 037中描沭的来自人骨髓的MAPCMAPC不表达共有的白细胞抗原⑶45或成红细胞特异的血型糖蛋白_A (Gly-A)0将细胞的混合群进行Ficoll Hypaque分离。然后以使用抗⑶45的抗体和抗Gly-A的抗体的阴性选择对细胞进行处理，耗尽CD45+和Gly-A+细胞的群，然后回收剩余的约0. 1%的骨髓单核细胞。还可将细胞铺板于纤连蛋白包被的孔中，并且如下文所述培养2-4周以耗尽⑶45+和Gly-A+细胞。在贴壁骨髓细胞(adherent bone marrow cell)的培养物中，很多贴壁基质细胞在细胞倍增约30次时发生复制性衰老，更同质的细胞群继续扩增并且保持长的端粒。或者，可以使用阳性选择与细胞特异性标记物来分离细胞。阳性和阴性选择技术都是本领域技术人员可以得到的，并且本领域中可得到很多适于阴性选择目的的单克隆和多克隆抗体(参见，例如，Leukocyte Typing V, Schlossman, et al. , Eds. (1995) OxfordUniversity Press),其可从许多来源市购得到。从细胞群混合物中分离哺乳细胞的技术也已经记载于Schwartz et al.，inU. S. Patent No. 5, 759, 793 (磁性分离)，Basch et al. , 1983 (免疫亲和层析)和 Wysockiand Sato et al.，1978 (荧光激活细胞分选)中。U. S. 7, 015, 037 中描沭的培养 MAPC如本文描述分离的MAPC可以使用本文和美国专利7，015，037中描述的方法培养，所述专利因这些方法而以引用的方式纳入本文。细胞可在低血清或无血清培养基中培养。用于培养MAPC的无血清培养基记载于美国专利7，015，037中。已经在无血清和低血清培养基中培养了很多细胞。在这种情况下，所述培养基补充了一种或多种生长因子。通常使用的生长因子包括但不限于骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生的生长因子和表皮生长因子。参见，例如，美国专利 No. 7，169，610,7, 109，032,7, 037，721,6, 617，161,6, 617，159,6, 372，210,6, 224，860、6，037，174,5, 908，782,5, 766，951,5, 397，706 和 4，657，866 ;全部都因对在无血清培养基中培养细胞的教导而以引用的方式纳入本文。另外的培养方法在另外的实验中，培养MAPC的密度可以是从约100个细胞/cm2或约150个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2变化，包括约200个细胞/cm2至约1500个细胞/cm2至约2000个细胞/cm2。所述密度可随种的不同而变化。此外，最佳密度可依赖于培养条件和细胞来源而变化。本领域技术人员能够确定对于给定培养条件和细胞组的最佳密度。同样，在培养的MAPC的分离、生长和分化期间的任何时间都可以使用低于约10%，包括约1_5%，尤其是3-5%的有效大气氧浓度。 可在多种血清浓度下(例如约2-20%)培养细胞。可以使用胎牛血清。更高的血清浓度可以与更低的氧张力结合使用，例如，约15-20%。不必在贴壁至培养皿之前选择细胞。例如，在Ficoll梯度离心之后，将细胞以例如250，000-500, 000/cm2直接铺板。可以挑出贴壁集落，可以合并并且扩增。在一个实施方案中，在实施例的实验方法中使用的高血清(约15-20%)和低氧(约3-5%)条件被用于细胞培养。具体地，将来自集落的贴壁细胞以约1700-2300个细胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(具有TOGF和EGF)中铺板并传代。在特异针对MAPC的一个实施方案中，补充物是允许MAPC保持分化为所有三个谱系的能力的细胞因子或组分。这可以通过未分化状态的特定标记物的表达来指示。例如，MAPC组成型表达Oct 3/4 (Oct 3A)并且维持高水平的端粒酶。细胞培养对于下文列出的全部组分，参见U. S. 7，015，037，其因对这些组分的教导而以引用的方式纳入本文。总的来说，可以在本领域中公知并且可以得到的培养基中维持并且扩增可用于本发明的细胞。还考虑到了给细胞培养基补充哺乳动物血清。还可以有利地使用其他补充物来为细胞提供必需微量元素以实现最佳生长和扩增。还可以有利地将激素用于细胞培养。还可以根据细胞类型和分化细胞的命运来使用脂质和脂质载体以补充细胞培养基。还考虑到了使用饲养细胞层。还可在“3D”(聚集的)培养物中培养细胞。一个实例是2009年I月21日提交的PCT/US2009/31528。—旦在培养中建立，细胞可被新鲜使用，或者使用例如含40%FCS和10%DMS0的DMEM冷冻并以冷冻储液形式储存。对于用于制备所培养的细胞的冷冻储液的其他方法也是本领域技术人员可获得的。药物制剂U.S. 7，015，037因为对药物制剂的教导而以引用的方式纳入本文。在一些实施方案中，所述细胞群存在于组合物中，所述组合物被改造为适于递送，即是生理学相容的。在一些实施方案中，用于给予受试者的细胞(或条件化培养基)的纯度是约100%(基本同质)。在其他实施方案中，纯度是95%至100%。在一些实施方案中，纯度是85%至95%。具体地，对于与其他细胞的混合物的情况，所述百分比可以是约10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90% 或90%-95%。或者，分离/纯度可以细胞倍增的方式表达，其中所述细胞已经经历了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的细胞倍增。对于给定应用，用于给予所述细胞的制剂的选择将依赖于多种因素。其中主要的因素是受试者的种类；待治疗的病症的性质，它的状态和在所述受试者中的分布；所给予的其他疗法和试剂的性质；给药的最佳途径；经所述途径的残存性(survivability);给药方案和对于本领域技术人员来说明显的其他因素。例如，合适载体和其他添加剂的选择会依赖于给药的确切路径和具体剂型的性质。细胞/培养基的水性悬液的最终配制一般包括将所述悬液的离子强度调节至等渗(即，约0. I至0.2)并且调节至生理pH (8卩，约？册.8至7.5)。最终制剂一般还会包含流体润滑剂。
在一些实施方案中，细胞/培养基被配制为可注射的单位剂型，例如溶液剂、悬液剂或乳剂。适于注射细胞/培养基的药物制剂一般是无菌的水性溶液和分散液。用于可注射制剂的载体可以是包含例如以下物质的溶剂或分散介质水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。本领域技术人员可以容易地确定本发明方法中给予的组合物中的细胞和任选的添加剂、赋形物和/或载体的量。一般地，任意添加剂(除所述细胞之外)的存在量为在溶液中(例如在磷酸盐缓冲盐水中)0. 001至50wt%。活性成分以毫克至微克的量级存在，例如为约0. 001至约5wt%，优选约0. 0001至约lwt%，最优选为约0. 0001至约0. 05wt%或者约0. 001至约20wt%，优选约0. 01至约10wt%，最优选为约0. 05至5wt%。细胞的剂量可在很大范围内变化，并且在每种具体情况下均会适合个体需求。一般地，肠胃外给药的情况下，常规地给予约I万个至约2千万个细胞/kg受体体重。细胞的数量将根据以下因素变化受体的体重和病症、给药的次数或频率以及本领域技术人员已知的其他可变因素。可通过适于所述组织或器官的途径给予所述细胞。例如，它们可被全身给予，即，通过静脉给予来肠胃外给予；或者可以被靶向具体的组织或器官；它们可被通过皮下给药或通过向具体的所需组织中的给药而被给予。所述细胞可以约0.01 X IO6个至约5 X IO6个细胞/ml的浓度悬浮于合适的赋形剂中。对于注射溶液适合的赋形剂是与细胞和受体在生物学和生理学上相容的那些赋形剂，例如缓冲的盐水溶液或其他合适的赋形剂。用于给药的所述组合物可根据符合适当的无菌性和稳定性的标准方法而配制、生产和存储。对淋巴造血组织中的给药用于向这些组织中给药的技术是本领域中已知的。例如，骨髓内注射可以包括将细胞直接注射进入(一般为)髂后嵴的骨髓腔中，但是还可以包括髂嵴、股骨、胫骨、肱骨或尺骨中的其他位点；脾脏注射可以包括在射线拍照指导下注射进入脾脏，或者通过腹腔镜或剖腹术手术暴露脾脏；派伊尔氏淋巴集结(peyer' s patch)、GALT或BALT注射可以要求剖腹术或腹腔镜注射过程。MS用于人或其他哺乳动物的剂量可无需过度实验即由本领域技术人员根据本公开内容、本文引用的文献和本领域中的知识确定。适合用于本发明的各个实施方案的细胞/培养基的剂量会依赖于许多因素。确定主要和辅助疗法所给予的最佳剂量的参数一般会包括以下中的一些和全部待治疗的疾病及其阶段；受试者的种类、其健康情况、性别、年龄、体重和代谢速率；受试者的免疫活性；给予的其他治疗法；和根据所述受试者的病史或基因型预测的可能并发症。所述参数还包括所述细胞是否是同基因、自体同源、同种异体或者异种的；它们的效能(具体活性);所述细胞/培养基若要有效则必须靶向的位点和/或分布；以及所述位点的如下特性，例如细胞/培养基的可及性(accessibility)和/或细胞的植入。其他参数包括与其他因子(例如生长因子和细胞因子)的共给予。给定情况的最佳剂量还将考虑制备所述细胞/培养基的方式，给予所述细胞/培养基的方式，以及所述细胞/培养基在给药之后在所述祀位点处集中(localize)的程度。细胞的最佳剂量可以在用于自体同源单核骨髓移植的剂量范围内。对于细胞的完全纯的制品，多个实施方案中的最佳剂量的范围是每次给药IO4至IO8个细胞/kg受体体重。在一些实施方案中，每次给药的最佳剂量为IO5至IO7个细胞/kg。在很多实施方案中，每次给药的最佳剂量为5X IO5至5X IO6个细胞/kg。作为参考，前述的较高剂量类似于自体同源单核细胞骨髓移植中使用的有核细胞的剂量。一些较低的剂量类似于自体同源单核骨髓移植中使用的CD34+个细胞/kg的数目。在多个实施方案中，可以以初 始剂量给予细胞/培养基，之后通过进一步给药来维持。初始可用一种方法给予细胞/培养基，之后通过相同的方法或者一种或多种不同的方法给予。可通过所述细胞/培养基的持续给药来维持所述水平。多个实施方案通过静脉注射来初始给予所述细胞/培养基并且/或者在所述受试者中维持其水平。在多个实施方案中，根据患者的病症和其他因素(在本文他处描述)可使用其他形式的给药。细胞/培养基可以多种频率在很宽时间范围内给予。一般地，治疗的长度会与所述疾病过程的长度、实行的治疗的效力以及接受治疗的受试者的病症和反应成比例。由于本发明的细胞分泌一种或多种因子，所述因子通过本申请中描述的多种生物学机制最终减少炎症，因此所述细胞的给药可用于减少如上所列的任意数目病状中的不想要的炎症。此外，由本申请描述的生物学机制提供了其他用途。这些用途中的一种包括药物发现。该方面包括就调节所述细胞的抗炎效应的能力筛选一种或多种化合物。这将包括，首先，针对细胞减少以下任一情况的能力开发测定法(I)炎症，⑵外渗，⑶内皮细胞-白细胞结合，(4)粘附分子在内皮细胞中的表达(RNA和/或蛋白质)，(5)与所述粘附细胞分子结合的相关配体(cognate ligand)(位于白细胞上)的表达,前提是该配体的表达受到内皮细胞的调节，和出)内皮细胞的细胞因子产生。因此，该测定法可被设计为在体内或在体外进行。调节测定法可评估任意所需水平上的活化状态，例如形态学、基因表达、功能等。它可能包括分离的血管内皮。或者，它可能包括从内皮部分地或者完全地移出的血管内皮细胞，包括内皮细胞株(strain)和内皮细胞系(line)，可以是天然的或重组的。但是，它还可以包括已知具有结合亲和性的分离的细胞组分，例如内皮上表达的粘附分子和存在于白细胞上的它们的相关结合配体。因此，表达或分泌所述细胞粘附分子的重组细胞和相关的白细胞配体可被用于测定结合。或者，所述分离的淋巴细胞结合伴侣(binding partner)可与表达内皮粘附分子的细胞一起使用，所述内皮粘附分子例如P-选择蛋白或E-选择蛋白和 CD 15s ； I CAM-1 或 I CAM-2 和 LFA-1 ；ICAM 和 Mac-1 ； VCAM-1 和 VLA-4。所述测定可以包含活性细胞因子，例如TNF-a或IL_1 P。仅所述细胞因子即可构成所述测定的基础。例如，可测定所述细胞/培养基在基于细胞的受体测定或可溶性受体测定中结合TNF-a的能力，或者作为TNF-a受体的竞争抑制剂起作用的能力。非结合的TNF-a可被直接检测，或者用于非结合TNF-a的测定可以包括针对TNF-a的任意生物学效应的测定。这还可以适用于其他活性细胞因子，例如IL-1。或者，所述测定可以涉及所述细胞/培养基在基于受体的测定中调节(增加、降低)NFkB的能力，所述基于受体的测定使用与由NFk B控制的启动子可操作地连接的报告基因。然后所述测定可被用于筛选增加或者降低所述细胞/培养基的效应的化合物/试剂。可以通过直接测定蛋白质或DNA来估计基因表达。这可以通过本领域中公知的任意技术进行，例如通过FACS、其他基于抗体的检测方法、PCR以及其他基于杂交的检测方法进行。间接检测也可以用于表达，例如结合至任意已知的结合伴侣。用于表达/分泌的测定包括但不限于对组织样本或细胞ELISA、Luminex、qRT-PCR、抗因子蛋白质印迹(anti-facto r western blot)和因子免疫组织化学。对细胞和条件化培养基中的调节因子的定量确定可以使用市售测定试剂盒(例如，依赖两步骤消减的基于抗体的测定(two - step subtractive antibody-based assay)的R&D系统)来进行。本发明涵盖用于产生具有本文描述的增加的效应的细胞的方法。因此，本发明涵盖鉴别化合物的方法，所述化合物增加所述细胞具有本文描述任意效应的能力，所述方法是通过将所述细胞暴露于化合物并且检测所述细胞在任意需要水平上达到所述效应的能力来进行。在一个实施方案中，一些细胞可能需要在产生具有本文描述的效应的因子之前与活化的内皮细胞接触。这样的细胞可被指定为“原初”。因此，在一个实施方案中，可能通过使用适合于本文描述的药物发现的化合物来代替活化的内皮细胞的作用。在一个实施方案中，例如，发明人发现IL-I @、TNF-a和IFN-Y的结合物可以代替与活化的内皮细胞的接触，这在实施例部分简要地描述。因此，可用任意数目的化合物对细胞进行筛选以鉴定允许该代替的化合物。然后，对于本申请中描述的任何治疗用途，以及对于产生可用于临床、治疗和诊断应用的组合物和细胞建库，可将这些化合物用于预处理原初细胞。具体测定的实例I.内皮细胞的FACS分析以在与MAPC共培养或者以来自MAPC的条件化培养基孵育之后检测粘附分子的存在情况。2.对结合至与MAPC共培养或者以来自MAPC的条件化培养基孵育的内皮细胞的嗜中性粒细胞定量。3.在与MAPC共培养或者以来自MAPC的条件化培养基孵育之后使用基于启动子的系统对NF- K B活性定量。4.在已将内皮层与MAPC共培养或者以来自MAPC的条件化培养基孵育之后，使用基于ECIS的系统或类似系统对穿过所述内皮层的白细胞外渗定量。还可以通过检测由所述细胞分泌的活性因子来进行效能测定。所述活性分子包括糖皮质激素、HB-EGF, IL-10、前列腺素 Al、IL-13、IL-1R、IL-18R、IFN-R、TNF-RU TNF-R2、IL-4、IL-II、IFN-P、TGF-3 I、3 2、3 3、前列腺素 E2、SPP1、CYLD、弹性蛋白酶、VEGF、IL_33、胸腺素B4和TGF-3肾上腺髓质素。检测可以是直接的，例如通过RNA或蛋白质测定；或者是间接的，例如，对这些因子的一种或多种生物学效应进行生物学测定。本发明的另一个用途是建立细胞库以提供用于临床给药的细胞。一般地，该方法的一个基本部分是提供具有所需效能的用于在多种治疗临床情况下给药的细胞。可用于药物发现的任意相同测定法还可被应用于为所述库选择细胞以及从所述库中选择细胞来用于给药。因此，在建库过程中，将检测所述细胞(或培养基)实现任意上述效应的能力。然后，将选择具有用于任意上述效应的所需效能的细胞，这些细胞将形成用于产生细胞库的基础。还考虑到了通过用外源化合物处理来增加效能，所述化合物例如通过用大的组合文库筛选细胞而发现的化合物。这些化合物文库可以是试剂文库，所述试剂包括但不限于小的有机分子、反义核酸、siRNA DNA适体、肽、抗体、非抗体蛋白质、细胞因子、趋化因子和趋化物。例如，细胞可在培养和制备过程中的任意时间暴露于这类试剂。唯一的需求是有足够数目使得所需测定得以进行以评估所述试剂是否增加效能。在上文描述的一般药物发现方法中发现，在建库前的最后传代过程中，可以更有利地应用这类试剂。从合格的骨髓供体中分离细胞，所述合格的骨髓供体已经接受了特定的测试要求以确定从该供体得到的细胞产物可安全地在临床情况下使用。使用手工或自动化方法分离所述单核细胞。将这些单核细胞置于培养中，使得这些细胞贴壁至经处理的细胞培养容器 表面。可使MAPC细胞在经处理的表面扩增，在第2天和第4天更换培养基。在第6天，通过机械方法或酶学方法将细胞从所述经处理的基质中移除，并且重铺于细胞培养容器的另一个经处理的表面。在第8天和第10天，如前所述将所述细胞从所述经处理的表面移除并且进行重铺。在第13天，将所述细胞从所述经处理的表面移除，洗涤并且与冷冻保护材料结合，并且最后在液氮中冷冻。在所述细胞已经冷冻至少I周之后，取出细胞的等分试样并用于效能、类型、无菌性测试以及其他测试以确定所述细胞库的可用性。然后，可通过解冻该库中的这些细胞、将它们置于培养中来使用这些细胞，或者在解冻之后使用它们来治疗可能的适应症。另一个用途是针对给予所述细胞之后的效能和有益的临床效应的诊断测定。根据所述适应症，可能有可用于评估的生物标记物。例如，高水平的C-反应蛋白与急性炎症应答有关。人们可以监测CRP的水平来确定有益的临床效应。另一个用途是评估细胞达到上述任意结果的功效，所述评估作为将所述细胞给予受试者之前的治疗前诊断。组合物本发明还涉及细胞群，其具有实现本文描述的任意效应的具体效能(S卩，炎症、夕卜渗、粘附、减少内皮活化等)。如上所述，这些群是通过选择具有所需效能的细胞建立的。这些群被用于制备其他组合物，例如，包含具有具体所需效能的群的细胞库和包含具有具体所需效能的细胞群的药物组合物。实施例实施例IMu丨tiStem 是在本文实施例中描述的实验方法中使用的MAPC细胞制品的商标名称。多能成体祖细胞在活化后调节内皮细胞粘附分子表面表达并且在AMI之后减少爐依据/背景免疫细胞向炎症位点的定位是对损伤和感染的免疫应答的重要部分。在对炎症的应答中，免疫细胞(包括白细胞、淋巴细胞和单核细胞)结合至内皮细胞层并且变移穿过内皮细胞层到达损伤位点1’2。内皮细胞可被凝血酶、组胺和促炎细胞因子(例如，TNF-a和白细胞介素I P )以及氧自由基活化，这可导致粘附分子(包括E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM-I)的上调3_5。内皮细胞的细胞表面上细胞粘附分子的上调可使活化的免疫细胞粘附、滚动并且变移穿过内皮细胞屏障4。
尽管免疫系统的动员是对感染和对伤口愈合的免疫应答的关键部分，缺血性损伤后的炎症可促使细胞毒性和死亡。例如，在急性心肌梗死之后，嗜中性粒细胞浸润的增加与用溶血栓疗法和初级血管形成术治疗的患者中有害事件的风险增加有关6_8。对心肌梗死的炎症应答程度在确定梗死大小以及之后的左心室(LV)重塑过程中具有重要作用9’1(1。嗜中性粒细胞至心脏的定位通过释放蛋白酶和活性氧簇(ROS)促使心肌损伤，所述蛋白酶和活性氧簇可促使左心室重塑。此外，嗜中性粒细胞通过在被描述为“无再流(no reflow)”的现象中阻断毛细血管而促使微血管和毛细血管损伤n。朝向T辅助I (Thl)细胞的促炎失衡可促使左心室膨胀、心脏收缩机能障碍和功能降低12。因此，AMI之后调节嗜中性粒细胞和炎性细胞应答会帮助减少对心肌膜的损伤。Mu丨tiStein'1'是已证明在临床如fe型中以及现在在I期临床试验中，在AMl之后改善心肌功能的扩增的人临床级同种异体多能成体祖细胞13_15。在动物模型中通过直接左前降支结扎(left anterior descending ligation)诱导心肌梗死之后将MultiStem递送至梗死附近位点致使心脏功能改善。与赋形物对照相比，这些研究中MultiStem处理的动物显示出左心室收缩性能改善，伤痕区域减小、血管密度增加和心肌能量特征改善14，16，17。由于MultiStem植入水平低并且MultiStem分化为心肌和内皮细胞的程度最低，在AMI期间MultiStem的益处被认为来自于旁分泌效应。先前的研究已经记录了啮齿动物和人MultiStem显示出强效的免疫抑制特性，并且证明了 MultiStem培养物在体外是非免疫原性的并且能够抑制抗体激活的T-细胞增殖13,15o曾猜测MultiStem的免疫抑制或抗炎特性可扩展至内皮细胞,并且MultiStem可在AMI期间部分地通过对内皮细胞活化和免疫细胞粘附的免疫调节而提供益处，所述对内皮细胞活化和免疫细胞粘附的免疫调节导致嗜中性粒细胞浸润减少。在该研究中，通过检测细胞粘附分子在细胞表面上的上调来检测MultiStem以确定它是否能够调节内皮细胞活化。发现将MultiStem与主动脉或肺部的上皮细胞共培养可以防止用TNF-a活化后内皮细胞的细胞表面上E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的上调，其中对I-CAM上调的防止作用程度较低。E-选择蛋白的上调看起来并不是因为将其从细胞表面的切割增加。相反，MultiStem通过降低V-CAM、I-CAM和E-选择蛋白的转录来调节细胞表面上调。与未处理对照相比，在与MultiStem共培养时出现的细胞表面粘附分子表达的减少可导致结合至内皮细胞的嗜中性粒细胞减少。该活性并不是所有骨髓来源的粘附干细胞所共有的，因为MSC不能够调节用TNF- a活化后V-CAM、E-选择蛋白或I-CAM细胞表面上调。这些结果表明MSC和MultiStem响应于炎性信号时具有不同的分泌谱。为了确定降低的内皮细胞活化是否能够减少急性心肌梗死之后的炎症和嗜中性粒细胞浸润，在AMI大鼠模型中检测了 MultiStem在减少由缺血事件诱导的炎性应答方面的效应。发现嗜中性粒细胞浸润水平降低，这与以下现象一致与赋形物对照相比，永久性LAD结扎之后，在MultiStem处理的心脏中嗜中性粒细胞组织弹性蛋白酶水平下降。材料和方法细胞培养
从Lonza (Walkersville, MD, http://www. lonza. com)购买了人主动脉内皮细胞(HAEC)，并且根据制造商的说明书培养至第7代，使用来自Lonza的内皮生长培养基_2(EGM-2)。从 ScienCelKCarlsbad, CA, www. sciencellonline. com)购买了人肺微动脉内皮细胞(HPMEC)并且根据制造商的说明书培养至第4代，使用来自ScienCell的内皮细胞培养基(ECM)。从Lonza购买了人间充质干细胞(MSC)并且根据制造商的说明书培养至第6代，使用来自Lonza的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)。如参考文献所述培养人MultiStem18。内皮共培养测定
在加湿的、5%C02和37 V的环境下，将HAEC或HPMEC使用各自的培养基以 IXlO5 个细胞 /cm2 铺板于 6 孔 0. 4 u m 膜 Transwell 板(Thermo FisherScientific, Waltham, MA, http://www. fishersci. com)的底部，孵育 3 天。吸去培养基，用PBS清洗所述细胞。每孔加入2ml的MultiStem 培养基，添入物包含I:i、i:4、i: 10或1:20 (HAECiMultiStem)o 将 Iml 的 MultiStem 培养基中的 MultiStem 置于所述孔中。向每孔加入来自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, http://www. sigmaaldrich. com)的 lOng/ml重组人肿瘤坏死因子a (rhTNFa )0还设置仅由内皮细胞(-rhTNF a )组成的对照、由单独的内皮细胞+10ng/ml rhTNFa组成的对照和I: I共培养物(-rhTNF a )对照。对照是在3ml MultiStem培养基中制备的。然后在加湿的、5%C02和37°C的环境中孵育所述样本。或者，对于对照研究，可以使用MSC和MSCGM代替MultiStem和MultiStem培养基。还可以使用来自Sigma-Aldrich的10ng/ml的重组人白细胞介素10 (rhIL-1 ^ )代替rhTNF a来进行所述测定。流式细胞术分析使用50/50PBS/Enzyme FreeCMillipore, Billerica, MA, http://www. millipore.com)使细胞从所述6孔板中脱附，以1600rpm短暂离心5分钟,重悬浮于600 y I的PBS中。将每个样本等分至3管用于流式细胞术染色。在黑暗中将所述细胞与来自BD Pharmingen(San Jose, CA, http://www. bdbiosciences. com)的 20 U I 的针对 CD 106FITC 缀合的(V-CAMl)的抗体、针对⑶54PE缀合的(I-CAMl)的抗体或针对⑶62E PE缀合的(E-选择蛋白)的抗体在4°C下孵育40分钟。此外，使用FITC小鼠IgGlK或PE小鼠IgGlK (BDPharmingen)进行同种型对照。将所述细胞用2ml的PBS清洗，以1600rpm短暂离心5分钟。弃去上清液，将所述细胞重悬浮于200 ii I的PBS+1%多聚甲醒(Electron MicroscopySciences, Hatfield, PA，http: //www. electronmicroscopysciences. com)中。在装配有 488-nm 気激光的 FACSV antage SE 流式细胞仪(Becton Dickinson ImmunocytometrySystems, San Jose, California)上进行流式细胞术分析。使用585/42带通滤波器检测PE(FL2)荧光的发射。使用CellQuestTM软件(Becton Dickinson)进行数据获取和分析。免疫荧光在为进行所述共培养测定对HAEC铺板之前，将12mm的显微镜盖玻片(FisherScientific)放置在6孔Transwell板的底部。在室温下用10%驴血清(JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, http://www. jacksonimmuno. com) 封闭所述细胞I小时，之后在4 °C下用小鼠抗人E-选择蛋白的单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, http: //www. scbt. com)的 1:50 稀释液孵育过夜，同时缓慢搅动。然后用PBS-T清洗所述细胞4次，每次5分钟，之后在室温下用驴抗小鼠AlexaFluor488 的抗体(Invitrogen, Carlsbad, CA, http://www. invitrogen. com)的 1:400 稀释液孵育I小时。然后用PBS-T将这些细胞洗涤4次，每次5分钟。使用Leica显微镜(Leica，Microsystems, Bannockburn, IL, http://www. leica-microsystems. com)、Optronics 相机和Magnafire 软件(Optronics, Goleta, CA, http: //www. optronics. com)在 100X 放大率下获取图像。 ELISA在所述共培养试验后收集所述培养基，并将2倍稀释的样本根据制造商的说明书用在用于可溶性 E-选择蛋白的 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, http: //www.rndsvstems. com)中。RT-PCR使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)使细胞从所述6孔Transwell板脱附，离心并重悬浮于I. 8ml裂解缓冲液中。使用Absolutely RNA Miniprep试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA, http://www. stratagene. com)根据制造商的说明书提取RNA。在65 ii I所提供的洗脱缓冲液中洗脱所述RNA。使用IOOpmol Random Primers(Promega, Madison, WI, http://www. promega. com)进行 RT-PCR。在 96 孔板上检测 RT 阳性和RT阴性以及水。嗜中性粒细胞结合测定从健康志愿者的外周血中分离嗜中性粒细胞。分离之后,通过在37°C下加入LPS(0. I u g/ml) 10分钟使嗜中性粒细胞活化10分钟。在TNF- a存在或不存在的情况下，如上文所述将HAEC与MultiStem或MSC孵育72小时。然后除去培养基，清洗所述细胞，然后将内皮细胞与活化的嗜中性粒细胞孵育I分钟。然后将所述内皮细胞用PBS清洗4次以除去所有未结合的嗜中性粒细胞。多次清洗之后，通过显微镜(20 X物镜)检查嗜中性粒细胞与内皮细胞的结合，并且拍照。对每个视野中与内皮层结合的嗜中性粒细胞计数。每种情况重复3次，每孔拍照3个视野。动物研究细胞制备一在细胞注射的每一天，将MultiStem解冻并测试生存力。将显示>90%生存力的细胞以5千万个细胞/mL重悬浮于PBS中。先前的解冻实验表明MultiStem细胞在这些条件下保持>95%的活性最长达8小时。动物手术——本研究中描述的所有实验动物方法都是根据Animal ResearchCommittee of the Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, Ohio, USA)批准的方案进行的。将体重为150-175g的雄性Lewis大鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)的混合物来麻醉，并在80次呼吸/min下用室内空气换气(RSP 1002，KentScientific Corp, Torrington, CT)。在25只大鼠中通过胸骨切开术和手术结扎左前降动脉来诱导前壁心肌梗死。通过对所述缝合远端的组织的漂白来确认LAD的结扎。LAD结扎之后，将I千万Lewis Rat MultiStem细胞(5千万个细胞/ml)或单独的PBS注射至心脏中梗死区域周围的区域。手术后3天处死动物。将来自10只动物(5只为赋形物处理，5只为MultiStem处理)的心脏包埋在OCT中并且用于冷冻薄切片。随后将切片对弹性蛋白酶染色(以确定嗜中性粒细胞计数)。统计学
使用Student T检验或ANOVA连同后续分析进行统计学分析，当合适时以p〈0. 05接受为统计学显著。误差线表示为标准差。MSMultiStem防止活化后细胞粘附分子上调当暴露于促炎细胞因子例如TNF-a时，粘附分子在内皮细胞表面上的表达显著增加。为了测试MultiStem是否能够调节该应答，在TNF-a存在或不存在的情况下，将MultiStem与人主动脉内皮细胞(HAEC)在transwell中共培养3天。之后,通过FAC分析或免疫染色测量E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的细胞表面表达(图1A)。72小时之后，与 未活化对照相比，TNF-a在MultiStem不存在的情况下诱导了高水平的所有3种标记物。然而，发明人发现在存在MultiStem的情况下，具有E-选择蛋白(图IB) (p=0. 0149)和V-CAM (p=0. 0037)表面表达的细胞数量显著下降(图1B)。此外，在最高剂量的MultiStem下，I-CAM的细胞表面表达水平(p=0. 001)下降(图1C)。MultiStem对细胞表面粘附分子上调的调节是细胞剂量依赖的，随着MultiStem浓度的下降而降低，并且用来自其他供体的MultiStem可以重复(未显示数据)。为了检查该效应是否是TNF-a特异的,使用白细胞介素IP (11-1 P )重复该实验。与使用TNF-a的结果类似，当用Il-IP活化时，与对照相t匕，与MultiStem的共培养抑制了粘附分子(E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM)在细胞表面的上调(图2B)。接着，测定在MultiStem存在的情况下细胞粘附分子的表面表达的下调是否是主动脉内皮特异的应答，或者其他内皮细胞系是否也以类似的方式响应于MultiStem。测试了人肺微血管内皮细胞(HPMEC)以确定这些细胞是否响应于MultiStem而以类似于HAEC的方式下调TNF-a诱导的细胞粘附分子细胞表面表达(图2A)。在细胞表面表达TNF_a诱导的E-选择蛋白(p〈0. 0001)和V-CAM (p〈0. 0001)的HPMEC的数量在与MultiStem共培养之后下降。类似地，在与最高剂量MultiStem共培养的细胞中I-CAM细胞表面表达也显著下降(p=0. 028)(图2A)。因为这些实验是在transwell中进行的，MultiStem调节内皮细胞粘附标记物活化时并不需要MultiStem和内皮细胞之间的直接相互作用。因此，这些数据表明，从MultiStem分泌的可溶因子是以旁分泌的方式发挥作用来减少内皮细胞表面粘附分子表达。MultiStem不增加粘附分子的脱落而是通过防lh对粘附分子RNA表汰的诱导来起鍾MultiStem能够降低粘附分子(例如E-选择蛋白)细胞表面表达的一种可能机制是增加将这些分子从细胞表面的切割。将粘附分子从细胞表面的切割是由不同的蛋白酶(包括金属蛋白酶，例如TACE/ADAM17)介导的。之前的研究表明，可溶性粘附分子可能是病理性的并且可以促使嗜中性粒细胞活化19’2°。对用MultiStem进行的处理进行检查以确定它是否通过增加E-选择蛋白表面脱落而降低E-选择蛋白表面表达。在MultiStem存在或不存在的情况下，通过ELISA测量了由内皮细胞分泌到条件化培养基中的可溶性E-选择蛋白的水平。在从MultiStem与HAEC或HPMECS的共培养物中收集的条件化培养基中没有发现sE-选择蛋白浓度增加(图3A,未显示数据)。相反地,发现在以最高比例与MultiStem共培养的TNF-a活化的HAEC (p〈0. 001)和HPMEC (p〈0. 001)的培养基中可溶性E-选择蛋白下降，表明E-选择蛋白的表面表达下降是因为表面表达的下降连同之后的可溶性E-选择蛋白的脱落减少(图3A)。 因此，E-选择蛋白的表面表达降低不是因为将该分子从细胞表面的切割增加，说明内皮细胞表面上的细胞粘附分子的减少不是因为对这些分子的蛋白水解切割。由于当用例如TNF-a的促炎细胞因子处理内皮细胞时，其中的细胞表面粘附分子E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM均被转录活化，因此测定了 MultiStem是否能够在转录水平调节这些粘着分子的调节(图3)。将内皮细胞(HAECS)在存在或不存在TNF-a的情况下与MultiStem共培养72小时。随后从所述内皮细胞分离RNA并反转录成cDNA。使用针对E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM和GAPDH的引物进行定量PCR。mRNA的表达水平均被相对于GAPDH水平标准化(图3B)。这些结果表明E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM mRNA水平在MultiStem存在的情况下下降，表明MultiStem可抑制这些基因的TNF-a上调。类似的结果可见于当MultiStem与肺内皮细胞(HPMEC，未显示数据)共培养时。由TNF-a引起的V-CAM、I-CAM和E-选择蛋白转录活化是NF- K B依赖的，表明MultiStem在一定程度上调节NF- k B信号传递。不同于MultiStem, MSC不显著调节细胞粘附分子表汰其他骨髓来源干细胞也已被证明通过在动物模型中防止T细胞增殖、抑制天然杀伤细胞功能以及调节免疫疾病(例如克罗恩病和GVHD)而调节免疫功能。为了评估MultiStem对内皮细胞活化的免疫调节作用是否也可由其他干细胞系产生，在TNF-a存在的情况下将内皮细胞与MSC共培养72小时，之后检查细胞粘附分子的细胞表面表达。令人惊讶的是，与未处理对照相比，在MSC存在的情况下TNF-a诱导的内皮细胞粘附分子表面表达没有变化，而MultiStem显著减少粘附分子表达(图4A-C)。使用最高剂量的MSC时观察到了 E-选择蛋白表面表达的微弱减少，然而，该变化显著小于在MultiStem存在的情况下可观察到的减少(图4A)。因此，MSC不调节TNF-a引起的粘附分子上调。这些结果证明MultiStem具有与MSC在功能上不同的分泌谱，其表现在它们的生物学活性的差异上。活化的内皮细胞与MultiStem的共培养防lh嗜中件粒细胞结合已经证明内皮细胞细胞表面上细胞粘附分子的上调对于例如嗜中性粒细胞的免疫细胞的滚动和牢固粘附是至关重要的4。为了确定由MultiStem引起的对粘附分子在细胞表面的上调的调节是否足以影响嗜中性粒细胞与内皮细胞的结合，比较了嗜中性粒细胞对MultiStem处理的内皮细胞和未处理内皮细胞的结合。将内皮细胞培养至汇合单层，在MultiStem存在或不存在的情况下用TNF-a处理72小时。从至少2个不同的供体分离嗜中性粒细胞，通过加入LPS (0. Iii g/ml)活化，并且与内皮细胞孵育I分钟。多次清洗之后，通过显微镜(10X物镜)检查内皮细胞和嗜中性粒细胞的结合并拍照。对每个视野中与内皮细胞结合的嗜中性粒细胞计数(图5A)。仅低水平的活化或未活化的嗜中性粒细胞结合至未活化的内皮细胞。然而，当用TNF-a活化后，如所预期的，可见到结合的嗜中性粒细胞显著增加(图5B)。当将内皮细胞与MultiStem预孵育时，嗜中性粒细胞结合显著降低(p〈0. 0001)。这些结果证明内皮细胞上粘附分子表达的变化足以改变内皮细胞层对嗜中性粒细胞的结合特性。相反，在TNF- a活化期间，MSC与内皮细胞的共培养不能改变嗜中性粒细胞结合。此外，当单独的TNF-a活化的内皮细胞或者与MSC共培养的TNF-a活化的内皮细胞暴露于嗜中性粒细胞时，内皮细胞形态会发生显著改变，成为更长更细的细胞型，并且细胞-细胞接触减少(图5C)。与MultiStem共培养的内皮细胞中，当用TNF-a活化后，细胞形态的没有多大变化，并且保持着细胞-细胞接触。这些数据表明MultiStem从功能上改变了活化的内皮细胞。因此，检测MultiStem以确定它是否能够在体内影响内皮细胞迁移。 用MultiStem讲行的处理减小了 LAD-诱导的急件心肌棰死之后的嗜中件粒细朐浸润先前的动物研究已经证明在心肌梗死(由直接左前降支结扎诱导)之后将MultiStem直接注射进入梗死附近位点导致心脏功能改善14’16。该报道中的所述结果证明MultiStem能够在TNF- a存在的情况下下调粘附分子(E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM)的细胞表面表达。这些分子对于嗜中性粒细胞粘附和穿过内皮的外渗是至关重要的。由于缺血之后嗜中性粒细胞向心脏中的浸润可能是有害的并且可导致缺血损伤之后的心脏功能下降1(U1，因此猜测MultiStem处理之后的心脏功能的改善部分地是由于减少了 AMI之后的炎症和嗜中性白粒细胞向梗死附近区域的浸润。为了验证该假设，在大鼠中诱导心肌梗死之后检查存在于心脏中的嗜中性粒细胞的水平。在大鼠中通过结扎左前降动脉(LAD结扎)诱导前壁心肌梗死。LAD结扎之后，将I千万Lewis大鼠MultiStem细胞或单独的PBS注射到心脏中梗死区域周围的区域。手术之后3天一炎症应答在峰值时一处死动物。将来自10只动物(5只为赋形物处理，5只为MultiStem处理)的心脏切片并且对弹性蛋白酶染色以确定中性粒细胞浸润程度。对于处理和未处理的动物，在梗死周围区域(梗死组织的0. 25-0. 5cm之内)检查嗜中性粒细胞浸润(图6)。AMI和细胞处理之后3天，与赋形物处理的对照相比，MultiStem处理的动物表现出显著较少的向梗死周围区域中的嗜中性粒细胞浸润(每个高倍放大视野(Hpf) 12. 185个嗜中性粒细胞对35. 25个嗜中性粒细胞/Hpf，p=0. 005823)(图6A-C)。在每个动物的4个高倍放大视野中计数弹性蛋白酶阳性细胞并取平均(图6B、C)。这些结果证实了 AMI之后MultiStem对心脏有抗炎症效应。这些数据还表明在MultiStem存在的情况下，在培养物中进行TNF-a活化时观察到内皮细胞粘附分子上调的下降可在体内转化为内皮细胞屏障的功能性变化。结论在该研究中，对MultiStem进行检查以确定它是否能够调节内皮细胞响应于炎性刺激的活化。MultiStem是大规模扩增的临床级多能祖细胞(MAPC)。所述结果证明，与未处理对照相比，当用TNF-a或IL-IP活化并与MultiStem共培养时，主动脉和肺内皮细胞都发生粘附分子E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的细胞表面表达下降。此外，所述实验证明E-选择蛋白表达下降不是因为该分子从细胞表面的脱落减少。相反，与仅TNF-a处理的内皮细胞相比，V-CAM、E-选择蛋白和I-CAM mRNA表达下降，表明MultiStem调节的是这些蛋白质响应于炎性信号而增加的转录。此外，观察到当在TNF-a活化期间将内皮细胞与Mu 11 i St em孵育时，嗜中性粒细胞向活化的内皮细胞的粘附也会减少。为了研究这些变化是适于体内，检查用MultiStem进行的处理以确定它是否调节缺血损伤之后的炎症。确实，在大鼠中AMI之后3天，与赋形物对照相比，MultiStem处理的动物的梗死周围区域中嗜中性粒细胞浸润减少。在MultiStem存在的情况下活化的内皮细胞上细胞粘附分子下调的分子机制仍不清楚。但是，由于所述共培养研究是在transwell中进行的,MultiStem必定将一种或多种可溶性因子分泌进入所述培养基，所述可溶性因子随后作用于内皮细胞以防止或下调这些整联蛋白和选择蛋白的转录。当例如TNF-a或IL-I P的细胞因子结合至它们的受体后，内部信号传递的起始引起NF- K B信号传递依赖的转录。E-选择蛋白、I-CAM和V-CAM的转录全部都是NF- K B依赖的，表明MultiStem可能调节NF- k B信号传递。尽管MSC已被证明在其他情况下具有免疫调节特性，但是当MSC与活化的内皮细胞共培养时，MSC并不阻止活化的内皮细胞中的细胞粘附分子上调。当与任意剂量的MSC共培养时，V-CAM和I-CAM表达没有表现出任何下调。在最高的MSC剂量下，与未处理对照相比，E-选择蛋白从所述细胞表面适度减少。然而，E-选择蛋白表面表达比内皮细胞与MultiStem共培养时显著更高。此外，当活化的内皮细胞与较低剂量的MSC共培养时，没有发现对E-选择蛋白的效应。这些结果有些复杂。首先，MSC用于调节T细胞增殖的机制不同于MultiStem用于下调内皮细胞表面标记物的机制，表明所述干细胞能够通过多种途径调节免疫功能。其次，这些结果表明MultiStem和MSC具有不同的分泌谱，这体现在这两种细胞类型的功能性活性方面的差异。这些差异可以揭示哪种细胞类型在潜在治疗多种临床 适应症方面可能是最好的，每种细胞类型最适合用于不同类型的适应症。对这些干细胞类型和它们的作用机制之间的差异的进一步研究将帮助澄清这些问题。尽管已经在AMI背景下研究了 MultiStem对内皮细胞的效应，但是淋巴细胞和白细胞至内皮细胞的粘附是炎症过程的关键部分，并因此在很多疾病中是有害的，所述疾病包括其他缺血损伤，例如中风；以及免疫疾病，例如GVHD、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)和多
发性硬化。所述结果显示MultiStem可调节至少两种内皮细胞类型-用两种不同细胞因
子TNF-a和11-10活化时的主动脉型和肺型一中的细胞粘附分子上调。该研究说明MultiStem的免疫调节活性可以扩展至多种内皮细胞类型和炎症信号。因此，用MultiStem进行的处理可能对其中免疫细胞穿过内皮的浸润会导致损伤和破坏增强的疾病有益。参考文献I. Wagner et al. The vessel wall and its interactions. Blood. Jun I 2008 ；111 (11) :5271-5281.2. Golias C，Tsoutsi E，Matziridis A，Makridis P，Batistatou A，Charalabopoulos K. Review. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules ininflammation focusing on inflammatory heart disease. In vivo (Athens, Greece).Sep-Oct 2007 ；21(5) :757-769.3.Bullard et al. ， Infectious susceptibility and severe deficiency ofleukocyte rolling and recruitment in E—selectin and P—selectin double mutantmice.The Journal of experimental medicine. May I 1996; 183 (5) :2329-2336.4. Rao et al.，Endothelial-dependent mechanisms of leukocyte recruitmentto the vascular wall. Circulation research. Aug 3 2007 ；101 (3) :234-247.5. Frenette et al.,Susceptibility to infection and altered hematopoiesisin mice deficient in both P-and E-selectins.Cell. Feb 23 1996 ；84(4) :563-574.6. Furman et al.，Effect of elevated leukocyte count on in-hospitalmortality following acute myocardial infarction. The American journal ofcardiology. Oct 15 1996 ；78 (8) :945-948.7. Menon et al.，Leukocytosis and adverse hospital outcomes after acutemyocardial infarction. The American journal of cardiology. Aug 15 2003 ；92 (4)368-372.
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权利要求
1.一种获得具有以下一种或多种所需效能的细胞的方法(I)減少白细胞外滲，(2)减少白细胞至血管内皮或者分离的内皮细胞的粘附，(3)减少细胞因子介导的内皮细胞的活化，(4)減少ー种或多种细胞粘附分子在内皮细胞上的表达，所述方法包括评估并选择具有上述(1)-(4)中ー种或多种所需效能的细胞，所述细胞是表达oct4、端粒酶、rex-Ι或rox-1中的一种或多种并且/或者能够分化为内胚层、外胚层和中胚层胚层中至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
2.一种治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括将权利要求I中所选择的细胞以治疗有效量给予受试者，并持续足以实现治疗效果的时间。
3.一种构建细胞库的方法，所述方法包括扩增并储存权利要求I中所选择的细胞用于将来给予受试者。
4.ー种用于药物发现方法，所述方法包括使权利要求I中所选择的细胞接触一种试剂以评估所述试剂对所述细胞影响事件(1)-(4)中任ー项的能力的效应。
5.ー种包含细胞的组合物，对所述细胞就实现以下ー种或多种事件的所需效能进行了评估和选择(1)减少白细胞外渗，⑵减少白细胞至血管内皮或者分离的内皮细胞的粘附，(3)减少细胞因子介导的内皮细胞的活化，(4)减少ー种或多种细胞粘附分子在内皮细胞上的表达，并且 所述细胞是表达oct4、端粒酶、rex-Ι或;rox_l中的一种或多种并且/或者能够分化为内胚层、外胚层和中胚层胚层中至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
6.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述细胞因子选自TNF-α和IL-I。
7.权利要求1-5中任ー项的方法，其中细胞因子介导的活化使得内皮细胞中E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-I、ICAM和VCAM-2中ー种或多种的表达增加。
8.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述细胞粘附分子——其表达在内皮细胞中被减少——是E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-I、ICAM和VCAM-2中的ー种或多种。
9.ー种增加细胞影响以下ー种或多种事件的效能的方法(I)减少白细胞外渗，(2)减少白细胞至血管内皮或者分离的内皮细胞的粘附，(3)减少细胞因子介导的内皮细胞的活化，(4)減少ー种或多种细胞粘附分子在内皮细胞上的表达；所述方法包括使细胞与IFN-Y、IL-I β和TNF-α接触，以产生实现(1)-(4)中一种或多种效应的细胞； 所述细胞是表达oct4、端粒酶、rex-Ι或;rox_l中的一种或多种并且/或者能够分化为内胚层、外胚层和中胚层胚层中至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
全文摘要
本发明总体上涉及借助分泌可减少白细胞外渗的因子的细胞来减少炎症。具体地，本发明涉及使用分泌因子的细胞的方法，所述因子可下调在血管内皮细胞中细胞粘附分子的表达。下调细胞粘附分子的表达可减少白细胞对内皮细胞的粘附从而减少外渗。结果是减少了炎症。所述细胞是具有多能特性的非胚胎、非生殖细胞。这些可包括多能标记物的表达和广泛的分化潜能。
文档编号C12N3/00GK102625829SQ201080041878
公开日2012年8月1日 申请日期2010年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者J·M·沃达, W·范特霍夫 申请人:Abt控股公司