专利名称：利用控制的光照的微藻发酵的制作方法
利用控制的光照的微藻发酵相关申请的交叉引用本申请要求2009年9月18日提交的美国临时申请号61/243，593和2010年6月29日提交的美国临时申请号61/359，726的权益，其全部公开内容为了所有目的通过引用全文并入本文。领域本发明涉及发酵微生物如微藻的方法、装置和系统。本发明可用于药品、化妆品和食品エ业，以及用于从微藻获得油和生物燃料。 背景最近，注意力已经转向将微藻应用于生产多种材料包括脂质、碳氢化合物、油、多糖、色素和生物燃料。使微藻生长的常规方法之一是在封闭的无光系统中异养培养微藻。通过利用有机碳代替光作为能源，已经开发了在异养生长条件下大規模生产水生微藻的技木。例如，美国专利号3，142, 135和3，882, 635描述从藻类诸如小球藻属(Chlorella)、Spongiococcum和无绿藻属(Prototheca)异养生产蛋白和色素的方法。另外，异养藻类培养物能达到比光合自养培养物高得多的密度。然而，以上应用不能适用于所有微藻，因为只有有限数目的微藻藻种(strain)能够在异养条件生长。在异养条件生长微藻的尝试通常包括筛选能够在异养条件生长的藻种或对生物体遗传修饰以允许在这种条件下生长。包含适当的糖运输系统并天然能够在异养条件生长的微藻通常显示慢的生长速率或商业上感兴趣材料的低产量，因为它们已经进化了许多年以利用日光作为环境信号来控制代谢以及经光合作用产生的能量的多方面。包括微藻的大多数光合生物体利用光作为环境信号来优化自身的生长和存活。光信号由包括红光/远红光光感受器(光敏色素)和蓝光光感受器(隐花色素和NPH)的不同光感受器感知。光用作环境信号，调节生理和发育过程并以无机碳的还原为燃料来提供能量。然而，在某些条件下，光也有变得有毒的可能。当叶绿体吸收的光子通量非常高时(在高光条件下)或当光能的流入超出消耗容量时(在兼养条件下，其中细胞利用还原碳作为能源)发生光抑制。在兼养条件，光合成生物体在比自养条件低得多的光强度显不光抑制，因为由于卡尔文循环中的反馈机制，经光合成器官吸收的电子不能被有效地使用。吸收的光能可导致激发的叶绿素分子在色素层中的积累并损伤光系统。作为过度激发的结果在色素层中积累的激发的叶绿素分子还可刺激活性氧物质诸如超氧化物、羟基和单态氧的产生。
发明内容
本文公开ー种用于培养能够异养生长的微藻的方法，包括在异养生长条件下培养微藻持续足以允许微藻生长的时间段，其中异养生长条件包括包含碳源的培养基，且其中异养生长条件还包括低光辐照。
在一些实施方案中，微藻是葡萄藻属(Botryococcus)藻种,碳源是葡萄糖,且低光福照是1-10 U mol光子IrT2S4。在一些实施方案中，微藻是Botryococcus sudeticus藻种。在一些实施方案中，微藻是葡萄藻属藻种。在一些实施方案中，微藻是UTEX 2629藻种。在一些实施方案中，微藻是布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)藻种。在一些实施方案中，微藻是UTEX 2441藻种。在一些实施方案中，微藻是富油新绿藻(Neochloris oIeabundans)藻种。在一些实施方案中，微藻是新绿藻属(Neochloris)藻种。在一些实施方案中，微藻是UTEX 1185藻种。在一些实施方案中，微藻是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种。在一些实施方案中，微藻是衣藻属(Chlamydomonas)藻种。在一些实施方案中，微藻是UTEX 2243藻种。在一些实施方案中，微藻包含光感受器。 在一些实施方案中，碳源是葡萄糖。在一些实施方案中，碳源选自以下组成的组固定碳源、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-こ酰氨基葡萄糖、甘油、弗罗里多苷、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚合的纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和糖蜜。在一些实施方案中，光由自然光源产生。在一些实施方案中，光是自然日光。在一些实施方案中，光包括全光谱光或特定波长的光。在一些实施方案中，光由人造光源产生。在一些实施方案中，光是人造光。在一些实施方案中，低光辐照的强度是0. Ol-Iiimol光子HT2s'在一些实施方案中，低光辐照的强度是I-IOy mol光子HT2s'在一些实施方案中，低光福照的强度是10-100 Ii mol光子IiT2S'在一些实施方案中，低光福照的强度是100-300 ii mol光子mY1。在一些实施方案中，低光辐照的强度是100-300 y mol光子m^V1。在一些实施方案中，低光福照的强度是3-4 ii mo I/W1光子、2-3 ii mol/W1光子、1-2 u mol/m 2s 1 光子或 3-5 u mol/m 2s 1 光子。在一些实施方案中，该方法还包括从微藻产生材料。在一些实施方案中，材料是多糖、色素、脂质或碳氢化合物。在一些实施方案中，材料是碳氢化合物。在一些实施方案中，该方法还包括回收材料。在一些实施方案中，该方法还包括提取(extract)材料。在一些实施方案中，该方法还包括加工材料。在一些实施方案中，材料的加工产生已加工材料。在一些实施方案中，已加工材料选自以下组成的组燃料、生物柴油、喷气燃料、化妆品、药剂、表面活性剂和可再生柴油。在一些实施方案中，以上方法中微藻的生长速率比在第二异养生长条件下培养持续足以允许微藻生长的时间段的第二微藻高，其中第二异养生长条件包括包含碳源的生长培养基，且其中第二异养生长条件不包括低光辐照。本文还描述一种培养微藻的方法，包括将多个微藻细胞放置在碳源和低光福照存在下。本文还描述一种制造材料的方法，包括提供能够产生材料的微藻；在培养基中培养微藻，其中培养基包含碳源；向微藻施加低光福照；和允许微藻积累其细胞干重的至少10%作为材料。在一些实施方案中，该方法还包括回收材料。本文还描述ー种生物反应器系统,包括生物反应器；包含碳源的培养基，其中培养基位于生物反应器中；适于异养生长的微藻，其中微藻位于培养基中；和光源，其中光源产生低光辐照，且其中光源可操作地耦合(coupled)于生物反应器。
在一些实施方案中，来自光源的光包括全光谱光或特定波长的光。在一些实施方案中，来自光源的光包括由可操作地耦合于生物反应器的太阳能集热器收集的自然日光，且其中光经由可操作地耦合于太阳能集热器和生物反应器的光纤被传递到生物反应器内部。在一些实施方案中，来自光源的光包括人造光，其中人造光由发光二极管(LED)或荧光灯(fluorescent light)产生。在一些实施方案中，系统还还包括足以供应LED或突光灯的电源，其中电源可操作地耦合于生物反应器；和可操作地耦合于电源的光控制器，其中光控制器适于控制由LED或荧光灯发射的光的強度和波长。在一些实施方案中，光纤安装在透光和保护性的光结构(light structure)中。在一些实施方案中，LED安装在透光和保护性的光结构中。多个附图
的简述參考以下描述和附图，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中附图中图I是生物反应器的一个实施方案。图2说明类异戊ニ烯/类胡萝卜素途径。图3A-C显示UTEX 1185在白光、蓝光和红光条件下的生长。X轴显示天数。Glu代表葡萄糖。图4A-C显示UTEX 2629在白光、蓝光和红光条件下的生长。X轴显示天数。Glu代表葡萄糖。图5A-C显示UTEX 2441在白光、蓝光和红光条件下的生长。Glu代表葡萄糖。图6显示UTEX 2441在红光条件下生产脂质。LG代表光+葡萄糖；DG代表黑暗+葡萄糖。图7显示UTEX 2243在白光条件下的生长。详述除非另外指明，否则权利要求书和说明书中使用的术语如下定义。“无污染”是指没有其他活生物体污染的生物体培养物。“生物柴油”是适于用作柴油机燃料的生物方式产生的脂肪酸烷基酯(fatty acidalkyl ester)。术语“生物质”是指由细胞的生长和/或繁殖产生的材料。生物质可包含细胞和/或细胞内容物以及细胞外材料。细胞外材料包括但不限于由细胞分泌的化合物。“生物反应器”是指在其中细胞被培养、任选地被悬浮培养的密闭室(enclosure)或局部密闭室。图I是生物反应器的ー个实例。“光生物反应器”是指在其中培养ー种或多种微藻细胞的容器，其至少一部分是至少部分地透光或部分地开放的，从而允许光穿过。光生物反应器可以是闭合的，如在聚こ烯袋或Erlenmeyer烧瓶的情形，或可以是对环境开放的，如在户外池塘的情形。
如本文所用的“催化剂”是指能够帮助或促进反应物化学反应为产物而不变成产物一部分的ー种剂，诸如分子或大分子复合体。因此，催化剂提高反应速率，之后催化剂可作用于另一反应物以形成产物。催化剂通常降低反应所需的总活化能，使得反应更快地或在较低温度进行。从而可更快实现反应平衡。催化剂的实例包括为生物催化剂的酶、为非生物催化剂的热、和用于石油精炼エ艺的金属催化剂。
“纤维素材料”是指纤维素的分解产物，包括葡萄糖和木糖，且任选地包括另外的化合物诸如二糖、低聚糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸杆、木片、锯屑和柳枝稷。术语“共培养(co-culture) ”及其变化形式诸如“共培养(co_cultivate) ”,是指在同一生物反应器中存在两种或多种类型的细胞。两种或多种类型的细胞可以都是微生物诸如微藻，或可以是一种微藻细胞与不同细胞类型一起培养。培养条件可以是促进两种或多种细胞类型的生长和/或繁殖的那些，或有利于两种或多种细胞之一或亚组的生长和/或增殖同时维持剩余细胞的细胞生长的那些。本文所用的术语“辅因子”是指酶执行其酶活性所需的底物以外的任何分子。
术语“培养”及其变化形式，是指通过使用预定培养条件有意促进一种或多种细胞的生长(细胞大小、细胞内容物、和/或细胞活性的增加)和/或繁殖(细胞数目经有丝分裂增加)。生长与繁殖二者的联合可称为增殖。一种或多种细胞可以是微生物诸如微藻的细胞。预定条件的实例包括使用确定培养基(具有已知特征诸如PH、离子强度和碳源)、指定温度、氧张力(oxygen tension)、二氧化碳水平、和在生物反应器中生长。该术语不是指微生物在自然中或以其他方式无直接人类介入的生长或繁殖，诸如生物体自然生长，最终变成化石产生地质学原油。如本文所用的术语“细胞溶解”是指细胞在低渗环境中的溶解。细胞溶解由过度渗透或水向细胞内部移动(水分过多)引起。细胞不能抵抗内部水的渗透压，所以其破裂。如本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指重组或合成地产生的核酸构建体，带有允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列指定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包括与启动子可操作地连接的待转录的核酸。“外源基因”是指转化到细胞中的核酸。转化的细胞可称为重组细胞，可向其中引入另外的外源基因。外源基因可来自相对于被转化的细胞不同的物种(从而是异种的)，或来自相同物种(从而是同种的)。在同种基因的情形，其相对于该基因的内源拷贝占据细胞基因组中的不同位置。外源基因可在细胞中存在多于一个拷贝。外源基因可作为基因组中的插入物或作为游离体分子被保持在细胞中。“外源提供的”描述向细胞培养物的培养基提供的分子。“固定碳源”是指在环境温度和压力以固体或液体形式存在的含碳的分子，如有机分子。“匀浆”是指已经被物理地破坏的生物质。如本文所用的“碳氢化合物”是指(a)仅含氢原子和碳原子的分子，其中碳原子被共价连接以形成与氢原子连接的线性、支链、环状或部分环状的骨架；或(b)主要仅含氢原子和碳原子并且可通过一至四个化学反应被转化为仅含氢原子和碳原子的分子。后者的非限制性实例包括在一个碳原子与一个氢原子之间包含氧原子以形成醇分子的碳氢化合物、以及包含单个氧原子的醛类。用于将醇类还原为仅含碳原子和氢原子的碳氢化合物的方法是公知的。碳氢化合物的另一实例是酯，其中有机基团代替含氧酸中的一个(或多于一个)氢原子。碳氢化合物的分子结构从天然气组分甲烷(CH4)的最简单形式，变化到非常重和非常复杂的形式，诸如一些分子，诸如见于原油、石油和浙青中的浙青质。碳氢化合物可以是气体形式、液体形式或固体形式，或这些形式的任何组合，并可在骨架的相邻碳原子之间具有一个或多个双键或三键。因此，该术语包括线性、支链、环状或部分环状的烷烃、烯烃、脂质和石蜡。实例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷、三油精和角鲨烯。术语“氢碳比例”是指分子中氢原子与碳原子以原子对原子为基础的比例。该比例可用于指碳氢化合物分子中碳原子和氢原子的数目。例如，具有最高比例的碳氢化合物是甲烷CH4 (4 I)。“疏水级分(hydrophobic fraction) ”是指材料在疏水相比在水相中更可溶的部分或级分。疏水级分大致 上是水中不溶的且通常是非极性的。如本文所用的短语“增加脂质产率”是指通过例如增加每升培养物的细胞干重、增加形成脂质的细胞的百分比、或增加每单位时间每升培养体积的脂质总量而使微生物培养物的生产率增加。“诱导型启动子”是介导可操作地连接的基因响应于特定刺激而转录的启动子。如本文所用的短语“可操作地连接”是指两条序列诸如控制序列(通常是启动子)与连接的序列之间的功能性连接。如果启动子能够介导外源基因的转录，则启动子与基因可操作地连接。术语“原位”是指“在原处”或“在其最初的位置”。例如，培养物可包含分泌催化剂的第一微藻和分泌底物的第二微生物，其中第一和第二细胞类型产生对于特定化学反应在共培养物中原位发生所必需的组分而不需要材料的进一步分离或加工。“营养的限制浓度”是培养物中限制培养的生物体繁殖的浓度。“营养的非限制浓度”是在指定培养时间支持最大繁殖的浓度。因此，在营养的限制浓度存在时在指定培养时间产生的细胞数目低于当营养是非限制时产生的细胞数目。当营养以比支持最大繁殖的浓度大的浓度存在时，认为培养物中的营养是“过量”的。如本文所用的“脂酶”是催化水不可溶的脂质底物中的酯键水解的水溶性酶。脂酶催化脂质水解为甘油和脂肪酸。“脂质”是在非极性溶剂(诸如醚和氯仿)中可溶且在水中相对不可溶或完全不可溶的一类碳氢化合物。脂质分子具有这些特征是因为其主要由性质为疏水的长碳氢化合物尾构成。脂质的实例包括脂肪酸(饱和的和不饱和的)；甘油酯或甘油脂质(诸如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或天然脂肪、和磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘月旨、包括胆固醇和类固醇激素的固醇脂质、包括萜类的异戊烯醇脂质、脂肪醇、蜡和聚酮类(polyketides));和复合脂质衍生物(complex lipid derivative)(糖连接脂质或糖脂和蛋白连接脂质)。“脂肪”是称为“三酰基甘油酯”的脂质亚组。术语“低光辐照”是指可施加于微生物同时避免异养条件下显著光抑制的光辐照以及引发微生物中光活化的代谢所需的光辐照。光活化的代谢包括但不限于，生命周期、昼夜节律、细胞分裂、生物合成途径和运输系统。如本文所用的术语“溶胞产物”是指包含溶解的细胞内容物的溶液。如本文所用的术语“溶胞作用(Iysis) ”是指通常通过危害生物体完整度的机械、病毒或渗透机制破裂生物体的质膜和任选地细胞壁，足以释放至少一些细胞内容物。如本文所用的术语“溶胞”是指破坏生物体或细胞的细胞膜和任选地细胞壁，足以释放至少一些细胞内容物。“微藻”是指包含叶绿体且任选地能够进行光合作用的真核微生物体，或能够进行光合作用的原核微生物体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光合自养生物、以及能够仅依赖固定碳源生活的异养生物。微藻可指在细胞分裂后立刻从姐妹细胞分离的单细胞生物体，诸如衣藻属，还可指微生物诸如，例如团藻属(Volvox)，其是两种不同细胞类型的简单多细胞光合成微生物。“微藻”还可指诸如小球藻属和杜氏藻属(Dunaliella)的细胞。“微藻”还包括表现细胞-细胞粘附的其他微生物光合成生物体，诸如阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)和葡串藻属(Pyrobotrys)。“微藻”还包括已经失去进行光合作用的能力的专性异养微生物，诸如某些沟鞭藻藻类物种。微藻的其他实例在以下描述。术语“微生物(microorganism) ”和“微生物(microbe) ”在本文可互换地使用，是指显微镜可见的单细胞生物体，如微藻。如本文所用的术语“渗透压休克”是指在渗透压突然降低后细胞在溶液中破裂。有时诱导渗透压休克以释放这种细胞的细胞成分到溶液中。
“多糖”(还称为“聚糖”)是由被糖苷键连接到一起的单糖构成的碳水化合物。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖的实例。纤维素可被酶解聚合产生单糖诸如木糖和葡萄糖，以及更大的二糖和低聚糖。在生物反应器的语境中，“ 口 ”是指生物反应器中允许材料诸如气体、液体和细胞流入或流出的开口。 口通常连接于从生物反应器引出的管道。“启动子”定义为指导核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文所用的启动子包括转录起始点附近的必需核酸序列，所述转录起始点诸如在II型聚合酶启动子的情形是TATA元件。启动子任选地还包括远端增强子或阻遏蛋白元件，其可位于距转录起始点数千喊基对远。如本文所用的术语“重组”当提及如细胞、或核酸、蛋白、或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入外源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而被修饰，或该细胞来源于如此修饰的细胞。如此，例如重组细胞表达该细胞天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达本来异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。本文的术语“重组核酸”是指一般通过例如利用聚合酶和核酸内切酶操纵核酸、最初在体外形成的处于通常不见于自然界的形式的核酸。以这种方式，实现可操作地连接不同序列。因此，线性形式的分离的核酸，或通过连接通常不连接的DNA分子体外形成的表达载体，都为了本发明的目的被认为是重组的。应理解的是，当制备重组核酸并重新引入宿主细胞或生物体后，其将非重组地复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操纵；然而，这样的核酸在重组产生后尽管接着非重组地复制，仍为了本发明的目的被认为是重组的。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术即，经由如上描述的重组核酸的表达制备的蛋白。如本文所用的术语“可再生柴油”是指经由脂质的氢化和脱氧产生的烷烃(诸如C10:0、C12:0、C :14:0、C16:0 和 C18:0)。如本文所用的术语“声处理(sonication) ”是指通过使用声波能破坏生物材料诸如细胞的方法。“糠醒物质(species of furfural) ”是指2_呋喃甲醒或其保留同样的基本结构特征的衍生物。如本文所用的“秸杆(stover) ”是指在收获了谷粒之后作物剩余的干燥的茎和叶。
“废水”是水样废物，其通常包含洗涤水、洗衣废水、粪便、尿和其他液态或半液态废物。其包括一些形式的城市废物以及二级处理污水。必须注意的是，除非上下文另外清楚指明，否则在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代对象。微牛物可使用产生适当的脂质或碳氢化合物的任何生物体物种，尽管天然产生高水平适当的脂质或碳氢化合物的微生物是优 选的。微生物产生碳氢化合物由以下综述Metzger 等.Appl Microbiol Biotechnol(2005)66 :486-496 和 A Look Back at theU. S. Department of Energy' s Aquatic Species Program Biodiesel from Algae(回顾美国能源部的水生物种计划来自藻类的生物柴油)，NREL/TP-580-24190，John Sheehan,Terri Dunahay, John Benemann 和 Paul Roessler(1998)。影响用于本发明中的微生物的选择的考虑因素除了包括产生适当的脂质或碳氢化合物以产生油、燃料和油脂化学品以外，还包括(I)高的作为细胞重量百分比的脂质含量；(2)容易生长；(3)容易遗传改造；和(4)容易生物质加工。在具体实施方案中，野生型或遗传改造的微生物产生为至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、或至少70%或更多脂质的细胞。优选的生物体异养生长，或可利用例如本文公开的方法被改造为如此。容易转化和在微生物中有功能的选择标记和组成型和/或诱导型启动子的可用性影响遗传改造的容易度。加工考虑因素可包括，例如，溶解细胞的有效手段的可用性。在一个实施方案中，微生物包括可在异养条件下生长并利用光作为信号来控制细胞过程的天然或改造的微生物。这些微生物可包括藻类诸如蓝藻门(Cyanophyta)、绿藻门(Chlorophyta)、红藻门(Rhodophyta)、隐藻门(Cryptophyta)、绿变形藻门(Chlorarachniophyta)、定鞭藻门(Haptophyta)、裸藻门(Euglenophyta)、不等鞭毛门(Heterokontophyta)和娃藻门(Diatoms)。蘯类在本发明一个实施方案中，微生物是微藻。根据本发明可使用的微藻的非限制性实例在以下描述。更具体地，属于蓝藻门的藻类分类单元(包括蓝藻纲(Cyanophyceae))是为原核生物界的那些，其具有氧进化型光合作用的能力并且被分为以下目和科。色球藻目(Chroococcales)包括微囊藻科(Microcystaceae)、色球藻科(Chroococcaceae)、石囊藻科(Entophysalidaceae)、管抱藻科(Chamaesiphoniaceae)、皮果藻科(Dermocarpellaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)和水胞藻科(Hydrococcaceae) ;_藻目(Oscillatoriales)包括博氏藻科(Borziaceae)、假鱼渥藻科(Pseudanabaenaceae)、裂须藻科(Schizotrichaceae)、席藻科(Phormidiaceae)、_藻科(Oscillatoriaceae)和须藻科(Homoeotrichaceae);念珠藻目(Nostocales)包括伪枝藻科(Scytonemataceae)、微毛藻科(Microchaetaceae)、胶须藻科(Rivulariaceae)和念珠藻科(Nostocaceae)；以及真枝藻目(Stigonematales)包括绿胶球藻科(Chlorogloeopsaceae)、蒴链藻科(Capsosiraceae)、真枝藻科(Stigonemataceae)、飞氏藻科(Fischerellaceae)、波吉藻科(Borzinemataceae)、拟珠藻科(Nostochopsaceae)和鞭枝藻科(Mastigocladaceae)。
绿藻门包括绿藻纲(Chlorophyceae)、绿枝藻纲(Prasinophyceae)、平藻纲 (Pedinophyceae)、四胞藻纲(Trebouxiophyceae)和石药纲(Ulvophyceae)。更具体 地，绿藻纲包括伞藻属(Acetabularia)、针状藻属(Acicularia)、Actinochloris、尖 粒藻属(Amphikrikos)、肋叶藻属(Anadyomene)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、锚藻属 (Ankyra)、隐毛藻属(Aphanochaete)、Ascochloris、星球藻属(Asterococcus)、星胞藻属 (Asteromonas)、Astrephomene^ 虫皇族！(Atractomorphaノ、Axilococcus、Axilosphaera^ Basichlamys^ ^ ^ Wt Jh (Basicladiaノ I1 _ ) (Binucleariaノ 、 Bipedinomonas^ M 泡藻属(Blastophysa)、香蕉菜属(Boergesenia)、布氏藻属(Boodlea)、Borodinella、 Borodinellopsis^ 葡萄藻属、咸胞藻属(Brachiomonas)、片球藻属(Bracteacoccus)、毛 鞘藻属(Bulbochaete)、Caespitella、盒管藻属(Capsosiphon)、四鞭藻属(Carteria)、 Centrosphaera、硬毛藻属(Chaetomorpha)、毛丝藻属(Chaetonema)、盾毛藻属 (Chaetopeltis)、胶毛藻ノ禹(Chaetophoraノ、Cha_Lmasia、Chamaetricnon、Characiochloris、 管粧藻属(Characiosiphon)、小粧藻属(Characium)、Chlamydella、Chlamydobotrys^ Chlamydocapsa^ 衣藻属、Chlamydopodium^ しhloranomala、Chlorochydridion^ 绿点藻 )禹(Cnlorochytrium)、Chlorocladus^ 绿缠藻 ノ禹(しhlorocloster)、Chlorococcopsis、 绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、拟衣藻属(Chloromonas)、 Chlorophysalis^ 叠球藻属(Chlorosarcina)、拟绿囊藻(Chlorosarcinopsis)、 Chlorosphaera^ Chlorosphaeropsis^ Chlorotetraedron^ 绿筒藻ノ禹(Chlorothecium)、 顶棘藻属(Chodatella)、Choricystis、刚毛藻属(Cladophora)、拟刚毛藻属 (Cladophoropsis)、羽枝藻属(Cloniophora)、拟新月藻属(Closteriopsis) ^Coccobotrys^ しoelastrella、しoelastropsis、空星 Y桌属(Coelastrum)、Coenochloris^ しoleochlamys、 Coronastrum^ 十字藻属(Crucigenia)、Crucigeniella^ 链枝藻属(Ctenocladus)、筒 藻属(Cylindrocapsa)、Cylindrocapsopsis^ 柱胞鼓藻(Cylindrocystis)、伞轴藻属 (Cymopolia)、囊球藻属(Cystococcus)、胞滴虫属(Cystomonas)、Dactylococcus^ 域 枝藻属(Dasycladus)、Deasonia、德氏藻属(Derbesia)、溢带藻属(Desmatractum)、栅 藻属(Desmodesmus)、Desmotetra、长剌藻属(Diacanthos)、双细胞藻属(Dicellula)、 双月藻属(Dicloster)、Dicranochaete、网绿藻属(Dictyochloris)、球网藻属 (Dictyococcus)、网球藻属(Dictyosphaeria)、胶网藻属(Dictyosphaerium)、泡双吸虫 属(Didymocystis) 、 Didymogenes^ Dilabifilum、双形藻ノ禹(Dimorphococcusノ 、复球虫属 (Diplosphaera)、竹枝藻属(Draparnaldia)、杜氏藻属、孔壳藻属(Dysmorphococcus)、棘 鞘藻属(Echinocoleum)、纺锤藻属(Elakatothrix)、Enallax、内枝藻属(Entocladia)、 Entransia、独球藻偶(Eremospnaera)、Ettlia、全球藻属(Eudorina)、Fasciculochloris、 Fernandinella、Follicularia、Fottea、披外ij 藻厲(Franceia)、Friedmannia、费氏藻 属(Fritschiella)、Fusola、双胞藻属(Geminella)、圆球藻属(Gloeococcus)、胶囊藻 属(Gloeocystis)、Gloeodendron、胶胞藻属(Gloeomonas)、胶丝藻属(Gloeotila)、多 芒藻属(Golenkinia)、链瘤藻属(Gongrosira)、盘藻属(Gonium)、Graesiella、粒囊藻 )禹(branulocystis)、Gyorffiana^ 鞭キ!藻(Haematococcus)、Hazenia、Helicodictyon^ Hemichloris、Heterochlamydomonas、弁キ！藻 ノ禹(Heteromastix)、Heterotetracystis^ Hormidiospora、链丝藻属(Hormidium)、皮襟藻属(Hormotila)、Hormotilopsis、透明球0 0 (PandOrina) >雄%^|1(ParadOXia) λ 雜雜PjS (ParietOChlOriS) λ El^FPpll(PaSCherina) λ Paulschulzi ^apll(PeCtOdiCtyOn) λ _ MΡΙ1(PediaStrUm) λ 諸猶|1(PedinOmOnaS) λ pedin〇per ^_pll(PerCUrSaria) Λ>Μ^ΡjS (PhaCOtUS) λn^pll(PhaeOPhila) λ PhysocytiunK Pilin 絲隊猶 jS (PlanCtOnema) λ4 VH妹031(PlanktOSPhaeria) λ 澤猶 _ (PlatydOrina) ΛΜΡΜ(PlatymOnaS) Λ^νΗ妹P31(PleOdOrina) λ Pleurastrunu Iij 襟ΡΙ1(PleuroCOCCUS) λ ploeotil ^ M 031(POlyedriOPSiS) λ Polyphys 對猶|1(POlytOma) λ Polytomell 雜羅猶Si(PraSinOCladUS) λ Prasiococcusv 铜兩猶|1(PrOtOderma) ΛΜΗ _31(PrOtOSiPhOn) λpseudendocloniopsis> PseudocharacimiK VH妹擬 iS (PseudOChlOrella) λ 0§VH^b_ M (psCDudochlorococcum) λ psCDud〇c〇cc〇myxa> psCDud〇dicty〇sphaCDrium>psCDudodidymocystisy ^ M ^ 0 0 (psCDudokirchnCDriCDlla) λ psCDudoplCDurococcusypsCDudoschizomCDrisy psCDudoschroCDdCDriay psCDudostichococcusy psCDudotCDtracystisyPSeUdOtetradrOrK )^Η ρ31(PSeUdOtrebOUXia) ΛΜΙΜpll(PterOmOnaS) λpulchrasphaer ^^pll(PyramimOnaS) ΛΛΦΡ_>^锻猶_ (QUadrigUla) λ 縱隊猶31(RadiOfilUm) λ 縱襟pll(RadiOSPhaera) λ Raphidocel is >^隊猶31(RaPhidOnema) λI aphid〇nem〇psisy 擬 M (RhiZOClOniUm) λ Rhopalosoleru SaPIOChaetey s.^iIJ 0m(SCenedeSmUS) λ 猶^猶 jS (SChiZOChlamyS) λ 猶炼猶 jS (SChiZOmeriS) λ^逮猶 jS(schroCDdCDria) λ schroCDdCDriCDllay scotiCDllopsisy (sidCDrocystopsis) λ擬M (SiphOnOCladUS) Λι #0 擬M (SirOgOniUm) 擬M (SOraStrUm) >spermatozopsis>*H_pll(SPhaerella)) Sphaerellocystisv VH妹猶 (SphaerellOPSiS) ΛνΗ妹 猶|1(SPhaerOCyStiS) 親M (SPhaerOPlea) λ(SPirOtaenia) λ spongiochloris>spongiococcunK stephan〇ptera> stephan〇sphaera> 册擬 iS (StigeOClOniUm) λa^pM(StrUVea) λ 猶^鄉猶31(TetmemOrUS) λ Tetrabaen TetracystisvH潘0Si(TetradeSmUS) λ H 油猶 iS (TetraedrOn) λ η^ ριι(TetrallantOS) λ H 土猶(TetraSelmiS) λη^ριι(TetraSPOra) λημρμ(TetraStrUm) yHmpjs (TreUbaria) λTriplosrosv識猶31(TrOChiSCia) λ Trochisciopsisv^激(UlVa) λ M 隊 _μ(UrOnema) -0000 (ValOnia) Λ^ΡΜ(ValOniOPSiS) ΛνΗ妹 猶 jS (VentriCaria) λViridiella、Vitreochlamys、团藻属、Volvulina、韦斯藻属(Westella)、Willea、 Wislouchiella、虫绿藻(Zoochlorella)、拟双星藻属(Zygnemopsis)、圆丝鼓藻属 (Hyalotheca)、小球藻属、Pseudopleurococcum 和 Rhopalocystis。绿枝藻纲包括异 毛藻属(Heteromastix)、Mammella、Mantoniella、微单胞藻属(Micromonas)、肾藻 属(Nephroselmis)、虫毛球藻(Ostreococcus)、绿枝藻属(Prasinocladus)、青绿球藻 (Prasinococcus)、Pseudoscourfielda、密球藻(Pycnococcus)、塔胞藻属、Scherffelia。 平藻纲包括Marsupiomonas、柄胞藻属(Pedinomonas)、Resultor。四胞藻纲包括虚幻球藻 属(Apatococcus)、Asterochloris、Auxenochlorella、小球藻属、胶球藻属(Coccomyxa)、 鼓球藻(Desmococcus)、Dictyochloropsis、Elliptochloris、Jaagiella、细链藻属 (Leptosira)、Lobococcus、Makinoella、小丛藻属(Microthamnion)、虫义形藻(Myrmecia)、 微球藻(Nannochloris)、卵囊藻属(Oocystis)、溪菜属(Prasiola)、Prasiolopsis、无绿 藻属、裂丝藻属(Stichococcus)、四球藻属(Tetrachlorella)、共球藻属(Trebouxia)、 Trichophilus、Watanabea和蚁形藻。石药纲包括Acrochaete、羽藻属(Bryopsis)、头霉藻 属(Cephaleuros)、Chlorocystis、將苔属(Enteromorpha)、拟胶丝藻属(Gloeotilopsis)、 Halochlorococcum、嚎壳藻属(Ostreobium)、Pirula、黑抱藻属(Pithophora)、 Planophila、Pseudendoclonium、橘色藻属(Trentepohlia)、Trichosarcina、丝藻属 (Ulothrix)、Bolbocoleon、Chaetosiphon、Eugomontia、Oltmannsiellopsis、巾白氏藻属 (Pringsheimiella)、Pseudodendroclonium、Pseudulvella、Sporocladopsis、尾抱藻属 (Urospora)和 Wittrockiella。红藻门包括顶丝藻属(Acrochaetium)、Agardhiella、对丝藻属(Antithamnion)、 拟对丝藻属(Antithamnionella)、星孢藻属(Asterocytis)、旋毛藻属(Audouinella)、 巴尔比亚藻属(Balbiania)、红毛菜属(Bangia)、串珠藻属(Batrachospermum)、桕桉藻 属(Bonnemaisonia)、卷枝藻属(Bostrychia)、絹丝藻属(Callithamnion)、庶| 聘菜属 (Caloglossa)、仙菜属(Ceramium)、环节藻属(Champia)、色指藻属(Chroodactylon)、 色盒藻属(Chroothece)、弯枝藻属(Compsopogon)、拟弯枝藻属(Compsopogonopsis)、 丝福藻属(Cumagloia)、蓝色藻属(Cyanidium)、Cystoclonium、域线藻属(Dasya)、海 人草(Digenia)、Dixoniella、红枝藻属(Erythrocladia)、Erythrolobas、星丝藻属 (Erythrotrichia)、Flintiella、Galdieria、石花菜属(Gelidium)、Glaucosphaera、 角毛藻属(Goniotrichum)、江蓠属(Gracilaria)、蜈蚁藻属(Grateloupia)、凋毛藻 属(Griffithsia)、胭脂藻属(Hildenbrandia)、Hymenocladiopsis、沙菜属(Hypnea)、 Laingia、膜翼藻属(Membranoptera)、多条藻属(Myriogramme)、海索面属(Nemalion)、 Nemnalionopsis、Neoagardhiella、红皮藻(Palmaria)、育叶藻属(Phyllophora)、 Polyneura、多管藻属(Polysiphonia)、紫菜(Porphyra)、紫球藻属(Porphyridium)、 Pseudochantransia、鸡毛菜属(Pterocladia)、Pugetia、小红藻(Rhodella)、 Rhodochaete、红线藻属(Rhodochorton)、Rhodosorus、红胞藻属(Rhodospora)、红皮藻属 (Rhodymenia)、链孢藻属(Seirospora)、月芽藻属(Selenastrum)、连珠藻属(Sirodotia)、 红翔菜属(Solieria)、丛孢藻属(Spermothamnion)、篮子藻属(Spyridia)、柱丝藻属 (Stylonema)、拖拉藻属(Thorea)、Trailiella 和托氏藻属(Tuomeya)。隐藻门包括隐藻纲(Cryptophycease)。更具体地，Campylomonas、唇滴虫属(Chilomonas)、蓝隐藻属(Chroomonas)、隐金藻属(Cryptochrysis)、隐藻属(Cryptomonas)、环滴虫属(Goniomonas)、Guillardia、Hanusia、半片藻(Hemiselmis)、斜片藻(Plagioselmis)、Proteomonas、Pyrenomonas、红胞藻属(Rhodomonas)和Stroreatula0绿变形藻门包括绿蜘藻属(Chlorarachnion)、Lotharella和地锦属(Chattonella)0 定鞭藻门包括顶丝藻属(Apistonema)、金色藻属(Chrysochromulina)、石灰质鞭毛虫目(Coccolithophora)、CorcontochrysisΛ 球隹丐板藻属(Cricosphaera)、Diacronema、球石藻(Emiliana)、巴夫藻(Pavlova)、卢氏藻属(Ruttnera)、十盾藻(Cruciplacolithus)、黄藻鞭毛虫属(Prymnesium)、等鞭金藻属(Isochrysis)、帽球藻属(Calyptrosphaera)、Chrysotila、I丐板金藻属(Coccolithus)、金藻属(Dicrateria)、异弯藻(Heterosigma)、膜胞藻属(Hymenomonas)、Imantonia、桥石藻属(Gephyrocapsa)、掠鞭藻属(Ochrosphaera)、掠囊藻属(Phaeocystis)、扁金藻属(Platychrysis)、Pseudoisochrysis、条结藻属(Syracosphaera)和颗石藻(Pleurochrysis)。裸藻门包括stasia、柄裸藻属(Colacium)、长梭藻属(Cyclidiopsis)、多形藻属(Distigma)、裸藻属(Euglena)、双鞭藻属(Eutreptia)、异双鞭裸藻(Eutreptiella)、螺肋藻属(Gyropaigne)、Hyalophacus、卡克藻属(Khawkinea)、变胞藻属(Astasia)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、月藻属(Menoidium)、Parmidium、扁裸藻属(Phacus)、杆胞藻属(Rhabdomonas)、Rhabdospira、Tetruetreptia 和囊裸藻属(Trachelomonas)。不等鞭毛门包括娃藻纲(Bacillariophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、海金藻纲(Pelagophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)、黄群藻纲(Syanurophyceae)、褐枝藻纲(Phaeothamniophyceae)和针胞藻纲(Raphidophyceae)。更具体地、娃藻纲包括曲壳藻属(Achnanthes)、双眉藻属(Amphora)、角毛藻属(Chaetoceros)、棍形藻属(Bacillaria)、菱形藻属(Nitzschia)、舟形藻属(Navicula)和羽纹藻属(Pinnularia)。褐藻纲包括囊翼藻(Ascoseira)、Asterocladon、Bodanella、酸藻属(Desmarestia)、鞭藻属(Dictyocha)、网地藻属(Dictyota)、水云属(Ectocarpus)、海翅藻属(Halopteris)、鸾壳藻属(Heribaudiella)、侧枝藻属(Pleurocladia)、Porterinema、间囊藻属(Pylaiella)、聚果藻属(Sorocarpus)、狭果藻属(Spermatochnus)、黑顶藻属(Sphacelaria)和Waerniella。海金藻纲包括金球藻属(Aureococcus)、Aureoumbra、Pelagococcus、Pelagomonas、Pulvinaria 和 Sarcinochrysis0 黄藻纲包括 Chloramoebalesλ 根黄藻目(Rhizochloridales)、柄球藻目(Mischococcales)、黄丝藻目(Tribonematales)和无隔藻目(Vaucheriales)。真眼点藻纲包括小绿藻属(Chloridella)、捕圆藻属(Ellipsoidion)、真眼点藻属(Eustigmatos)、Monodopsis、蒜头藻属(Monodus)、微绿球藻(Nannochloropsis)、多角藻属(Polyedriella)、Pseudocharaciopsis、Pseudostaurastrum 和紲夏藻属(Vischeria)。黄群藻纲包括奇异单胞菌属(allomonas)、黄群藻属(Synura)和Tessellaria。褐枝藻纲包括haeobotrys和金枝藻属(Phaeothamnion)。针胞藻纲包括滑盘藻(Olisthodiscus)、周泡藻属(Vacuolaria)和针胞藻(Fibrocapsa)。娃藻门包括扭鞘藻(Bolidophyceae)、圆筛藻(Coscinodiscophyceae)、甲藻纲(Dinophyceae)和 Alveolates。扭鞘藻包括 Bolidomonas、金藻纲(Chrysophyceae)、 Giraudyopsis、Glossomastix、色植藻属(Chromophy ton)、金变形藻属(Chrysamoeba)、 Chrysochaete、Chrysodidymus、Chrysolepidomonas、金颗藻属(Chrysosaccus)、金球 藻属(Chrysosphaera)、Chrysoxys、环胞藻属(Cyclonexis)、维囊藻属(Dinobryon)、 附金藻属(Epichrysis)、附钟藻属(Epipyxis)、Hibberdia、金瓶藻属(Lagynion)、鳞 金藻属(Lepochromulina)、单胞菌属(Monas)、单鞭金藻属(Monochrysis)、近囊胞藻属 (Paraphysomonas)、掲盘藻属(Phaeoplaca)、Phaeoschizochlamys、Picophagus、颗石藻、粘 胶藻属(Stichogloea)和福尾藻属(Uroglena)。圆筛藻包括福杆藻属(Bacteriastrum)、中 鼓藻属(Bellerochea)、盒形藻属(Biddulphia)、Brockmanniella、环毛藻属(Corethron)、 圆筛藻属(Coscinodiscus)、弯角藻属(Eucampia)、无管眼藻属(Extubocellulus)、 几内亚藻属(Guinardia)、旋鞘藻属(Helicotheca)、细柱藻属(Leptocylindrus)、 Leyanella、石丝藻属(Lithodesmium)、直链藻属(Melosira)、小盘藻属(Minidiscus)、 齿状藻属(Odontella)、漂流藻属(Planktoniella)、柄链藻属(Porosira)、鼻状 藻属(Proboscia)、根管藻属(Rhizosolenia)、星心藻属(Stellarima)、海线藻属 (Thalassionema)、Bicosoecid、Symbiomonas、福环藻属(Actinocyclus)、双眉藻属、弧眼藻 属(Arcocellulus)、短棘藻属(Detonula)、等片藻属(Diatoma)、双尾藻属(Ditylum)、脆杆 藻纲(Fragilariophyceae)、拟星杆藻属(Asterionellopsis)、具槽藻属(Delphineis)、斑 条藻属(Grammatophora)、微壳藻属(Nanofrustulum)、针杆藻属(Synedra)和 Tabularia。 沟鞭藻科(Dinophyceae)包括Adenoides、亚历山大藻属(Alexandrium)、前沟藻属 (Amphidinium)、角藻属(Ceratium)、角甲藻属(Ceratocorys)、库里亚藻属(Coolia)、 隐甲藻属(Crypthecodinium)、卵甲藻属(Exuviaella)、似翼藻属(Gambierdiscus)、 膝沟藻属(Gonyaulax)、裸甲藻属(Gymnodinium)、环沟藻属(Gyrodinium)、异冒藻 属(Heterocapsa)、下沟藻属(Katodinium)、舌甲藻属(Lingulodinium)、费氏藻 属(Pfiesteria)、极地藻属(Polarella)、原角藻属(Protoceratium)、梨甲藻属 (Pyrocystis)、斯氏藻属(Scrippsiella)、共生藻属(Symbiodinium)、Thecadinium、胸 甲球藻属(Thoracosphaera)和虫黄藻属(Zooxanthella)。Alveolates包括胞甲藻属 (Cystodinium)、薄甲藻属(Glenodinium)、尖尾藻属(Oxyrrhis)、多甲藻属(Peridinium)、 原甲藻属(Prorocentrum)和网甲藻属(Woloszynskia)。培养微生物的方法和生物反应器通常为了进行遗传操纵和随后产生碳氢化合物(如脂质、脂肪酸、醛类、醇类和烷 烃)的两种目的培养微生物。前一类型培养通常以小规模进行，至少最初在起始微生物能 够生长的条件下进行。为产生碳氢化合物目的的培养通常以大规模进行。优选地，存在固 定碳源(如原料)。有时或所有时间，培养物还可暴露于光。生物反应器微藻可在液体培养基中培养。培养物可被容纳于生物反应器中。微藻还可在包含 固定碳源并允许光照射细胞的光生物反应器中培养。微藻细胞对光的暴露，即使在细胞运 输和利用的固定碳源存在下，与在黑暗中培养细胞相比能加速生长。可操纵培养条件参数 以优化总的碳氢化合物产生、产生的碳氢化合物物质的组合、和/或碳氢化合物物质的产 生。
图I是本发明生物反应器的一个实施方案。在一个方面，生物反应器是光生物反应器。在一个方面，生物反应器系统可用于培养微藻。生物反应器系统可包括容器和照射部件，其中照射部件可操作地耦合于容器。在一个方面，生物反应器是用于工业发酵工艺的发酵罐。
在一些实施方案中，生物反应器包括装备有例如控制通气、搅拌速率、温度、pH和其他感兴趣的参数的量测仪器(gauge)和配置(setting)的玻璃、金属或塑料罐。通常所述量测仪器和配置可操作地耦合于生物反应器。在一个方面，生物反应器可足够小地用于实验室应用(5-10L或更小)，或容量高达120，000L或更大以用于大规模工业应用。在一些实施方案中，生物反应器系统可包括一个光漫射结构(light-diffusingstructure)或多个光漫射结构。在一些实施方案中，来自多个光漫射结构的一个或多个光漫射结构沿着生物反应器的内表面定位。在一些实施方案中，光漫射结构可操作地耦合于生物反应器。生物反应器系统可包括一个或多个光纤和/或多个光源和/或一个光源。在一些实施方案中，一个或多个光纤安装在保护性和透光的光照结构(lighting structure)中。在一些实施方案中，光纤可操作地耦合于生物反应器。在一些实施方案中，光源可操作地耦合于生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器系统可包括可操作地耦合于生物反应器的光照结构。在本文的某些实施方案中，光照结构可具有将光信号导向生物反应器内部的任何形状或形式。生物反应器系统还可包括从一个或多个光纤的至少一个的第一端伸向太阳能集热器部分的至少一个光纤。在一些实施方案中，太阳能集热器可操作地耦合于生物反应器。光纤可适合于将太阳能集热器光学地耦合于生物反应器。光纤可光学地耦合(直接或间接)于太阳能集热器。在一些实施方案中，生物反应器系统包括可操作地耦合于生物反应器的多个光源。多个光源可包括多个LED。包括多个LED的多个光源可以是可操作的以向生物反应器供应全光谱或特定波长的人造光。在一个实施方案中，LED安装在保护性和透光的光照结构中。在一个实施方案中，LED是LED阵列。在一些实施方案中，微藻可在由不同类型的透光或半透光材料制成的封闭生物反应器中生长和维持。这样的材料可包括Plexiglass 密闭室、玻璃密闭室、由诸如聚乙烯的物质制成的袋、透光或半透光管道、和其他材料。微藻可在开放生物反应器诸如跑道式池塘(raceway pond)、沉降池塘(settling pond)、和其他非封闭容器中生长和维持。可操纵使微生物如微藻生长的生物反应器的气体含量。生物反应器的部分容积可包含气体而不是液体。进气口可用于将气体泵入生物反应器。任何气体可泵入生物反应器，包括空气、空气/O2混合物、稀有气体诸如氩气及其他。还可操纵气体进入生物反应器的速率。增加气体流入生物反应器增加微藻培养物的浊度。在指定气体流速时，传输气体进入生物反应器的口的位置也可影响培养物的浊度。可调整空气/O2混合物以便为特定生物体最大生长产生最佳O2量。在光下，微藻在例如3% 02/97%空气中比在100%空气中生长显著加快。3% 02/97%空气比空气中的O2多大约100倍。例如，约99. 75%空气O. 25% O2,约 99. 5%空气O. 5% O2、约 99. 0%空气I. 00% O2、约 98. 0%空气2. 0% O2、约 97. 0%空气3. 0% O2、约96. 0%空气4.0% O2、和约95. 00%空气5.0% O2的空气O2混合物可被注入生物反应器或生物反应器。还可利用装置诸如旋转叶片和叶轮、摇动培养物、搅拌棒、注入加压气和其他仪器对微藻培养物进行混合。生物反应器 可具有允许气体、固体、半固体和液体进入容纳微藻的室的口。口通常连接于管道或其他输送物质的装置。例如，气口输送气体进入培养物。向生物反应器泵入气体可用于向细胞供应O2和其他气体并对培养物通气从而产生浊度。随着改变气口的数目和位置，培养物浊度的量改变。例如，气口可沿着圆柱形聚乙烯袋的底部放置。当向空气加入O2并充入生物反应器时微藻生长加快。生物反应器优选地具有允许培养基进入的一个或多个口。不必只有一种物质进入或离开口。例如，口可用于培养基流入生物反应器，然后随后可用于取样、气体进入、气体离开、或其他目的。在一些情形中，生物反应器在培养开始时充入培养基，在接种培养物后不再注入生长培养基。换言之，微藻生物质在含水培养基中培养一段时间，在此期间微藻繁殖并增加数目；然而大量含水培养基在此时间段不流经生物反应器。因此在一些实施方案中，含水培养基在接种后不流经生物反应器。在其他情形中，培养基可在微藻繁殖和增加数目的时间段内流经生物反应器。在一些实施方案中，培养基在接种后但在细胞达到期望密度之前注入生物反应器。换言之，直到达到所述微藻期望的数目增加才保持气体进入和培养基进入的湍流状态用于微藻繁殖。生物反应器优选地具有允许气体进入的一个或多个口。气体可用于提供营养诸如O2以及提供培养基中的扰动。扰动可通过在含水培养基水平下设置气体入口从而进入生物反应器的气体向培养物表面鼓泡而实现。一个或多个气体出口允许气体逸出，从而阻止生物反应器中压力积聚。优选地气体出口引向阻止污染性微生物进入生物反应器的“单向”阀。在一些情形中，细胞在生物反应器中培养一段时间，在此期间微藻繁殖并增加数目，然而由气体进入导致的主要遍及培养基的带有湍流涡漩的湍流状态不在全部时间段保持。在其他情形中，由气体进入导致的主要遍及培养基的带有湍流涡漩的湍流状态可在微藻繁殖和增加数目的全部时间段保持。在一些情形中，生物反应器的规模与涡漩规模之间的预先确定比例范围不在微藻繁殖和增加数目的时间段保持。在其他情形中，可保持这样的范围。生物反应器优选地具有可用于对培养物取样的至少一个口。优选地取样口可重复地使用而不改变损害培养物的无污染性质。取样口可配置允许样品流停止和开始的阀或其他装置。可选地取样口可允许持续取样。生物反应器优选地具有允许接种培养物的至少一个口。这样的口也可用于其他目的诸如培养基或气体进入。在一个实施方案中，带有光照系统的生物反应器可用于从葡萄藻属产生碳氢化合物。葡萄烃(botryococcenes)是无支链的类异戍二烯三職类,具有式CnH2n_1(l。A品系(race)产生二烯烃和三烯烃(脂肪酸衍生物)，其中η是奇数23至31。B品系产生葡萄烃，其中η在30至40的范围中。这些烃可以是精选用于加氢裂化为汽油型碳氢化合物的生物燃料。培养基微藻培养基通常包含组分诸如固定氮源、微量元素、任选地用于保持pH的缓冲齐U、和磷酸盐。其他组分可包括固定碳源诸如乙酸盐或葡萄糖，和盐诸如氯化钠，尤其是用于海水微藻。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钥，分别处于例如ZnCl2、Η3Β03、CoCl2. 6H20、CuCl2. 2H20、MnCl2. 4H20 和(NH4) 6Μο7024· 4H20 的形式。对于能够在固定碳源上生长的生物体，固定碳源可以是，例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰氨基葡萄糖、甘油、弗罗里多苷、和/或葡萄糖醛酸。一种或多种碳源可以小于50 μ Μ、至少约50 μ Μ、至少约100 μ Μ、至少约500 μ Μ、至少约5mM、至少约50mM、至少约500mM、和多于500mM的浓度的一种或多种外源提供的固定碳源供应。一种或多种碳源可以培养基的小于1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31 %,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41 %,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%供应。一种或多种碳源也可以培养基的在以上给出的百分比之间的百分比供应，如，培养基的2. 5%或3. 7%。一些微生物天然生长在或可被改造以生长在为化合物的混杂来源的固定碳源诸如城市废物、二次处理污水、废水、和其他固定碳源和其他营养诸如硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐上。污水成分用作产生碳氢化合物的营养来源，且培养物提供碳氢化合物的廉价来源。还可操纵其他培养参数，诸如培养基pH、微量元素的身份和浓度、和其他培养基组分。根据本发明方法可用的微生物见于遍及世界的多个位置和环境。由于微生物从其他物种分离及其所得的进化分歧的结果，用于最优生长和产生脂质和/或碳氢化合物组分的具体生长培养基可变化。在一些情形中，某些微生物藻种可能不能在具体生长培养基上生长，因为存在一些抑制性组分或不存在特定微生物藻种所需的一些必需营养需求。固体和液体生长培养基通常可从多种来源获得，且制备适于多种微生物藻种的具体培养基的说明书可见于，例如在线地在德克萨斯大学奥斯汀分校为其藻类培养物保藏而维护的网址(UTEX)。可调整工艺条件以增加适于特定用途的脂质产量和/或减少生产成本。例如，在某些实施方案中，微生物(如微藻)培养在限制浓度的一种或多种营养诸如例如碳和/或氮、磷或硫的存在下，同时提供过量的固定碳能诸如葡萄糖。氮限制往往比其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量增加微生物脂质产量。在具体实施方案中，脂质产量的增加是至少约10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%或 500%。微生物可在限制量营养存在下培养持续总培养阶段的一部分或整个阶段。在具体实施方案中，营养浓度在总培养阶段中在限制浓度与非限制浓度之间循环至少两次。异养牛长和光微生物可在异养生长条件下培养，所述异养生长条件中固定碳源为生长和脂质聚积提供能量。用于微藻异养生长和繁殖的标准方法是已知的(参见例如Miao和Wu，JBiotechnology,2004,11 :85-93,以及 Miao 和 Wu，Biosource Technology(2006)97 841-846)。对于产生碳氢化合物而言，细胞，包括本文所述的本发明重组细胞，可以被大量培养或发酵。培养可在大液体体积中，诸如在作为实例的悬浮培养物中。其他实例包括以细胞的小量培养物开始，其扩增为大生物量，连同细胞生长和繁殖以及碳氢化合物产生。生物反应器或钢发酵罐可用于容纳大培养体积。生物反应器可包括发酵罐。类似啤酒和/或葡萄酒生产中使用的那些发酵罐的发酵罐可以是适合的，如乙醇生产中使用的极其大的发酵罐。发酵罐中提供适于培养的营养来源。这些包括诸如以下一种或多种的原材料固定碳源，诸如葡萄糖、玉米淀粉、解聚合的纤维素材料、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清或糖蜜；脂肪来源，诸如脂肪或植物油；氮源，诸如蛋白、大豆柏、玉米浆、氨(纯的或以盐形式)、硝酸酯或硝酸盐、或分子氮；和磷源，诸如磷酸盐。另外，发酵罐允许控制培养条件诸如温度、pH、氧张力和二氧化碳水平。任选地,可将气体组分如氧气或氮气充入液体培养物。其他淀粉(葡萄糖)来源诸如小麦、马铃薯、水稻和高粱。其他碳源包括过程流(process stream)诸如工业级甘油、黑液、有机酸类诸如乙酸、和糖蜜。碳源也可作为混合物提供，诸如蔗糖和解聚合的甜菜浆的混合物。可使用发酵罐以允许细胞进行其生长周期的各个时期。例如，可将产生碳氢化合物的细胞的接种物引入培养基，随后在细胞开始生长前是停滞阶段(停滞期)。停滞阶段之后，生长速率逐步增加并进入对数期或指数期。指数期转而随后是由于营养减少和/或毒性物质增加的生长减慢。在这一减慢后，生长停止，细胞进入静止期或稳定态，取决于对细胞提供的具体环境。本文公开的细胞的碳氢化合物产生可在对数期期间或其后发生，包括静止期，其中供应营养或营养仍然可获得以允许在不存在细胞分裂时碳氢化合物产生继续。优选地，利用本文所述和本领域已知的条件生长的微生物包括以重量计至少约20%的脂质、优选地以重量计至少约40%、更优选地以重量计至少约50%、最优选地以重量计至少约60%。在根据本发明的替代性异养生长方法中，微生物可利用解聚合的纤维素生物质作为原料来培养。纤维素生物质(如秸杆，诸如玉米秸杆)是廉价和容易获得的；然而，利用这一材料作为酵母原料的尝试失败了。具体地，已发现这样的原料抑制酵母生长，且酵母不能利用从纤维素材料产生的5碳糖(如，来自半纤维素的木糖)。相反，微藻可在加工的纤维素材料上生长。因此，本发明提供在纤维素材料和/或5碳糖存在下培养微藻的方法。适当的纤维素材料包括来自草本和木本能源作物、以及农作物的残留物，即未随主要食物或纤维产物从田地去除的植物部分，主要是茎和叶。实例包括农业废物诸如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、谷壳和穗轴)、麦杆、稻秸、甜菜浆、柑桔渣、柑桔皮；林业废物诸如硬木和软木间伐材(thinning)、和来自木料作业的硬木和软木残留物；木材废物诸如锯木废物(木片、锯屑)和纸浆废液；城市废物诸如城市固体废物的纸片、城市木质废物和城市绿色废物诸如城市割草；以及木质建筑废物。另外的纤维素材料包括专用的纤维素作物诸如柳枝稷、混合杨木和细叶芒(miscanthus)、纤维甘鹿(fiber cane)和纤维高粱(fiber sorghum)。从这样的材料产生的五碳糖包括木糖。在根据本发明的又另一替代性异养生长方法中，该方法本身可任选地与上述方法联合使用，例如从甘蔗或甜菜产生的蔗糖用作原料。异养生长可包括使用光和固定碳源以使细胞生长并产生碳氢化合物。异养生长可在光生物反应器中进行。生物反应器可暴露于一个或多个光源以便为微藻提供光信号。光信号可经由被光源导向生物反应器表面的光提供。优选地，光源提供使细胞足以生长的强度，但不会太强以导致氧化损伤或导致光抑制响应。在一些情形中，光源具有模拟或大致模拟太阳波长范围的波长范围。在其他情形中，使用不同波长范围。生物反应器可放置在允许日光照射表面的室外或温室中或其他设施中。在一些实施方案中，对葡萄藻属物种的光子强度是25至500 μ mE nT2s-1 (参见例如 Photosynth Res. 2005June ;84 (1-3) :21_7)。可操纵照射微藻细胞培养物的光子数目、以及其他参数，诸如波长、光谱和每天黑暗光照小时比例。微藻还可在自然光、以及自然光和人造光的同时和/或交替组合下培养。例如，微藻可白天在自然光下，夜间在人造光下培养。 在本发明的一个方面，微生物暴露于生物体光合作用所需光辐照的约O. 1%至约I %、优选地光合作用所需光辐照的约O. 3%至约O. 8 %。典型的光辐照可以是O. 1-300 μ mo I 光子 JiT2S'包括小于 O. 1,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51 至 99、100、101至149、150、151至199、200、201至249、250、或大于250 μ mo I光子nT2s'光辐照可以是约 O. 01-1 μ mo I 光子 m 2S \ 优选地 1-10 μ mo I 光子 m 2S \ 或 10-100 μ mo I 光子 m 2S \ 或100-300 μ mo I光子IiT2S'或100-300 μ mol光子IiT2S'还包括在上述光福照之间的光福照，如 I. I、2. I、2. 5 或 3. 5 μ mol 光子 m 2S L在一个方面，可使用不同光谱(如360-700nm)。光谱可以是小于300、300、350、400、450、500、550、600、650、700、或750nm或更大。还包括在上述光谱之间的光谱，如360或 440nmo在一个实施方案中，光照可以持续方式施加。在另一个实施方案中，光照可以周期模式施加，其具有适当的光照时间，包括但不限于12h光照12h黑暗或16h光照8h黑暗。光照模式可包括小于 1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或 24h 的光和 / 或小于 I、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23小时(h)的黑暗。还包括在上述光照模式之间的光照模式，如7. 5h的光照或7. 5h的黑暗。在一个实施方案中，光照可以是被太阳能集热器收集的自然日光，并经由光纤被传输到生物反应器内部。在另一个实施方案中，人造光，诸如发光二极管(LED)或荧光灯可用作光源。在另一个实施方案中，自然日光和人造光可一起使用。在一个实施方案中，光照是全光谱的光。在另一个实施方案中，光照是特定波长的光或经特定滤光器传输的一定范围光谱的光。回收脂质和碳氢化合物的方法本发明细胞产生的碳氢化合物(如，脂质、脂肪酸、醛类、醇类和烷烃)可通过任何常规手段收获，或以其他方式收集。例如，可离心细胞分泌的碳氢化合物以使疏水层中的碳氢化合物与水层中的污染物和任选地与离心后作为沉淀物的任何固体材料分离。含有材料的细胞或细胞级分可在离心前或离心后用蛋白酶处理以降解污染性蛋白。在一些情形中，污染性蛋白与碳氢化合物或在除去蛋白后形成碳氢化合物的碳氢化合物前体缔合，可能是共价地缔合。在其他情形中，碳氢化合物分子在还包含蛋白的制品中。可将蛋白酶加入包含蛋白的碳氢化合物制品以降解蛋白(例如，可使用来自灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的蛋白酶(Sigma Aldrich目录号P5147)。消化后,优选地从剩余蛋白、肽片段和氨基酸纯化碳氢化合物。这一纯化可例如通过以上所列的方法诸如离心和过滤实现。
细胞外碳氢化合物还可通过如下方式从随后返回生物反应器的活微藻细胞体内提取通过在另外无菌的环境中将细胞暴露于无毒的提取溶剂，随后分离活细胞与提取溶剂的疏水级分和碳氢化合物，其中分离的活细胞随后返回培养容器诸如不锈钢发酵罐或光生物反应器(参见 Biotechnol Bioeng. 2004Dec. 5 ；88(5) :593-600 和 BiotechnolBioeng. 2004Mar. 5 ；85(5) :475-81) 。碳氢化合物还可通过全细胞提取来分离。首先破裂细胞，然后可诸如通过使用如上述的离心从全细胞团收集细胞内碳氢化合物和细胞膜/细胞壁-关联的碳氢化合物以及细胞外碳氢化合物。用于从以上方法产生的细胞溶胞产物分离碳氢化合物和脂质的多种方法是可获得的。例如，碳氢化合物可以用疏水溶剂诸如己烧提取(参见Frenz等.1989, EnzymeMicrob. Technol.，11 :717)。碳氢化合物还可利用液化(参见例如Sawayama等.1999,Biomass and Bioenergy 17 :33-39, 和 Inoue 等.1993, Biomass Bioenergy 6(4)269-274);油液化(参见例如 Minowa 等· 1995，Fuel 74(12) :1735-1738);和超临界 CO2 萃取(参见例如 Mendes 等.2003, Inorganica Chimica Acta 356 :328-334)来提取。Miao和Wu描述了从培养物回收微藻脂质的一种实验方案，其中通过离心收获细胞，用蒸馏水洗涤并通过冻干干燥细胞。用电机(mortor)粉碎所得的细胞粉末，随后用正己烧提取。Miao 和 Wu, Biosource Technology (2006)97 :841_846。溶解细胞在一些实施方案中，微生物中产生的细胞内脂质和碳氢化合物在溶解微生物细胞后被提取。在提取后，脂质和/或碳氢化合物可被进一步精炼以产生例如油、燃料或油脂化
^ 口
PFt ο培养完成后，可从发酵液分离微生物。任选地，分离通过离心产生浓的糊状物来实现。离心不从微生物去除大量的细胞内水并且不是干燥步骤。然后生物质可用洗涤溶液(如DI水)洗涤以去除发酵液和碎片。任选地，还可在细胞破裂前干燥(烤箱干燥、冻干等等)洗涤过的微生物生物质。可选地，细胞可在完成发酵时不与一些或所有的发酵液分离的情况下被溶解。例如，当溶解细胞时，细胞可以是小于I : Iv V细胞比细胞外液体的比例。可溶解包含脂质和/或碳氢化合物的微生物以产生溶胞产物。如本文详述的，溶解微生物(也称为溶胞)的步骤可通过任何常规手段实现，包括热引起的溶胞、加入碱、力口入酸、利用酶诸如蛋白酶和多糖降解酶诸如淀粉酶、利用超声、机械溶胞、利用渗透压休克、以溶胞病毒感染、和/或表达一种或多种溶胞基因。进行溶胞以释放已被微生物产生的细胞内分子。用于溶解微生物的这些方法的每一种可作为单个方法使用或同时或顺序地组合使用。细胞破坏的程度可通过显微镜分析观察。利用本文所述的一种或多种方法，观察到通常多于70%的细胞破裂。优选地，细胞破裂多于80%、更优选地多于90%、以及最优选地约100%。在具体实施方案中，微生物在生长后被溶解，例如来增加细胞脂质和/或碳氢化合物的暴露以用于提取或进一步加工。可调整脂酶表达(如，经由诱导型启动子)或溶胞的时机以优化脂质和/或碳 氢化合物的产率。以下描述多种溶胞技术。这些技术可单独或组合使用。热引起的溶胞在本发明的优选实施方案中，溶解微生物的步骤包括加热包含微生物的细胞悬液。在这一实施方案中，加热包含微生物的发酵液(或从发酵液分离的微生物的悬液)直到微生物，即微生物的细胞壁和细胞膜降解或破裂。通常，施加的温度是至少50°C。更高温度，诸如至少30 V、至少60 V、至少70 V、至少80 V、至少90 V、至少100°C、至少110°C、至少120°C、至少130°C或更高温度用于更有效地溶胞。通过热处理溶解细胞可通过煮沸微生物来进行。可选地，热处理(不煮沸)可在高压灭菌器中进行。可冷却热处理的溶胞产物用于进一步处理。细胞破坏还可通过蒸汽处理进行，即，通过加入加压蒸汽。用于破坏细胞的微藻蒸汽处理描述在，例如，美国专利号6，750, 048中。利用碱溶胞在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤包括向包含微生物的细胞悬液加入碱。碱应足够强以水解所用微生物的至少一部分蛋白质化合物。可用于增溶蛋白的碱是化学领域已知的。可用于本发明方法的示例性碱包括但不限于，锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，及其混合物。优选的碱是Κ0Η。用于破坏细胞的微藻碱处理描述在，例如，美国专利号6，750, 048中。酸溶胞在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤包括向包含微生物的细胞悬液加入酸。酸溶胞可利用浓度为10-500nM或优选地40-160nM的酸实现。酸溶胞优选地在室温以上(如，在40-160，优选地50-130的温度)进行。对于中等温度(如，室温至100°C，尤其是室温至65度)，酸处理可有效地与声处理或其他细胞破坏方法组合。利用酶溶解细胞在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤包括通过利用酶溶解微生物。用于溶解微生物的优选的酶是蛋白酶和多糖降解酶，诸如半纤维素酶(如，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的半纤维素酶；Sigma Aldrich, St. Louis, Mo. ;#H2125)、果胶酶(如，来自根霉(Rhizopus sp.)的果胶酶；Sigma Aldrich, St. Louis, Mo. ;#P2401)、Mannaway 4. OL(Novozymes)、纤维素酶(如，来自绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素；Sigma Aldrich, St. Louis, Mo. ;#C9422)、和崩溃酶(如，来自担子菌(Basidiomycetessp.)的崩溃酶；Sigma Aldrich, St. Louis, Mo. ;#D9515)。
纤维素酶在本发明的优选实施方案中，用于溶解微生物的纤维素酶是任选地来自小球藻属(Chlorella)或小球藻属病毒(Chlorella virus)的多糖降解酶。蛋白酶蛋白酶诸如灰色链霉菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、列在Degradation ofPolylactide by Commercial Proteases (商业蛋白酶降解聚交酯)，Oda Y 等.，Journal ofPolymers and the Environment,第 8 卷，第 I 期，2000 年 I 月，pp. 29-32 (4)中的蛋白酶、以及其他蛋白酶可用于溶解微生物。可使用的其他蛋白酶包括Alcalase 2. 4FG(Novozymes)和 Flavourzyme IOOL(Novozymes)。组合 还可使用蛋白酶与多糖降解酶的任何组合，包括前述蛋白酶与多糖降解酶的任何组合。利用超声溶解细胞在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤通过利用超声，S卩，声处理进行。如此，细胞还可通过利用高频声波溶解。声波可用电子学方法产生并经金属尖端传输到适当地浓缩的细胞悬液。这一超声处理(或超声破碎)基于在细胞悬液中产生空腔而破坏细胞完整度。机械溶胞在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤通过机械溶胞进行。细胞可被机械地溶解并被任选地均质化以便于收集碳氢化合物(如脂质)。例如，加压破碎仪可用于经由限流孔阀(restricted orifice valve)泵入包含细胞的衆液。施加高压(达1500巴)，随后经由离开喷嘴瞬时膨胀。细胞破坏通过三种不同机制实现在阀上撞击，在孔中高液体剪切，和排出后的突然压力下降，导致细胞爆炸。该方法释放细胞内分子。可选地，可使用球磨机。在球磨机中，细胞在悬液中与小的研磨颗粒诸如微珠一起搅拌。细胞由于剪切力、微珠之间的研磨、以及和微珠碰撞而破裂。微珠破坏细胞以释放细胞内容物。细胞还可被剪切力破坏，诸如使用搅拌(诸如使用高速或Waring搅切器作为实例)、法式压滤壶(french press)、或甚至在弱细胞壁的情形离心，以破坏细胞。通过渗透压休克溶解细胞(溶胞)在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤通过施加渗透压休克进行。以溶胞病毒感染在本发明的优选实施方案中，溶解微生物的步骤包括以溶胞病毒感染微生物。已知溶解微生物的多种病毒适用于本发明，为具体微生物选择和使用具体溶胞病毒在本领域技术人员能力范围内。例如，绿草履虫(Parameciumbursaria)小球藻属病毒(Paramecium bursariachlorella virus) (PBCV-I)是在某些单细胞、真核小球藻属-样绿藻类中复制并溶解它们的一组(藻类脱氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、绿藻病毒属(Chlorovirus))大的、二十面体、形成嗜菌斑、双链DNA病毒的原型。因此，任何易感微藻可通过以适当的小球藻属病毒感染培养物来溶解。参见例如Adv. Virus Res. 2006 ;66 :293-336 ;Virology,1999Apr. 25；257(1) :15-23 ；Virology,2004Jan. 5 ；318(1) :214-23 ；NucleicAcids Symp. Ser. 2000 ； (44) :161-2 ；J. Virol. 2006March ；80(5) :2437-44 ；和 Annu. Rev.Microbiol. 1999 ；53 :447_94。自溶(溶胞基因的表达)在本发明另一优选的实施方案中，溶解微生物的步骤包括自溶。在这一实施方案中，遗传改造根据本发明的微生物以产生将溶解微生物的溶胞蛋白。这一溶胞基因可利用诱导型启动子表达，从而使细胞可首先在发酵罐中生长到期望密度，随后诱导该启动子表达溶胞基因以溶解细胞。在一个实施方案中，溶胞基因编码多糖降解酶。在某些其他实施方案中，溶胞基因是来自溶胞病毒的基因。因此，例如，来自小球藻属病毒的溶胞基因可在小球藻属诸如原始小球藻(C. protothecoides)的藻类细胞中表达。本文描述了关于表达脂酶基因的适当的表达方法。溶胞基因的表达优选地利用诱导型启动子进行，诸如在微藻中有活性的启动子，其被刺激诸如小分子的存在、光、热和其他刺激诱导。例如，参见 Virology 260,308-315(1999) ；FEMS Microbiology Letters180(1999)45-53 ；Virology 263,376-387(1999);和 Virology 230,361-368(1997)。
_7] 脂质和碳氢化合物的提取由本发明微生物产生的脂质和碳氢化合物可通过以有机溶剂提取来回收。在一些情形中，优选的有机溶剂是己烷。通常，有机溶剂直接加入到溶胞产物而不预先分离溶胞产物组分。在一个实施方案中，将由一种或多种上述方法产生的溶胞产物与有机溶剂接触持续足以允许脂质和/或碳氢化合物组分与有机溶剂形成溶液的时间段。在一些情形中，然后可进一步精炼溶液以回收特定的期望脂质或碳氢化合物组分。己烷提取方法是本领域公知的。加工脂质和碳氢化合物方法酶促改件由本文所述的细胞产生的碳氢化合物(如，脂质、脂肪酸、醛类、醇类和烷烃)可通过使用包括脂酶的一种或多种酶来改性。当碳氢化合物处于细胞的细胞外环境时，一种或多种酶可在如下条件下添加到该环境中其中酶改性碳氢化合物或完成其从碳氢化合物前体合成。可选地，在添加一种或多种催化剂诸如酶之前，碳氢化合物可部分地或完全地从细胞材料分离。这样的催化剂是外源添加的，且其活性在细胞外或体外发生。热和其他催化改件如本文所述的细胞体内产生或体外酶促改性的碳氢化合物可被任选地进一步以常规手段加工。加工可包括“裂化”以减少碳氢化合物分子的大小，从而增加氢碳比。催化和热裂化方法是碳氢化合物和甘油三酯油加工中常规使用的。催化方法包括使用催化齐U，诸如固体酸催化剂。催化剂可以是硅铝(Silica-alumina)或沸石，其导致碳-碳键的异种溶解的或不对称的破裂，产生碳阳离子和氢阴离子。这些反应性中间体然后经历重排或与另一碳氢化合物的氢转移。这些反应从而可再生中间体以导致自繁殖链机制。还可加工碳氢化合物以减少其中碳-碳双键或三键的数目，任选地减少至零。还可加工碳氢化合物以除去或消除其中的环或环状结构。还可加工碳氢化合物以增加氢碳比。这可包括添加氢(“氢化”)和/或将碳氢化合物“裂化”为较小的碳氢化合物。 热方法包括使用高温和压力来减少碳氢化合物的大小。可使用约800°C的高温和约700kPa的压力。这些条件产生“轻的”，该术语有时用来指富含氢的碳氢化合物分子(与光子通量区别开)，同时还通过缩合产生相对消耗氢的较重的碳氢化合物分子。这一方法提供均裂的或对称的破裂并产生烯烃，可任选地如上所述用酶促方法使烯烃饱和。催化方法和热方法在碳氢化合物加工和油精炼的工厂中是标准的。如此可经由常规手段收集并加工或精炼由如本文所述的细胞产生的碳氢化合物。参见Hillen等· (Biotechnology and Bioengineering,第 XXIV 卷193-205 (1982))对加氢裂化微藻产生的碳氢化合物的报告。在替代性实施方案中，用另一催化剂诸如有机化合物、热和/或无机化合物处理该级分。对于将脂质加工为生物柴油，使用如本文IV部分描述的酯交换工艺。由本发明方法产生的碳氢化合物可用于多种工业应用。例如，使用通常包括10-14个碳原子的链的碳氢化合物产生直链烷基苯磺酸盐(LAS)，这是一种用在几乎所有类型去垢剂和清洁制品中的阴离子表面活性剂。参见，例如，美国专利号6，946，430 ;5，506，201 ；6，692，730 ;6，268，517 ;6，020，509 ;6，140，302 ;5，080，848 ；和 5，567，359。表面活性剂 诸如LAS，可用于制造个人护理组合物和去垢剂，诸如美国专利号5，942，479 ;6，086，903 ；5，833，999 ;6，468，955 ;和 6，407，044 中所述的那些。产生适于用在柴油车辆和喷气发动机中的燃料的方法日益增加的兴趣指向在燃料诸如生物柴油、可再生柴油和喷气燃料中使用生物来源的碳氢化合物组分，因为可代替来源于化石燃料的起始材料的可再生生物起始材料是可获得的，且其使用是期望的。对从生物材料产生碳氢化合物组分的方法存在需求。本发明通过提供利用由本文所述方法产生的脂质作为产生生物柴油、可再生柴油和喷气燃料的生物材料产生生物柴油、可再生柴油和喷气燃料的方法满足了这一需求。传统的柴油燃料是富含石蜡族碳氢化合物的石油馏出物。它们具有宽达370至780F的沸腾范围，这适于在压燃式发动机诸如柴油发动机车辆中燃烧。美国材料试验协会(The American Society of Testing and Materials, ASTM)按照沸腾范围以及其他燃料特性诸如十六烷值、浊点、闪点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、灰分含量、铜带腐蚀和残炭的容许范围建立了柴油的分级。技术上，满足适当的ASTM规格的来源于生物质的任何碳氢化合物馏出物材料或其他材料可定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)或生物柴油(ASTM D6751)。在提取后，可对从本文所述的微生物生物质回收的脂质和/或碳氢化合物组分进行化学处理以制造用于柴油车辆和喷气发动机的燃料。生物柴油生物柴油是一种取决于生产原料而使颜色在金色与深棕色之间变化的液体。它与水几乎不可混溶，具有高的沸点和低的蒸汽压。生物柴油是指用于柴油发动机车辆的与柴油等价的加工燃料。生物柴油是生物可降解和无毒的。生物柴油超过常规柴油燃料的另外的益处是较低的发动机磨损。通常，生物柴油包括C14-C18烷基酯。多种工艺将生物质或如本文所述产生和分离的脂质转化为柴油燃料。优选的产生生物柴油的方法是借助如本文所述的脂质的酯交换。优选的用作生物柴油的烷基酯是甲基酯或乙基酯。由本文所述方法产生的生物柴油可单独使用，或在最新式柴油发动机车辆中与常规柴油燃料以任何浓度混合。当与常规柴油燃料(石油柴油)混合时，生物柴油可以从约O. 1%至约99. 9%存在。世界许多地方使用称为“B”因子的系统来指明任何燃料混合物中生物柴油的量。例如，包含20%生物柴油的燃料标为B20。纯的生物柴油称为B100。生物柴油还可用作家用和商业锅炉中的加热燃料。现有的燃油锅炉可能包含橡胶部分，且可能需要转换以用生物柴油运转。转换方法通常是相对简单的，包括更换橡胶部分为合成部分，因为生物柴油是强溶剂。由于其强溶剂效力，燃烧生物柴油将增加锅炉的效率。生物柴油可用作柴油制品中的添加剂以增加纯超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，这是有利的因为其几乎没有含硫量。
生物柴油是比石油柴油更好的溶剂，并且可用于破坏此前以石油柴油运转的车辆燃料管线中的残渣沉积物。生物柴油的产生生物柴油可通过包含在富含油的生物质中的甘油三酯的酯交换来产生。因此，在本发明另一方面提供产生生物柴油的方法。在优选实施方案中，产生生物柴油的方法包括以下步骤(a)利用本文公开的方法培养包含脂质的微生物，(b)溶解包含脂质的微生物以产生溶胞产物，(C)从溶解的微生物分离脂质，和(d)酯交换该脂质组合物，从而产生生物柴油。已在以上描述了用于使微生物生长、溶解微生物以产生溶胞产物、在包含有机溶剂的介质中处理溶胞产物以形成异质的混合物、和将处理的溶胞产物分离为脂质组合物的方法，且所述方法也可用在产生生物柴油的方法中。可对脂质组合物进行酯交换以产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。优选的酯交换反应在以下概括，且包括碱催化的酯交换和利用重组脂酶的酯交换。在碱-催化的酯交换工艺中，在碱性催化剂(通常是氢氧化钾)的存在下将三酰基甘油酯与醇诸如甲醇或乙醇反应。这一反应形成甲基酯或乙基酯，以及作为副产物丙三醇(甘油)。一般化学工艺动物油和植物油通常由甘油三酯构成，甘油三酯是游离脂肪酸与三元醇甘油的酯。在酯交换中，三酰基甘油酯(TAG)中的甘油被短链醇诸如甲醇或乙醇代替。利用重组脂酶还已经利用酶诸如脂酶代替碱以实验进行酯交换。脂酶催化的酯交换可在例如室温与80°C之间的温度进行，且TAG与低级醇的摩尔比是大于I : 1，优选地约3 I。适用于酯交换的脂酶见于，如美国专利号4，798，793 ;4，940，845 ;5，156,963 ；5，342，768 ;5，776，741 和 W089/01032。利用脂酶产生适于生物柴油的脂肪酸酯的一个挑战是，脂酶的价格比强碱工艺使用的氢氧化钠(NaOH)价格高得多。这一挑战已经通过利用可循环的固定化脂酶来解决。然而，必须保持固定化脂酶在再循环最小数目循环后的活性，以允许基于脂酶的工艺在生产成本方面与强碱工艺竞争。固定化脂酶易于被酯交换中通常使用的低级醇类毒害。美国专利号6，398，707(2002年6月4日授权于Wu等.)描述了增强固定化脂酶活性和再生活性减少的固定化脂酶的方法。
在具体实施方案中，重组脂酶在产生脂酶对其作用的脂质的同一微生物中表达。编码脂酶和选择标记的DNA优选地是密码子优化的cDNA。重编码(recoding)在微藻中表达的基因的方法描述在美国专利号7，135，290中。标准生物柴油的共同国际标准是EN 14214。ASTM D6751是美国和加拿大参考的最常用生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214，而英国要求符合BS EN 14214。确定产物是否 符合这些标准的基本工业测试通常包括气相色谱、HPLC、及其他。满足质量标准的生物柴油是极其无毒的，毒性评级(toxicity rating) (LD50)大于50mL/kg。可再生柴油可再生柴油包括烷烃，诸如C16:0和C18:0，因此可与生物柴油区别开。高品质可再生柴油符合ASTM D975标准。由本发明方法产生的脂质可用作产生可再生柴油的原料。因此，在本发明另一方面，提供产生可再生柴油的方法。可再生柴油可由至少三种工艺产生水热(hydrothermal)加工(加氢处理(hydrotreating));加氢操作(hydroprocessing);和间接液化。这些工艺产生非酯馏出物。在这些工艺期间，如本文所述产生和分离的三酰基甘油酯被转化为烷烃。在优选实施方案中，产生可再生柴油的方法包括(a)利用本文公开的方法培养包含脂质的微生物，(b)溶解微生物以产生溶胞产物，(C)从溶解的微生物分离脂质，和(d)将脂质脱氧和加氢以产生烷烃，从而产生可再生柴油。适于制造可再生柴油的脂质可经由利用有机溶剂诸如己烷从微生物生物质提取，或经由其他方法来获得，诸如美国专利号5，928，696中描述的那些方法。在一些方法中，首先结合加氢处理将微生物脂质裂化以分别减少碳链长度和使双键饱和。然后将材料异构化，也连同进行加氢处理。然后可通过蒸馏除去石脑油馏分，随后再蒸馏以蒸发和蒸馏柴油燃料中期望的满足D975标准的组分，同时留下比满足D 975标准的期望组分重的组分。化学改性油类包括甘油三酯油类的加氢处理、加氢裂化、脱氧和异构化方法是本领域公知的。参见例如欧洲专利申请EP1741768(A1) ；EP1741767 (Al)；EP1682466(A1) ；EP1640437 (Al) ；EP1681337(Al) ；EP1795576 (Al);和美国专利号7，238，277 ；6, 630，066 ；6, 596，155 ；6, 977，322 ；7, 041，866 ；6, 217，746 ；5, 885，440 ；6，881，873。加氢处理在产生可再生柴油的方法的优选实施方案中，处理脂质以产生烷烃通过对脂质组合物加氢来进行。在水热加工中，通常，生物质在水中在高温和压力下反应以形成油类和剩余固体。转化温度通常是300至660F，且压力足以保持水主要是液体，100至170个标准大气(atm)。反应时间约为15至30分钟。在反应完成后，将有机物与水分离。从而产生适于柴油的馏出物。加氢操作称为“绿色柴油”的可再生柴油可通过常规加氢操作技术从脂肪酸产生。包含甘油三酯的油类可作为与石油一起的共同供料或作为专用供料被加氢操作。产物是符合ASTMD975规格的柴油燃料。因此，在产生可再生柴油的方法的另一优选的实施方案中，处理脂质组合物以产生烷烃通过对脂质组合物加氢操作来进行。
在制造可再生柴油的一些方法中，处理甘油三酯的第一步骤是以使双键饱和的加氢操作，随后在氢气和催化剂存在下在高温脱氧。在一些方法中，氢化和脱氧在同一反应中发生。在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后任选地进行异构化，也在氢气和催化剂存在下进行。石脑油组分优选地经由蒸馏除去。例如，参见美国专利号5，475，160(甘油三酯的氢化)；5，091，116 (脱氧、氢化和除气);6，391，815 (氢化);和5，888，947 (异构化)。石油精炼机通过以氢气处理供料，使用加氢操作去除杂质。加氢操作转化温度通常是300至700F。压力通常是40至lOOatm。反应时间通常在约10至60分钟。采用固体催化剂来增加某些反应速率，改进对某些产物的选择性，并优化氢消耗。加氢处理和加氢操作最终导致供料的分子量减少。在包含甘油三酯的油类的情形，甘油三酯分子在加氢操作条件下被还原为四种碳氢化合物分子丙烷分子和三种更重的碳氢化合物分子，通常在C8至C18的范围。间接液化传统超低硫柴油可通过两步骤工艺从任何形式的生物质产生。首先，将生物质转化为合成气，合成气是富集氢气和一氧化碳的气体混合物。然后，将合成气催化地转化为液体。通常,液体的产生利用Fischer-Tropsch(FT)合成实现。这一技术适用于煤、天然气和重油。因此，在产生可再生柴油的方法的又另一优选的实施方案中，处理脂质组合物以产生烷烃通过间接液化脂质组合物来进行。喷气燃料飞机燃料是透明至麦杆色的。最常见的燃料是分为飞机A-I的无铅/基于石蜡油的燃料，其按照国际标准化的规格设置产生。飞机燃料是大量不同碳氢化合物的混合物，可能多达上千或更多。其大小(分子量或碳原子数)的范围由产物需求例如冰点或发烟点限制。煤油型飞机燃料(包括Jet A和Jet A-1)具有约8至16个碳原子数的碳原子数分布。宽懼分飞机燃料(wide-cut Aeroplane fuel)或石脑油型飞机燃料(包括Jet B)通常具有约5至15个碳的碳原子数分布。两种飞机燃料(Jet A和jet B)可包含大量添加剂。有用的添加剂包括但不限于，抗氧化剂、抗静电剂、腐蚀抑制剂和燃料系统结冰抑制剂(FSII)。抗氧化剂阻止结胶，且通常基于烷化酚类，例如，A0-30、A0-31或A0-37。抗静电剂消散静电并阻止打火花。以二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分的Stadis 450是一个实例。腐蚀抑制剂，如DCI-4A用于民用燃料和军用燃料，DCI-6A用于军用燃料。FSII剂包括如Di-EGME。一种解决方案是混合藻类燃料与现有的喷气燃料。本发明提供这样的解决方案。由本发明方法产生的脂质可用作产生喷气燃料的原料。因此，在本发明的另一方面，提供产生喷气燃料的方法。随同提供从由本发明方法产生的脂质产生喷气燃料的两种方法流化催化裂化(FCC);和加氢脱氧(HDO)。流化催化裂化流化催化裂化(FCC)是一种用于从粗制重馏分产生烯烃尤其是丙烯的方法。文献中有报告可利用FCC加工植物油诸如低芥酸菜籽油以获得可用作汽油燃料的碳氢化合物流。由本发明方法产生的脂质可被转化为烯烃。该工艺包括使产生的脂质流经FCC区，并收集包括烯烃的可用作喷气燃料的产物流。将产生的脂质与裂化催化剂在裂化条件接触以提供包括烯烃和碳氢化合物的产物流，其可用作喷气燃料。在优选实施方案中，产生喷气燃料的方法包括(a)利用本文公开的方法培养包含脂质的微生物，(b)溶解包含脂质的微生物以产生溶胞产物，(C)从溶胞产物分离脂质，并(d)处理脂质组合物，从而产生喷气燃料。在产生喷气燃料的方法的优选实施方案中，可将脂质组合物流经流化催化裂化区，在一个实施方案中，可包括将脂质组合物与裂化催化剂在裂化条件接触以提供包括C2-C5烯烃的产物流。
在这一方法的某些实施方案中，可能期望去除脂质组合物中可能存在的任何污染物。因此，在将脂质组合物流经流化催化裂化区之前，预处理脂质组合物。预处理可包括将脂质组合物与离子交换树脂接触。离子交换树脂是酸性离子交换树脂，诸如Amberlyst -15,并可用作脂质组合物流经的反应器中的床,无论向上流或向下流。其他预处理可包括通过将脂质组合物与酸诸如硫酸、乙酸、硝酸或盐酸接触而进行的温和酸洗涤。接触通常在环境温度和大气压下以稀酸溶液进行。将脂质组合物(任选地预处理的)流到FCC区，在那里含碳氢化合物组分被裂化为烯烃。催化裂化通过将反应区中的脂质组合物与由精细分割的颗粒材料构成的催化剂接触来实现。该反应是催化裂化，不同于加氢裂化，在不存在加入的氢气或氢气的消耗下进行。随着裂化反应进行，大量的焦炭沉积在催化剂上。通过在再生区燃烧催化剂的焦炭在高温下再生催化剂。含焦炭的催化剂在本文称为“积炭催化剂(coked catalyst)”，被持续地从反应区运输到待再生的再生区，并被来自再生区的基本上不含焦炭的再生催化剂代替。催化剂颗粒被各种气流流化允许在反应区和再生区之间运输催化剂。用于在催化剂流化流中裂化碳氢化合物诸如本文所述的脂质组合物的那些碳氢化合物的方法，在反应区和再生区之间运输催化剂的方法，和在再生器中燃烧焦炭的方法是FCC工艺领域技术人员公知的。可用于裂化脂质组合物以产生C2-C5烯烃的示例性FCC应用和催化剂描述在美国专利号6，538，169,7, 288，685，其通过引用全文并入。在一个实施方案中，裂化本发明的脂质组合物发生在FCC区的提升管段(risersection)、或可选地提升段(lift section)。脂质组合物被喷嘴引入提升管，导致脂质组合物的快速蒸发。在接触催化剂之前，脂质组合物通常将具有约149°C至约316°C (300F至600F)的温度。催化剂从混合容器流向提升管，在那里其接触脂质组合物约2秒或更短的时间。然后混合的催化剂和反应的脂质组合物蒸汽从提升管顶部经出口排出并分离为包括烯烃的裂化的产物蒸汽流和大量焦炭覆盖且通常称为“积炭催化剂”的催化剂颗粒集合体(collection)。为了使脂质组合物与催化剂的接触时间最短，任何分离器的布置诸如旋转臂布置可用于从产物流快速去除积炭催化剂，催化剂可能促进期望的产物进一步转化为不希望的其他产物。分离器，如旋转臂分离器，位于室的上部，汽提区位于室的下部。被旋转臂布置分离的催化剂下降进入汽提区。包含裂化的碳氢化合物(包括轻烯烃)和一些催化剂的裂化的产物蒸汽流经由与旋流器连通的导管离开该室。旋流器从产物蒸汽流去除剩余的催化剂颗粒以减少颗粒浓度至非常低的水平。产物蒸汽流然后离开分离容器顶部。由旋流器分离的催化剂返回分离容器且然后返回汽提区。汽提区通过与蒸汽逆流接触而从催化剂表面去除吸附的碳氢化合物。低碳氢化合物分压运转有利于产生轻烯烃。因此，提升管压力设置在约172至241kPa(25至35psia),碳氢化合物分压为约35至172kPa(5至25psia),优选的碳氢化合物分压为约69至138kPa(10至20psia)。对碳氢化合物的这种相对低分压通过利用蒸汽作为稀释剂到稀释剂为脂质组合物的10至55wt-%、且优选地脂质组合物的约15wt-%的程度来实现。其他稀释剂诸如干气(dry gas)可用于达到等价的碳氢化合物分压。裂化流在提升管出口处的温度是约510°C至621°C (950F至1150F)。然而，高于 5660C (1050F)的提升管出口温度产生较多干气和较多烯烃。然而，低于566°C (1050F)的提升管出口温度产生较少乙烯和丙烯。因此，优选的是在约566°C至约630°C的优选温度运行FCC工艺，优选的压力为约138kPa至约240kPa(20至35psia)。该工艺的另一条件是催化剂与脂质组合物的比例，其可从约5变化至约20，优选地从约10至约15。在产生喷气燃料的方法的一个实施方案中，将脂质组合物引入FCC反应器的提升段。提升段中的温度将是非常热，范围从约700°C (1292F)至约760°C (1400F)，催化剂与脂质组合物的比例为约100至约150。预期将脂质组合物引入提升段将产生相当大量的丙烯和乙烯。产生的气态和液态碳氢化合物产物可通过气相色谱、HPLC等分析。加氢脱氧在利用如本文所述产生的脂质组合物或脂质产生喷气燃料的方法的另一实施方案中，脂质组合物或脂质的结构被称为加氢脱氧(hydrodeoxygenation, HD0)的工艺破裂。HDO是指借助氢去除氧，即，去除氧同时破裂材料的结构。烯属双键被氢化且任何硫和氮化合物被除去。去除硫称为加氢脱硫(HDS)。原材料(脂质组合物或脂质)的预处理和纯度有利于催化剂的使用寿命。通常在HD0/HDS步骤中，将氢气与供料原料(脂质组合物或脂质)混合，然后将混合物作为单相或两相的供料原料作为并向流(co-current flow)流经催化剂床。在HDO/MDS步骤后，分离产物级分并经过单独的异构化反应器。用于生物起始材料的异构化反应器作为并向反应器描述在文献中(FI 100 248)。用于通过氢化碳氢化合物供料(如本文脂质组合物或脂质)而产生燃料的工艺，还可如下进行通过将脂质组合物或脂质作为并向流与氢气一起通入第一氢化区，之后通过将氢气作为相对于碳氢化合物流出物的逆流通入第二氢化区将碳氢化合物流出物在第二氢化区中进一步氢化。可用于裂化脂质组合物以产生C2-C5烯烃的示例性HDO应用和催化剂描述在美国专利号7，232，935，其通过引用全文并入。通常，在加氢脱氧步骤中，生物组分诸如本文的脂质组合物或脂质的结构被分解，氧、氮、磷和硫化合物以及轻碳氢化合物作为气体被除去，且烯属键被氢化。在该工艺的第二步骤中，即在所谓的异构化步骤中，为了将碳氢化合物链支化并改进石蜡在低温的表现而进行异构化。在裂化工艺的第一步骤即HDO步骤中，将氢气与待氢化的本文的脂质组合物或脂质以并流或逆流通入HDO催化剂床系统，所述催化剂床系统包括一个或多个催化剂床，优选地1-3个催化剂床。HDO步骤通常以并流方式操作。在HDO催化剂床系统包括两个或多个催化剂床的情形中，一个或多个床可利用逆流原理操作。
在HDO步骤中，压力在20至150巴变化，优选地50至100巴，且温度在200至500°C变化，优选地在300-400°C的范围。在HDO步骤中，可使用包含来自元素周期系的第VII族和/或第VIB族的金属的已知氢化催化剂。优选地，氢化催化剂是被支持的Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，支持物是氧化铝和/或硅石。通常，使用NiMoAl2O3和CoMo/A1203催化剂。在HDO步骤之前，本文的脂质组合物或脂质可任选地在较温和条件下被预加氢处理，从而避免双键的副反应。这样的预加氢在预加氢催化剂存在下，在50-400°C的温度和1200巴的氢压力进行，优选地在150至250°C的温度和10至100巴的氢压力进行。催化剂可包含来自元素周期系的第VIII族和/或第VIB族的金属。优选地，预加氢催化剂是被支持的Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，支持物是氧化铝和/或硅石。冷却来自HDO步骤的含氢的气体流，然后从其中除去一氧化碳、二氧化碳、氮、磷 和硫化合物、气态轻碳氢化合物以及其他杂质。压缩后，将纯化的氢气或再循环的氢气返回第一催化剂床和/或催化剂床之间以补偿取出的气流。从冷凝液除去水。将液体通入第一催化剂床或催化剂床之间。在HDO步骤后，对产物进行异构化步骤。对该工艺实质的是，在碳氢化合物接触异构化催化剂之前尽可能完全地除去杂质。异构化步骤包括任选的汽提步骤，其中来自HDO步骤的反应产物可通过以水蒸气或适当的气体诸如轻碳氢化合物、氮气或氢气汽提来纯化。任选的汽提步骤在异构化催化剂的单元上游以逆流方式进行，其中气体与液体彼此接触，或在实际的异构化反应器之前在单独汽提单元中利用逆流原理进行。在汽提步骤后，将氢气和本文的氢化的脂质组合物或脂质以及任选地正构烷烃(n-paraffin)混合物通入包括一个或多个催化剂床的反应性异构化单元。异构化步骤的催化剂床可以并流或逆流方式操作。对该工艺重要的是，在异构化步骤中应用逆流原理。在异构化步骤中，这通过以逆流方式进行任选的汽提步骤或异构化反应步骤或二者来实现。异构化步骤和HDO步骤可在同一压力容器或单独的压力容器中进行。任选的预加氢可在单独的压力容器或在与HDO和异构化步骤同一压力容器中进行。在异构化步骤中，压力在20-150巴的范围中变化，优选地在20-100巴的范围，温度为200至500°C，优选地300至400°C。在异构化步骤中，可使用本领域已知的异构化催化剂。适当的异构化催化剂包含分子筛和/或来自第VII族的金属和/或载体。优选地，异构化催化剂包含SAP0-11或SAP041或ZSM-22或ZSM-23或镁碱沸石和Pt、Pd或NI以及Al2O3或Si02。典型的异构化催化剂是例如，Pt/SAP0-ll/Al203、Pt/ZSM-22/Al203、Pt/ZSM-23/Al203 和 Pt/SAP0_11/Si02。获得可用作柴油燃料或其组分的生物来源的高品质碳氢化合物组分作为产物，所述碳氢化合物组分的密度、十六烷值和在低温的表现是极佳的。微牛物改造如上所述，在本发明的某些实施方案中，期望遗传修饰微生物以增强脂质产生，改变由微生物产生的组分的特性或比例，或改进或提供在多种原料材料上的从头生长特征。载体的启动子、cDNA和3' UTR、以及其他元件可利用从天然来源分离的片段通过克隆技术产生(参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)，Sambrook 等·(第 3 版,2001, Cold Spring Harbor Press ;和美国专利号 4，683，202)。可选地，元件可利用已知方法合成地产生(参见例如Gene. 19950ct. 16 ；164(1) :49-53)。微生物改造方法是本领域通常已知的，如美国专利申请号20090011480，为了所有目的将其通过引用全文并入本文。
实施例以下是进行本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅是为了示例目的，不意为以任何方式限制本发明范围。已经进行了一些努力以确保有关所用数值(如，量、温度等)的准确性，但一些实验误差和偏差当然应该是允许的。除非另外指明，否则本发明的实践将采用本领域技能内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这样的技术在文献中充分解释。参见，如，T. E. Creighton, Proteins Structures and Molecular Properties (蛋白质结构和分子特性)(W. H. Freeman and Company, 1993) ;Α· L. Lehninger, Biochemistry (生物化学)(Worth Publishers, Inc.,最新版)；Sambrook,等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)(第2版，1989) !Methods In Enzymology (酶学方法)(S. Colowick 和 N. Kaplan 编著，Academic Press, Inc. ) !Remington' s PharmaceuticalSciences (雷明顿药物科学)，第 18版(Easton, Pennsylvania Mack Publishing Company,1990) ;Carey 和 Sundberg Advanced Organic Chemistry (高级有机化学)第 3 版· (PlenumPress)卷 A 和 B(1992)。实施例I :通过向微藻发酵施加低强度-光照的生物质增加葡萄藻属天然合成并耐受碳氢化合物混合物，产生以重量计多达85%的碳氢化合物，且在许多情形中主要的碳氢化合物是葡萄烃。还已知葡萄藻属是专性光养生物，但看起来具有摄取葡萄糖的能力(参考文献！“Biosynthesis of the triterpenoids,botryococcenes and tetramethylsqualene in the B race of Botryococcus brauniivia the non-mevalonate pathway (三職类、葡萄烃和四甲基角藍烯在B品系布朗葡萄藻中经由非甲轻戍酸途径的生物合成)” Sato等· 2003. Tetrahedron Letter 44 :7035-7037)。葡萄藻属培养物在25_35°C在带有10_30%的溶解氧的生物反应器中生长在BGll培养基上(参考文献“Autotrophic cultivation of Botryococcus braunii for theproduction of hydrocarbons and exopolysaccharides in various media (自养培养布朗葡萄藻以在各种培养基中产生碳氢化合物和菌表多糖)” .Dayananda等.2007. Biomassand Bioenergy. 31 :87-93)。通过比较来自不同条件(黑暗+无葡萄糖、黑暗+葡萄糖、光+无葡萄糖、和光+葡萄糖)的培养物的细胞干重来试验光信号对葡萄藻属异养生长的影响。试验最佳光强度(O. 01-300 μ mol光子IrTiV1)和不同光谱(360-700nm)以及不同光周期(9-16小时)。低光辐照与葡萄糖的组合导致a)改进的生长速率、b)增加的产物诸如类胡萝卜素、脂质和葡萄烃。实施例2 :类异戊二烯涂径的光调节异戊二烯、单萜类和倍半萜被一些植物和微藻物种合成和放出，但并非所有物种具有这一能力。这些挥发性的、非必需类异戊二烯化合物与较大的商业上有用的类异戊二烯诸如类胡萝卜素和碳氢化合物共有相同的生化前体。两种单独的途径在植物细胞中作用以合成所有类异戊二烯共同的异戊二烯基二磷酸酯前体。细胞质和线粒体前体由甲羟戊酸(MVA)途径产生，而最近发现的甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径位于质体中。布朗葡萄藻通过非甲羟戊酸的MEP途径产生碳氢化合物(图2)。光是调节MEP途径最重要的环境因子。I-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)是限速步骤，且编码DXR的基因的表达被光调节(参考文献^Expression andmolecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding 1-deoxy-d-xylulose5-phosphate reductoisomerase， the first committed enzyme of the2-c-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway (编码 2_c_ 甲基-d_ 赤藓醇 4_ 憐酸途径的第一个关键酶I-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构酶的拟南芥DXR基因的表达和分子分析)” · Carretero-Paulet 等· Plant Physiology. 2002. 129 :1581-1591)。另一实例是蓝光活化一种单细胞绿藻莱茵衣藻中编码类胡萝卜素生物合成酶 的基因。微阵列和定量PCR实验显示编码类胡萝卜素生物合成酶诸如roS、HDS、PSY和ZDS的基因被非常低光照的白光(0.014 11101光子111-28-1)和蓝光活化。进一步证据表明一种蓝光受体向光蛋白参与蓝光活化的基因表达以用于类胡萝卜素生物合成(参考文献IiiPhototropin involvement in the expression of genes encoding chlorophylland carotenoid biosynthesis enzymes and LHC apoproteins in Chlamydomonasreinhardtii(向光蛋白参与莱茵衣藻中编码叶绿素和类胡萝卜素生物合成酶以及LHC载脂蛋白的基因的表达)” · Im 等· The Plant Journal. 2006. 48 :1-16)。一个实例是碳氢化合物从葡萄藻属的产生增加。将不同光强度(O. 01-300 μ mol光子nT2sH)和不同光谱(360-700nm)施加于葡萄藻属培养物,不同碳氢化合物物质的量由GC-MS测量。实施例3.在不同光条件下富油新绿藻的生长材料和方法微藻和培养条件富油新绿藻藻种UTEX 1185从德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin，TXUSA)获得。在25°C室温，微藻的初始培养物生长在包含带2%葡萄糖的120ml改良的bold3N培养基的Erlenmeyer 250ml烧瓶中，以铝箔松散地覆盖烧瓶，烧瓶在130rpm定轨振荡器上，并在交替的两个40W自然日照(392316，Philips)和两个40W植物和水族用(392282，Philips)荧光灯泡下。培养基(改良的MB3N)包含以下组分，每IL去离子水0. 75g NaN03、O. 075g Κ2ΗΡ04、0· 074g MgS047H20、0. 025g CaCl22H20、0. 176g KH2PO4、0. 025g NaCl、6ml P-IV金属溶液(1L去离子水中 0. 75g Na2EDTA 2Η20、0· 097g FeCl36H20、0. 041g MnCl24H20、0. 005gZnCl2,0. 002g CoC126H20、0. 004g Na2Mo042H20)、三种维生素每种各 Iml (分别溶解在 50mMHEPES pH 7. 8中的O. ImM维生素B12、0. ImM生物素、6. 5mM硫胺素)。在高压灭菌培养基之前，用20% KOH调整培养基的最终pH到7. 5。加入维生素溶液以冷却高压灭菌的培养基。初始培养物达到某一汇合度后，使用Genesys IOUV分光光度计(Thermo Scientific)利用在680nm和750nm的光密度(OD)测量其浓度。实验方案和牛长测量试验三种不同波长的光(白光、蓝光和红光)。LED灯购自Super Bright LEDs,Inc.(白光RL5-W3030，蓝光RL5_B2430，红光RL5_R1330)。对于每种光波长，四种不同条件双份设置如下1-2.改良的MB3N+无葡萄糖+黑暗3-4.改良的MB3N+无葡萄糖+弱光5-6.改良的MB3N+2%葡萄糖+黑暗7-8.改良的MB3N+2%葡萄糖+弱光对每种条件准备包含终体积为120ml细胞培养物的共八个250mlErlenmeyer烧瓶，初始细胞浓度为在750nm OD O. I ( I. I X IO6细胞/ml)。光强度设置为白光3-4 μ mol/IrT2S4光子、蓝光2-3 μ mol/m^V1光子、和红光1-2 μ mol/m_2s_1光子。定轨振荡器的速度设置在135rpm。实验在室温进行两周。每24小时从每个烧瓶获得Iml细胞培养物以通过利用来自 Thermo Fisher Scientific (Waltham,MA USA)的 Genesys IOUV 分光光度计测量在680nm和750nm的OD来评估细胞浓度。具体生长速率通过将培养物光密度的对数对时间绘图来确定(图3)。低光照的红光、白光或蓝光与葡萄糖的组合导致与对照相比改进的生长速率。实施例4.在不同光条件下Botryococcus sudeticus的牛.长材料和方法藻种和培养某Botryococcus sudeticus藻种UTEX 2629从德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin,TX USA)获得。在25°C室温，在弱光(4-5 μ mol/W1光子)下，储用培养物在包含带2%葡萄糖的120ml改良的BGll培养基的Erlenmeyer 250ml烧瓶中生长，该烧瓶在130rpm定轨振荡器上。弱光照包括两种不同灯泡40W自然日照(392316Philips)以及40W植物和水族用荧光灯泡(392282Philips)。IL培养基(改良的BG-II)包含10mM HEPES (pH7.8)、1.5g NaNO3>O. 04g Κ2ΗΡ04、0· 06g MgS047H20、0. 036g CaCl22H20、0. 006g 柠檬酸 H20、0. 0138g 柠檬酸铁铵、0. OOlgNa2EDTA 2Η20、0· 02g Na2CO3'2. 86mg H3BO3U. 8Img MnCl24H20、
0.22mg ZnS047H20、0. 39mg Na2Mo042H20、0. 079mg CuS045H20、0. 0494mg Co (NO3) 26H20、0. 5g 酪蛋白水解物、和三种维生素的每种各Iml (分别溶解在50mM HEPES pH 7. 8中的O. ImM维生素B12、0. ImM生物素、6. 5mM硫胺素)。以20% KOH调整培养基的最终pH到7. 8。实验方案和牛长测量试验三种不同波长的光(白光、蓝光和红光)。LED灯购自Super Bright LEDs,Inc.(白光RL5-W3030，蓝光RL5_B2430，红光RL5_R1330)。对于每种光波长，四种不同条件双份设置如下1-2.改良的BG-Il+无葡萄糖+黑暗3-4.改良的BG-Il+无葡萄糖+弱光5-6.改良的BG-11+2%葡萄糖+黑暗7-8.改良的BG-11+2%葡萄糖+弱光对每种条件准备包含终体积为120ml细胞培养物的共八个250mlErlenmeyer烧瓶，初始细胞浓度为在750nm OD O. I ( I. I X IO6细胞/ml)。光强度设置为白光3-4 μ mol/IrT2S4光子、蓝光2-3 μ mol/m^V1光子、和红光1-2 μ mol/m_2s_1光子。定轨振荡器的速度设置在135rpm。实验在室温进行两周。每天从每个烧瓶获得Iml细胞培养物以通过利用来自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)的 Genesys IOUV 分光光度计测量在 680nm和750nm的OD来评估细胞浓度。具体生长速率通过将培养物光密度的对数对时间绘图来确定(图4)。低光照的红光、白光或蓝光与葡萄糖的组合导致与对照相比改进的生长速率实施例5 :以控制的光照发酵布朗葡萄藻材料和方法藻种和培养某布朗葡萄藻藻种UTEX 2441从德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin，TXUSA)获得。在25°C室温，在弱光α-δμπιοΙ/πΓ^—1光子)下，储用培养物在包含带2 %葡萄糖的120ml改良的BGll培养基的Erlenmeyer250ml烧瓶中生长，该烧瓶在130rpm定轨振荡器上。弱光照包括两种不同灯泡40W自然日照(392316Philips)以及40W植物和水族用荧光灯泡(392282Philips)。IL 培养基(改良的 BG-11)包含10mM HEPES (pH 7.8)、
I.5g NaN03、0.04g K2HPO4、O. 06g MgS047H20、0. 036g CaCl22H20、0. 006g 柠檬酸 H20、0. 0138g柠檬酸铁铵、0. OOlg Na2EDTA 2Η20、0· 02g Na2CO3'2. 86mg H3BO3U. 8Img MnCl24H20、0. 22mgZnS047H20、0. 39mg Na2Mo042H20、0. 079mg CuS045H20、0. 0494mg Co (NO3) 26H20、0. 5g酪蛋白水解物、和三种维生素的每种各Iml (分别溶解在50mMHEPES pH 7. 8中的O. ImM维生素B12、O. ImM生物素、6. 5mM硫胺素)。以20% KOH调整培养基的最终pH到7. 8。实验方案和生长测暈试验三种不同波长的光(白光、蓝光和红光)。LED灯购自Super Bright LEDs,Inc.(白光RL5-W3030，蓝光RL5_B2430，红光RL5_R1330)。对每种光波长，四种不同条件双份设置如下1-2改良的BG-Il+无葡萄糖+黑暗3-4改良的BG-Il+无葡萄糖+弱光5-6改良的BG-11+2%葡萄糖+黑暗7-8改良的BG-11+2%葡萄糖+弱光对每种条件准备包含终体积为120ml细胞培养物的共八个250mlErlenmeyer烧瓶，初始细胞浓度为在750nm OD O. I ( I. I X IO6细胞/ml)。光强度设置为白光3-4 μ mol/IrT2S4光子、蓝光2-3 μ mol/m^V1光子、和红光1-2 μ mol/m_2s_1光子。定轨振荡器的速度设置在150rpm。实验在室温进行两周。每两天从每个烧瓶获得5ml的每种细胞培养物以便由细胞干重(DCW)评估细胞生长。具体生长速率通过将培养物DCW对时间绘图来确定(图5)。通过利用尼罗红对中件脂质讲行的荧光测量在Iml藻类悬液中，加入4ul丙酮中的尼罗红溶液(250ug/ml)。在室温的10分钟温育期间涡旋混合物2次。温育后，转移200ul染色的藻类样品到96孔板中的单独孔中。用490nm激发波长和585nm发射波长并关掉530发射滤光片,在Molecular Devices 96孔板突光分光光度计上测量突光。为了确定藻类样品的相对突光强度，从突光强度减去空白(培养基中仅尼罗红)。结果与黑暗中的异养培养物(黑暗+glu)相比红光+葡萄糖增加UTEX2441的生长速率35% (图5)。在红光条件下脂质水平与对照相比也增加52% (图6)。实施例6 :以控制的光照发酵莱茵衣藻
材料和方法藻种和培养某莱茵衣藻藻种UTEX 2243从德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin，TX USA)获得。在25°C室温，在弱光G-SymolAr2S-1光子)下，储用培养物分别在包含120ml TAP培养基的Erlenmeyer 250ml烧瓶中生长，该烧瓶在130rpm定轨振荡器上。弱光照包括两种不同灯泡(40W自然日照(392316Philips)以及40W植物和水族用荧光灯泡(392282Philips))。IL 培养基(TAP)包含2. 42g Tris,25ml TAP 盐溶液(I5g NH4Cl、4gMgS047H20、2g CaCl2 2H20)、0· 375ml 磷酸盐溶液(100ml 水中 28. 8g K2HPO4U4. 4g KH2P04)、Iml Hutner微量元素溶液(1L痕量金属溶液，包含50g EDTA 二钠盐、22g ZnS047H20、11. 4gH3BO4,5. 06g MnCl24H20、l. 61g CoC126H20、I. 57g CuS045H20、I. 10 (NH4) 6Mo70244H20、4. 99gFeS047H20,利用KOH或HCl调整pH为7. 0)和Iml冰乙酸。用冰乙酸将培养基的最终pH调整为7. O。以除乙酸以外的以上列的所有组分制备Tris基本培养基(TP)。用HCl将培养 基的pH调整为7.0。实验方案和生长测暈LED灯购自Super Bright LEDs, Inc. (RL5-W3030)。四种不同条件双份设置如下1-2. TP (无乙酸)+黑暗3-4. TP (无乙酸)+弱光5_6·ΤΑΡ (乙酸)+黑暗7-8. TAP (乙酸)+弱光对每种条件准备包含终体积为120ml细胞培养物的共八个250mlErlenmeyer烧瓶，初始细胞浓度为I. OX IO5细胞/ml。光强度设置在3-5 μ mol/n^s—1光子。定轨振荡器的速度设置在140rpm。实验在室温进行一周。每天从每个烧瓶获得500ul细胞培养物以通过计数细胞数目来评估细胞生长。细胞在计数前利用卢戈液(lugol solution) (I 20)去鞭毛(deflagellate)。具体生长速率通过将细胞数目对时间绘图来确定。低光照的白光与TAP的组合导致与对照相比改进的生长速率(图7)。实施例7 :以低光福照培养微藻材料和方法藻种和培养基微藻藻种(如衣藻属、葡萄藻属、新绿藻属、蓝藻门、绿藻门、红藻门、隐藻门、绿变形藻门、定鞭藻门、裸藻门、不等鞭毛门、硅藻门和/或以上说明书中描述的那些)从如德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin，TX USA)获得。储用培养物如下培养例如，在约25°C室温，在弱光(如，4-5 μ Hi0IAT2iT1光子)下，在包含适当的培养基(参见如制造商的说明书)的Erlenmeyer 250ml烧瓶中，该烧瓶在约130rpm定轨振荡器上。培养基中使用适当的碳源如葡萄糖。弱光照可包括两种不同灯泡如，40W自然日照(392316Philips)以及40W植物和水族用荧光灯泡(392282Philips)。调整培养基的最终pH以适于特定藻种。参见如，制造商的说明书。实验方案和牛长测量试验三种不同波长的光(白光、蓝光和红光)IED灯购自，如Super Bright LEDs,Inc.(白光RL5-W3030，蓝光RL5_B2430，红光RL5_R1330)。对于每种光波长，四种不同条件双份设置如下1-2无碳+黑暗3-4无碳+弱光5-6 碳 + 黑暗7-8 碳 + 弱光对每种条件准备包含终体积为120ml细胞培养物的共八个250mlErlenmeyer烧瓶，初始细胞浓度为例如在750nm OD O. I ( I. I X IO6细胞/ml)。试验最佳光强度(如O. 01-300 μ mol光子πιΛ—1)和不同光谱(如360_700nm)以及不同光周期(如9_16小时的光照)。光强度设置为，例如，白光3-4 μ mol/m 2S 1光子、蓝光2_3 μ mol/m 2S 1光子、和红光Hymol/W1光子。试验不同浓度的不同碳源，例如，在例如1%、2%或3%培养基的浓 度的葡萄糖、蔗糖、果糖。定轨振荡器的速率设置在如150rpm。实验在室温进行少于一周、一周、两周、三周或更多周。每一至两天从每个烧瓶获得等份的每种细胞培养物以便通过例如细胞干重(DCW)评估细胞生长。具体生长速率通过将培养物DCW对时间绘图来确定。目标材料的测暈培养基中目标材料(碳氢化合物、脂质等)的量利用本领域中已知的标准手段如上述的GC-MS或尼罗红测量。例如，在Iml藻类悬液中，加入4ul丙酮中的尼罗红溶液(250ug/ml)。在室温温育期间涡旋混合物。温育后，转移100-200ul染色的藻类样品到96孔板中的单独孔中。用490nm激发波长和585nm发射波长并关掉530发射滤光片，在Molecular Devices 96孔板突光分光光度计上测量突光。为了确定藻类样品的相对突光强度，从荧光强度减去空白(培养基中仅尼罗红)。与对照相比，红光、白光、和/或蓝光联合碳源增加微藻藻种的生长速率。由实验微藻藻种(红光、白光、和/或蓝光联合碳源)产生的目标材料(如碳氢化合物或脂质)水平与对照相比增加。尽管已经参考优选的实施方案和各种替代性实施方案具体地展示和描述了本发明，但相关领域技术人员应理解，可对其进行形式和细节上的各种改变而不偏离本发明的主旨和范围。本说明书正文中引用的所有参考文献、授权专利和专利申请为了所有目的通过引用全文并入本文。
权利要求
1.一种用于培养能够异养生长的微藻的方法，包括 在异养生长条件下培养所述微藻持续足以允许所述微藻生长的时间段，其中所述异养生长条件包括包含碳源的培养基，且其中所述异养生长条件还包括低光辐照。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是葡萄藻属(Botryococcus)藻种,其中所述碳源是葡萄糖，且其中所述低光辐照是1-lOymol光子mi—1。
3.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是Botryococcussudeticus藻种。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是葡萄藻属藻种。
5.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是UTEX2629藻种。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)藻种。
7.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是UTEX2441藻种。
8.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是富油新绿藻(NeochlorisoIeabundans)藻种。
9.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是新绿藻属(Neochloris)藻种。
10.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是UTEX1185藻种。
11.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻种。
12.如权利要求I所述的方法,其中所述微藻是衣藻属(Chlamydomonas)藻种。
13.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻是UTEX2243藻种。
14.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻包含光感受器。
15.如权利要求I所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
16.如权利要求I所述的方法，其中所述碳源选自以下组成的组固定碳源、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-こ酰氨基葡萄糖、甘油、弗罗里多苷、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚合的纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和糖蜜。
17.如权利要求I所述的方法，其中所述光由自然光源产生。
18.如权利要求I所述的方法，其中所述光是自然日光。
19.如权利要求I所述的方法，其中所述光包括全光谱光或特定波长的光。
20.如权利要求I所述的方法，其中所述光由人造光源产生。
21.如权利要求I所述的方法，其中所述光是人造光。
22.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是0.01-1 u mol光子HT2sA
23.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是1-lOymol光子m2^1。
24.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是lO-lOOymol光子mY1。
25.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是100-3001!mol光子m2^1。
26.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是100-3001!mol光子m2^1。
27.如权利要求I所述的方法，其中所述低光辐照的强度是SqilmoIAr2s-1光子、2-3 u mol/m 2S 1 光子、1-2 u mol/m 2S 1 光子或 3-5 u mol/m 2S 1 光子。
28.如权利要求I所述的方法，所述方法还包括从所述微藻产生材料。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述材料是多糖、色素、脂质或碳氢化合物。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述材料是碳氢化合物。
31.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括回收所述材料。
32.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括提取所述材料。
33.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括加工所述材料。
34.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括加工所述材料。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述材料的所述加工产生已加工材料。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述已加工材料选自以下组成的组燃料、生物柴油、喷气燃料、化妆品、药剂、表面活性剂和可再生柴油。
37.如权利要求I所述的方法，其中所述微藻的生长速率比第二微藻高，所述第二微藻在第二异养生长条件下被培养持续足以允许所述微藻生长的时间段，其中所述第二异养生长条件包括包含碳源的生长培养基，且其中所述第二异养生长条件不包括低光辐照。
38.一种培养微藻的方法,包括将多个微藻细胞放置在碳源和低光福照存在下。
39.一种制造材料的方法，包括 提供能够产生所述材料的微藻； 在培养基中培养所述微藻，其中所述培养基包含碳源； 向所述微藻施加低光辐照；和 允许所述微藻积累其细胞干重的至少10%作为所述材料。
40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括回收所述材料。
41.一种生物反应器系统,包括 生物反应器； 包含碳源的培养基，其中所述培养基位于所述生物反应器中； 适于异养生长的微藻，其中所述微藻位于所述培养基中；和 光源，其中所述光源产生低光辐照，且其中所述光源可操作地耦合于所述生物反应器。
42.如权利要求41所述的系统，其中来自所述光源的光包括全光谱光或特定波长的光。
43.如权利要求41所述的系统，其中来自所述光源的光包括由可操作地耦合于所述生物反应器的太阳能集热器收集的自然日光，且其中所述光经由可操作地耦合于所述太阳能集热器和所述生物反应器的光纤被传递到所述生物反应器内部。
44.如权利要求41所述的系统，其中来自所述光源的光包括人造光，其中所述人造光由发光二极管(LED)或荧光灯产生。
45.如权利要求44所述的系统，所述系统还包括足以供应所述LED或荧光灯的电源，其中所述电源可操作地耦合于所述生物反应器；和可操作地耦合于所述电源的光控制器，其中所述光控制器适于控制由所述LED或突光灯发射的光的强度和波长。
46.如权利要求43所述的系统，其中所述光纤安装在透光和保护性的光结构中。
47.如权利要求44所述的系统，其中所述LED安装在透光和保护性的光结构中。
全文摘要
本发明提供用于培养微藻的生物反应器和方法。生物反应器和方法包括通过提供光信号来改进异养生长效率的特征和改良。
文档编号C12N1/12GK102656261SQ201080046844
公开日2012年9月5日 申请日期2010年9月17日 优先权日2009年9月18日
发明者简·吉姆, 郑淳·林 申请人:菲科尔生物技术国际公司