专利名称：用于细胞培养的微流控设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及培养细胞的装置；更具体地涉及微流控细胞培养装置。
背景技术：
在平坦细胞培养器皿上培养的细胞通常具有人工二维细胞片层，所述细胞片层可具有明显不同于活体内培养的细胞的形态和功能。培养的细胞对现代药物的发现和开发很重要，广泛用于药物测试。但是，若这种测试的结果不能显示细胞在活体内的响应，则这些结果的相关性降低。人体内的细胞处于完全被其它细胞、膜、纤维层、黏附性蛋白质等包围的三维环境中。因此，需要能更好地模拟活体内的条件并促使培养的细胞具有类似于活体内的形态和功能的细胞培养装置。用于细胞培养的构造和系统已取得很大进步，能更好地模拟活体内的条件，并在培养环境中将分化细胞如肝细胞保持更长时间。例如，与常规培养设备相比，胶原夹心培养系统、3D细胞培养系统和微流控灌流系统对细胞性能已经有所提高，能够维持具有一些表型关联性的活细胞培养。已用于延长细胞活性和功能的其它方法包括使用改性细胞培养基、共培养和使用各种胞外基质，以促进3D细胞的组构。但是，对能够调节细胞功能的复杂活体内微环境进行模拟，以便成功进行长期细胞培养仍然存在困难。因此，尽管取得了这样一些进展，但在培养的细胞的功能方面已取得的进步是有限的。
发明内容
本发明描述了微流控设备等，所述微流控设备通过多个灌流通道提供动态细胞培养条件，使细胞实质上悬浮在结构化支架上或被结构化支架包封。所述设备可模拟组织在活体内的架构、灌流和流动，可用于形成组织状结构和形态。例如，在下面提供的实施例中， 在本文所述的设备上培养的肝细胞具有三维延伸的重建膜极性，形成胆小管结构，无须加入生物的或合成的基质或凝结剂即具有转运功能。本文所述的设备具有灌流通道，细胞培养基或其它流体组合物可通过所述灌流通道流动。灌流通道与细胞停留室流体连通，所述细胞停留室中可培养细胞。所述细胞停留室包含用来防止细胞延展的结构化表面，所述结构化表面可促进三维细胞形态的形成。所述结构化表面包含用来使细胞悬浮在结构化表面底部上方的凸起。在许多实施方式中，与细胞接触的凸起表面的表面积小于要在所述设备中培养的细胞的接触表面积(即小于细胞将与平坦的非结构化表面相接触的表面积)。通过限制细胞可接触的表面积，细胞的延展可受到抑制，三维细胞形态的形成可得到促进。在一些情况下，结构化表面可促进或保持细胞极性，如肝细胞的极性。
结构化表面可形成一个或多个槽，流体可通过槽流动。槽底可由结构化表面的底部形成，凸起的侧面可形成槽的侧面。在多个实施方式中，微流控培养设备具有与结构化表面的一个或多个槽流体连通的进口和出口，所述进口和出口供流体进出槽。在培养的细胞形成紧密的细胞-细胞间连接(即具有组织状形态)时，细胞可通过流体的形式将槽与灌流通道隔离，使得独立的梯度可沿细胞室形成。此外，槽和灌流通道可有效地用于模拟活体内的多向流动。在一些情况下，可能得到的腐蚀梯度(carious gradient)或者多向流动可促进细胞极性的形成。相比于现有的微流控培养设备或其它培养设备，本文所述的设备和方法可提供一个或多个优点。例如，本文所述的设备的实施方式可提供结构化设计，使得能够像组织那样对细胞进行3D组构，并重建类似于活体内的膜极性；可提供用于长期培养细胞的类似于活体内的可持续动态条件和用于评价毒性(包括慢性毒性)、研究药物-药物间(长期)相互作用的活体内细胞特异性功能；可提供动态细胞培养条件，如氧和营养物的受控供应，氧梯度，以及剪切应力控制；可控制氧的水平和营养物，模拟生理条件。所述多条流动通道可输运营养物、清除废物和供氧，效率高、效果好。槽和灌流通道可有效地用来独立地沿细胞室产生梯度，模拟活体内的多向流动。可实现一种灌流法，该灌流法可促进极性重建，延伸三维胆小管结构。本领域的技术人员阅读本文所述的本发明内容后，容易看出本文所述的设备和方法的各种实施方式的上述及其它优点。
图I是微流控装置的一个实施方式的示意性透视图。图2A-C是图I所示微流控设备的实施方式的示意性截面图，该截面在图I中线 a-a与线b-b之间沿线c_c截取。图3A-B是表面上没有放置细胞(A)和放置有细胞(B)的结构化表面的示意图。图4是微流控设备的一个实施方式的示意性剖面透视图。图5是微流控设备的一个实施方式的一部分的示意性俯视图。图6是图5所示设备沿线6-6截取的示意性截面图。图7是图5所示设备沿线7-7截取的示意性截面图。图8是图6所示设备的示意图,显示了在该设备中培养的示意性细胞。图9A-B是微流控设备的实施方式的局部示意性俯视图。图10是微流控设备的一个实施方式的示意性截面图。图11-12是设备的实施方式的示意性俯视图。图13A-C是微流控设备的局部示意性俯视图，显示了流体流动的例子。图14A-E显示了微流控装置的一个实施方式的示意图、微流控装置的局部放大图 (B-C)和更高倍数的放大图(D-E)。图15是微流控装置的一个实施方式的局部示意性俯视图。图16A-F是用来制备设备或其部分的光刻过程的示意图。图17A-B是用顶部件和底部件形成的微流控设备的示意性截面图。图18-19是总体方法的流程图。图20是用来形成微流控设备的一部分的硅母体的图像。
图21是复制的组装设备的图像。图22A-B是设备的可选实施方式的图像,它们的停留支柱(retention post)和底通道(或顶通道)亚结构具有不同的尺寸。图23A-B是显示流体流过微流控设备的荧光图。图24A-B是显示流体流过微流控设备的荧光图，所述微流控设备中培养了细胞。图25是在微流控设备的细胞室中装载和培养了 7天的人原代肝细胞的图像(放大20倍)。图26A-B是在微流控设备的细胞室中培养的肝细胞经7天保温后进行活/死细胞染色的结果的代表性荧光图(A :放大5倍；B :放大20倍)。图27A-B是在没有底部亚结构(22A)和有底部亚结构(22B)的微流控设备的细胞室中以三维形式装载的肝细胞经7天保温后拍摄的荧光图和亮场图。在图22A中，最左边的一张是荧光图(放大5倍)，右边三张是放大5倍、20倍和20倍(分别从左到右)的亮场图。在图22B中，最左边一张是荧光图(放大10倍)，中间一张是亮场图(放大10倍)， 右边一张是亮场图(放大20倍)。图28显示了在微流控设备中于灌流条件下培养的细胞的三张亮场图。左图显示细胞在组装的设备中。中图显示取走设备盖之后的细胞。右图显示从设备中移出后的细胞。图29显示了在静态条件下培养的细胞的三张亮场图。左图显示细胞在组装的设备中。中图显示取走设备盖之后的细胞。右图显示从设备中移出后的细胞。图30显示了在具有微流控设备的结构化底表面的96孔板上培养的细胞的两张亮场图，所述结构化底表面复制在孔的底表面上。左图是在经等离子体处理的PDMS基底上培养的细胞。右图是在未经处理的PDMS上培养的细胞。图31显示了在常规96孔板(左图)和微流控设备(中图和右图)上培养的经 MRP2蛋白免疫染色的人原代肝细胞的荧光图。图32是在微流控设备中培养的经连接蛋白32免疫染色的人原代肝细胞的荧光图。图33A-B是在常规96孔板(A)和微流控设备(B)中培养的细胞的MRP2肝细胞转运体的二乙酸荧光素转运功能分析图。本文所提供的示意图不一定是按比例绘制的。图中使用的相同附图标记表示相同的部分、步骤等。但应理解，在特定的附图中使用附图标记表示一个部分并不会对另一附图中用相同附图标记标出的部分构成限制。此外，用不同的附图标记表示各部分并不表明附图标记不同的部分不能相同或相似。
具体实施例方式在以下详述中，参照构成说明书的一部分的附图，以示意性方式描述本发明的装置、系统和方法的几种具体实施方式
。应理解，可以在不偏离本发明的范围或精神的前提下，构思和实现其它的实施方式。因此，以下发明详述不应理解为限制性的。除非另外说明，本文使用的所有科学和技术术语的含义是本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括具有多个所指对象的实施方式，除非文中有明确的相反表示。如本说明书和所附权利要求书所用，“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用，除非文中有明确的相反表示。在本文中，“具有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“拥有”等在其开放含义上使用，
通常表示“包括但不限于”。本文提到的任何方向，如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上方”、“下方”
及其它方向和取向，在本文中是用来清楚地描述附图，而不是对实际的设备或系统或者所述设备或系统的使用构成限制。本文所述的设备或系统可以许多方向和取向使用。本文所用的“结构化表面”是指具有预定形貌的表面。结构化表面包括主表面和自所述主表面延伸的凸起，所述凸起限定了预定的形貌。凸起具有基本上与主表面朝向相同方向的表面，凸起的这些表面连同主表面的外露部分(没有凸起的那些部分)包含“结构化表面”。本文所用的“槽”在涉及结构化表面时是指在从主表面延伸的至少两个凸起之间， 沿着结构化表面的主表面形成的凹陷或通道。在许多实施方式中，“槽”是沿着结构化表面的主表面的长度延伸的连续路径。槽可沿着主表面走任何路径，并且至少部分由从主表面延伸的凸起限定。本文所用的“悬浮”在涉及细胞相对于表面的关系时是指“将细胞支撑在表面上方”。本文所用的“灌流通道”在涉及培养细胞的微流控设备时是指细胞培养基可从中流过的通道，所述通道被设置用来使细胞培养基对所述设备中培养的细胞进行灌流处理。 一般地，灌流通道被设置用来提供细胞培养基的层流(即非湍流)，形成开口，细胞培养基通过所述开口对细胞进行灌流处理。本发明描述了微流控设备等，所述微流控设备通过多个灌流通道提供动态细胞培养条件，使细胞实质上悬浮在结构化支架上或被结构化支架包封。所述设备可模拟组织在活体内的架构、灌流和流动，使培养的细胞具有类似于活体内的形态和功能。研究显示，如下文所述的这种设备能够促进和维持类似于活体内的3D细胞结构，所述细胞结构可促进细胞-细胞间的信号传递、三维极性的重建和体外细胞特异性功能，可用于长期培养细胞而无须加入生物的或合成的基质或凝结剂。在多个实施方式中，这种设备具有多个进口和出口，可供独立流动之用，并可用来将细胞接种到或注入即用型(无须组装的)设备中。所述设备可对灌流加以控制，以提供最优的生理相关性细胞培养条件，如类似于组织微循环的介质流动和剪切应力，氧气和生长介质的供应，以及废物组分、降解产物和代谢物的清除。所述设备还可具有多条灌流通道， 其中细胞室任意一侧具有两条平行流动通道，细胞室底部有一条下流通道，所述下流通道支持独立流动，并支持细胞实质上悬浮在结构化支架[柱墩(pillar)或通道亚结构]上。 这种设备可用于测试靶细胞上的候选药物，药物-药物间的相互作用，新候选药物的代谢和毒性及其代谢物，以及候选药物及其代谢物的转运。所述设备可布置和包装成量产形式， 用来进行筛选分析，如毒性筛选。在多个实施方式中，所述设备被设置成可装配(或者已装配)生物传感器的形式，以监视环境条件如02、CO2、流速、pH和温度。现在参考图1，它显示了微流控细胞培养装置100的一个实施方式的示意性透视图。所示装置100具有与内部细胞停留室(图I中未示出)连通的进口 330和出口 335。 所示装置还具有与第一内部灌流通道(图I中未示出)流体连通的进口 310和出口 315以及与第二内部灌流通道(图I中未示出)流体连通的进口 312和出口 317。可以理解，本文所述的细胞培养装置100可包含任何数量的进口 310、312和出口 315、317以及任何数量的灌流通道。可进一步理解，所示的进口 310、312可以是出口，而所示的出口 315、317可以是进口，具体取决于流体流动的方向。一个进口或一个出口与不止一条灌流通道流体连通。现在参考图2A-C，它们显示了图I所示装置100的多个实施方式的示意性截面，所述截面在图I所示线a-a与b-b之间沿线c-c截取。装置100的细胞停留室包含可在其上培养细胞的结构化表面140。结构化表面140包含朝向细胞停留室的主表面149 (所绘附图中的底表面)。多个凸起144从主表面149延伸到细胞停留室中。如图中实施方式所示， 凸起144可以任何合适的方式排列，可具有任何合适的形状或构型。在图2A-2B所示的实施方式中，凸起144是柱墩的形式。虽然图2A-2B所示的柱墩显示为矩形截面形状，但可以理解，所述柱墩可具有任何合适的截面形状，如圆形、椭圆形、六边形、三角形、V形或不规则形状等。在图2C所示的实施方式中，凸起144形成沿着结构化表面140的长度延伸的脊。 虽然图2C所示的脊是线形的，但可以理解，所述脊可具有任何合适的形状，包括正弦形、蛇形、不规则形状等。现在参考图3A-C，它们显示了在表面140上没有培养细胞(3A)和培养了细胞 (3B)的细胞停留室的结构化表面140的示意图。结构化表面140被设置用来限制细胞200 在所述表面上的延展。在装置的细胞停留室中培养细胞200时，这可通过最大程度减小结构化表面140接触细胞的表面积来实现。一般地，凸起144具有径向尺寸d，如宽度、直径等，它小于在细胞停留室中培养的细胞的径向尺寸。例如，凸起144的细胞接触表面146 (图不实施方式中的顶表面，它一般与接触主表面149或自主表面149延伸的表面相对)的径向尺寸d可约为在装置中培养的细胞200的径向尺寸的一半。在多个实施方式中，凸起144 的细胞接触表面146的径向尺寸d约为5-15微米，或者约为5-10微米。当凸起144是柱墩时(与图2C所示的长脊不同)，细胞接触表面146的表面积可小于细胞将接触平坦非结构化表面的表面积。例如，细胞接触表面146的表面积可以是细胞将接触平坦非结构化表面的表面积的一半、四分之一或者小于四分之一。在多个实施方式中，细胞接触表面146的表面积约为25-225微米2。另外，凸起144相互隔开，使相邻凸起144之间的距离D足够小，以防细胞接触结构化表面的主表面149。这样，凸起144使细胞200悬浮在主表面149上方，细胞200可接触的结构化表面140的表面积限于凸起144的细胞接触表面146。相邻凸起144之间的距离D可以是任何合适的距离，如小于装置中培养的中等细胞200的径向尺寸，或者小于装置中培养的中等细胞200的径向尺寸的一半。在多个实施方式中，相邻凸起144之间的距离 D约为5-15微米，或者约为5-10微米。凸起144可自结构化表面140的主表面149延伸任何合适的距离，使得细胞200 有效地悬浮在主表面149上方。例如，凸起的高度h可约大于5微米。在多个实施方式中， 凸起144的高度h约为5-25微米。结构化表面140的凸起144可排列成规则或不规则图案。出于制造的目的，凸起 144可排列成规则图案或阵列。阵列中的凸起可具有相同或不同的形状、尺寸或构型。
现在参考图4-8，它们显示了微流控设备100的实施方式的多个视图。图4是微流控设备100的一个实施方式的示意性剖面透视图；图5是微流控设备100的一个实施方式的示意性局部俯视图；图6是图5所示设备沿线6-6截取的示意图截面；图7是图5所示设备沿线7-7截取的示意性截面；图8是图6所示设备的示意图，显示了设备100中培养的细胞 200。在图4-8所示的实施方式中，设备100包含细胞停留室130，细胞200可放在细胞停留室130中培养。室130可具有任何合适的尺寸，用来培养所需数量的细胞200。在多个实施方式中，为室130设计合适的尺寸和构型，用来沿其宽度培养2-6个细胞，沿室的高度培养2-3个细胞。2-6个细胞的宽度和2-3个细胞的高度使营养物或其它试剂容易从灌流通道120、122扩散到细胞停留室里培养的细胞。可以理解，细胞尺寸可随细胞类型和培养条件变化。因此，室130的合适尺寸可以变化，以提供所需数量的细胞宽度和高度尺寸。还可理解，在相同条件下，指定类型的细胞的尺寸可因细胞而异。一般地，当本文基于细胞尺寸描述尺寸时，所述尺寸基于所培养的细胞的平均尺寸。在多个实施方式中，室130的宽度约为80-120微米(约4_5倍于典型细胞的直径， 所述典型细胞的直径约为20-25微米)，如约为105微米。室130可具有任何合适的高度， 例如约30-80微米，约35-50微米，或者约45微米。室130可具有任何合适的长度，例如约 100-30000微米，约150-20000微米，约200-15000微米。在许多情况下，长度较短的室130 比长度较长的室更有可能有效地装载细胞(需要的话)。室130具有结构化表面140，该结构化表面140在细胞接触表面146之间形成一个或多个槽142。槽142被设置用来提供通道，供流体在室130中培养的细胞200附近停留或流动。因此，槽142所具有的宽度不能使室130中培养的细胞200阻挡流体流过槽142。 也就是说，槽142的宽度小于室130中培养的细胞200的宽度。例如，槽142的宽度是所培养的细胞200的宽度的一半。可以理解，槽142的宽度可根据装置100中要培养的细胞200 的尺寸变化。在多个实施方式中，槽的宽度约小于15微米，约为5-15微米，或者约为5-10 微米。在一些实施方式中，槽142—般沿结构化表面140的长度具有均匀的宽度。一般地， 槽142由结构化表面140的主表面(参见例如图2A-C中的附图标记149)和凸起144的侧面形成。因此，槽142可沿着结构化表面140的主表面走任何路径，具体取决于凸起144的形状和构型。槽142沿着结构化表面140的长度延伸。槽142可用来传送或存留能向细胞200递送试剂的流体组合物，或者从细胞室130 移走试剂。例如，可将包含营养物的组合物如细胞培养基置于槽142中，将营养物送给所培养的细胞200，或者从细胞移走废产物。可通过槽142将要测试的试剂如药理剂送给细胞 200。可将能诱导细胞极化的试剂、模拟活体内生理环境的试剂或组合物等引入槽142。在多个实施方式中，细胞200在室130中的培养至少部分使槽142与灌流通道120、122流体隔离。例如，设备100中培养的细胞200可发生细胞-细胞间相互作用，形成组织状形态， 可抑制或减少流体在槽142与灌流通道120、122之间的整体运动。继续参考图4-8，所示设备100包含流体可从中流过的第一灌流通道120和第二灌流通道122。在多个实施方式中(未示出)，设备包含一条或超过两条灌流通道。通道包含停留支柱160，所述停留支柱160形成开口 150，使室130与灌流通道120、122之间流体连通，使得试剂经开口 150在灌流通道120、122与细胞室130之间扩散。开口 150所具有的尺寸可防止室130中的细胞进入灌流通道120、122。例如，开口 150的高度、宽度或径向尺寸可小于约20微米、小于约15微米、小于约10微米或约5微米。虽然图4-8显示停留支柱160具有矩形截面形状，但可以理解，它可具有任何合适的形状或构型。在多个实施方式中，停留支柱160具有椭圆形、圆形、三角形、w形或不规则截面形状等。灌流通道120、122可具有任何合适的尺寸。在多个实施方式中，灌流通道120、122 的高度与细胞停留室130的高度相同，而在一些实施方式中，灌流通道120、122的高度与细胞停留室130的高度不同。在一些实施方式中，第一和第二灌流通道120、122被设置用来传送流体如细胞培养基。在一些实施方式中，第一和第二灌流通道120、122经适当设置，可防止细胞从细胞停留室130进入灌流通道120、122。在一些实施方式中，灌流通道的高度约为30-80微米，约为35-50微米，或者约为45微米。灌流通道的宽度可能需要大于或等于设备中所培养的细胞的径向尺寸的约I. 5倍，这样，若细胞碰巧进入灌流通道，所述细胞将通过通道而不会阻挡流体流动。在一些实施方式中，灌流通道的宽度约为30-1000微米，约为30-100微米，或者约为30-45微米。灌流室120、122通常在细胞停留室130的侧面，沿着该室的长度方向延伸。现在参考图9A-B，它们显示了微流控设备100的实施方式的示意性局部俯视图。 设备100类似于图5所示的设备，相同的附图标记表示相同的部分或部件。图9A-B所示的凸起144中，有一些是正方形柱墩而不是图5所示的长形凸起(当然，图9A-B中有一些凸起是长形凸起)。图9A-B所示的凸起144至少形成槽142的一部分,所示槽142沿着结构化表面140的长度方向延伸。如图9B中的线所示，槽142可具有任何合适的形状，并且可考虑让它沿着结构化表面140的长度方向走任何合适的路径。当至少有一些凸起144允许槽142走不止一条路径时，可考虑让槽142走任何合适的路径。不管槽和凸起的结构如何，在多个实施方式中，结构化表面被设置用来限制细胞延展，这可促进组织状三维形态的形成和细胞-细胞间的相互作用。结构化表面的构型可随要培养的细胞变化，因此凸起的形状、构型和槽的路径、构型也可随要培养的细胞变化， 从而可达到所需的效果(例如组织状3D形态)。一般希望凸起144有助于所培养的细胞实质上悬浮在细胞停留室中。凸起144和槽142可一起帮助细胞实质上悬浮，其中细胞停留在凸起顶部，而槽内的流体辅助细胞的悬浮。据信，通过形成这种实质悬浮，可促进细胞有控制地聚集或重排成组织状构架。如图10所示，细胞停留室的顶表面和底表面可以是结构化表面140、140’。通过在室130的顶部和底部同时提供结构化表面140、140’，可进一步使设备100与该设备中培养的细胞之间的相互作用最小(相对于仅有一个结构化表面)。此外，停留支柱160和灌流通道120、122的开口有效形成室130的侧表面，它们同样是有效的结构化表面。当室130中装满经过培养的细胞时，顶部结构化表面140’可与细胞一起构成通道，流体可从该通道中流过。也就是说，培养的细胞可在凸起之间形成密封，从而形成密封的通道，诸如细胞培养基之类的流体可从该通道流过。在一些实施方式中，这些由细胞形成的密封通道可用来将流体运送到培养的细胞一侧，与运送到培养的细胞另一侧的流体分开，因而当细胞在一侧接触不同于另一侧的流体时，它们能在培养过程中确立极性。现在参考图11-12，它们显示了设备100的示意性俯视图。图中显示了进口 310、 312、320、330和出口 315、317、325、335。从设备100外部可到达所述进口和出口。本文所述的微流控设备可包含任何合适数量的进口和出口。可以理解，进口可用作出口，出口可用作进口，具体取决于流体流动方向。在图11所示的实施方式中，设备100具有灌流通道进口 310、槽进口 320、细胞室进口 330、灌流通道出口 315、槽出口 325和细胞室出口 335。图 11中虚线框所示的区域示意性地表示例如图5所示设备的区域。灌流通道进口 310和出口 315与灌流通道120、122(例如，如图5所示)流体连通，使流体能进入进口 310，流过灌流通道120、122，从出口 315离开。在图12所示的实施方式中，进口 310和出口 315与一条灌流通道120 (例如，如图5所示)流体连通；进口 312和出口 317与另一条灌流通道122 (例如，如图5所示)流体连通。因此，可实现对灌流通道内流动的物质、速率和方向的独立控制。在图11-12所示的实施方式中，槽进口 320和槽出口 325与一个或多个槽142 (例如，如图5所示)流体连通。当然，若需要独立控制指定的一个或多个槽内流体的成分、流动速率或方向，可采用一个或多个进口和出口。在图示的实施方式中，细胞室进口 330和出口 335与细胞室流体连通。因此，根据所提供的进口和出口的数量，可视需要改变灌流通道与槽之间的流体组成、流动速率或方向。例如，参考图13A-C，它们显示了代表性微流控设备中的流动实例。灌流通道120、 122和槽142、142’中的箭头指示了流动方向。箭头长度指示了流动速率。可向灌流通道 120、122和槽142、142’中引入相同或不同的流体组合物。在一些实施方式中，可在任何所需时间改变通道或槽中的流动方向，改变流动速率，或者改变流过通道或槽的流体的组成。可利用泵、注射器或其它合适的注射或输注设备将流体引入与细胞室、槽或灌流通道连通的进口。本文所述的微流控设备容易改成适合与可得的自动流体输送系统联用。可根据需要改变本文所述的微流控设备中的结构化表面和灌流通道的构型，以及流动的组合物、方向和速率，以得到逼真模拟活体内组织条件的合适设备。在许多实施方式中，经灌流通道或槽的流动被设置成层流形式，本文所述的层流是指通道或槽中任何指定点的流动方向一般在相同的方向上。或者，出于本发明的目的，层流可视为非湍流。由于设备的微流控性质和用于设备灌流的压力驱动流，沿着灌流通道和槽可形成压降。随着室长度的增加，流动阻力将增大，阻碍槽和灌流通道中的独立流。因此， 室的尺寸可根据所需的流动性质改变。例如，在一些情况下，槽中流动方向总体上与灌流通道中流动方向相反的情形可在500微米的室长度上实现，而在1500微米的室长度上可能实现不了。现在参考图14A-E，它们显示了微流控装置的一个实施方式。上面一张(图14A) 显示了示意性概略图；中间几张(图14B-C)显示了代表性放大图像；下面几张(图14D-E) 显示了更高放大倍数的图像。在图示实施方式中，第一灌流通道120和第二灌流通道122 从细胞培养室130伸出来，进入进口 310、312和出口 315、317。结构化表面140也从细胞室 130伸出来，进入进口 320和出口 325。进口 330与室130流体连通，为将细胞引入室130 提供入口。在图示实施方式中，停留支柱131位于室的一端，防止引入室130的细胞绕过停留支柱131，向着出口 335迁移，所述出口 335也与室130流体连通。可以理解，进口可以是出口，出口可以是进口，具体取决于流体流动方向。现在参考图15，它显示了微流控细胞培养装置的一部分的另一种可选实施方式。 在图示实施方式中，线形槽142伸出结构化表面，并与进口流体连通(与图14所示的整个结构化表面伸出来不同)。在这样的实施方式中，当通入结构化表面的槽而不是结构化表面的整个宽度可操作地连接到进口时，结构化表面上培养的细胞形成严实密封并使槽与灌流通道流体隔离的可能性增大，因为细胞需要在其上形成严实密封以实现隔离的面积减小了(在槽上而不是在结构化表面的整个宽度上)。另外，在这样的实施方式中，通过槽引入的试剂不仅可从细胞培养室底部到顶部形成梯度，而且可从细胞培养室中心到四周形成梯度。微流控设备可用任何合适的一种或多种材料制备，并且可通过任何合适的技术形成。例如，微流控设备或其一部分可通过母体如硅母体形成。所述母体可通过接近式紫外光刻法用硅制造。例如，可用旋涂器将一薄层光刻胶(一种对紫外光敏感的有机聚合物) 旋涂到硅晶片上。光刻胶的厚度决定于旋涂的速度和持续时间。在通过软烘晶片除去一些溶剂后，可使光刻胶通过光掩模受紫外光作用。所述掩模的功能是使光通过某些区域而阻止光通过其它区域，从而将光掩模的图案转移到下面的光刻胶上。然后用显影剂洗去可溶的光刻胶，在硅上留下交联光刻胶的保护性图案。此时，通常将光刻胶保持在晶片上，用作形貌模板(topographic template),用来模制印模(stamp)。或者,可蚀刻娃上未受保护的区域，然后剥离光刻胶，留下图案化硅晶片，得到更稳定的模板。结构化基底上的特征的下限取决于用来形成模板的制造方法的分辨率。此分辨率决定于光在掩模的不透明区域边缘的衍射和光刻胶的厚度。利用波长极短的紫外光( 200纳米)可得到更小的特征。对于亚微米图案(例如蚀刻深度约为100纳米)，可采用PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)上的电子束光刻技术。模板也可通过微机械加工生产，或者可通过例如衍射光栅预先制造。为了能够使母体简单脱模，可在含例如OTS (十八烷基三氯硅烷)或氟硅烷的液相中，利用硅烷化进行抗黏处理。显影之后，可用氟硅烷对晶片进行蒸气涂底，以利于后面除去凸起阵列。可用的氟硅烷的例子包括但不限于(十三氟-1，1，2，2-四氢辛基)三甲氧基娃烧和(十二氣_1，1,2,2-四氧羊基)二乙氧基娃烧。例如，参考图16，它展示了形成设备或其一部分的大致过程。如图16所示，将光刻胶410涂覆在硅晶片400上(A)。然后，将光掩模420如铬掩模放置在光刻胶上(B)，并使所得组件受紫外辐射。洗去光刻胶410上受紫外光作用的区域(C)，蚀刻所得结构(D)，形成硅母体400’，用所述硅母体对聚合物430如聚二甲基硅氧烷(PDMS)进行复制成型。在一些实施方式中，可利用热压印法或注射成型法形成所得聚合物。但是，硅母体在用于这种工艺的条件下可能无法保持得很好。在这种情况下，可制备反向硅母体，然后可在反向母体上沉积金属如镍，形成用于这种工艺的金属母体。任何合适的一种或多种材料均可用来形成微流控设备或其组件。例如，设备或其组件可用无机材料或者塑料或聚合物制造，所述无机材料包括玻璃、二氧化硅、硅、金属等， 所述塑料或聚合物包括树枝状聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯，环烯烃聚合物和共聚物，包括降冰片烯与乙烯的共聚物，碳氟聚合物，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯亚胺；共聚物如乙酸乙烯酯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物，聚糖，聚糖肽，乙烯-丙烯酸共聚物，或者它们的衍生物等。形成设备或其组件或部件的材料可根据所需的机械、细胞相互作用或其它性质选择，以优化独特细胞类型的细胞培养。在多个实施方式中，设备由两个部件组成。例如，参考图17A-B，设备100可由顶部件510和底部件520形成。在图17A所示的设备100中，顶部件510和底部件520在结合前仔细对齐。在图17B所示的设备100中，顶部件510是可密封地结合到底部件520上的板、盖、罩等。顶部件510可包括进口和出口。根据用来形成顶部件510或底部件520的材料，所述部件可自密封。否则，所述部件可通过粘合、焊接等方式密封地接合。可对细胞停留室130 (参见例如图17A)或其一部分进行处理或涂覆，以赋予经过处理或涂覆的表面所需的性质或特性。常用于细胞培养目的的表面处理的例子包括电晕或等离子体处理。在多个实施方式中，凸起或基底表面用聚糖涂覆，如半乳甘露聚糖、藻酸盐/酯等，或者用细胞外基质(ECM)材料涂覆，如天然ECM蛋白质或者合成ECM材料。所选的ECM类型可根据所需的结果和所培养的细胞类型如所需的培养细胞表型变化。天然ECM 蛋白质的例子包括纤连蛋白、胶原、蛋白聚糖和氨基多糖。用于制造合成ECMS的合成材料的例子包括天然α-羟基酸、聚(DL-乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚(_乳酸)(PLLA)以及乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的聚酯。这种热塑性聚合物容易通过包括模压成型、挤出和溶剂流铸在内的各种技术形成为所需的形状。基于氨基酸的聚合物也可用来制造用于涂覆凸起或基底的ECM。例如，ECM中可包含父原样蛋白质、丝状蛋白质和弹性蛋白样蛋白质。在多个实施方式中，ECM包括藻酸盐/酯，它是甘露糖醛酸盐/酯与古罗糖醛酸盐/酯的一类共聚物，在二价离子如Ca2+的存在下形成凝胶。任何合适的加工技术均可用来由合成聚合物制造ECM。例如，可将可生物降解的聚合物加工成纤维、多孔海绵或管状结构。可用一种或多种ECM材料处理涂覆凸起或基底。例如，在一些实施方式中，可将细胞黏附因子(如能够结合整联蛋白受体的多肽，包括含RGD的多肽)或生长因子加入ECM 材料，利用包括吸附或者表面处的共价键合或者整个材料本体中的共价键合在内的途径， 刺激细胞的黏附或特异性功能。可以理解，若进行处理或涂覆，则在决定对细胞室的凸起或其它部件进行何种处理或涂覆上，要在细胞停留室中培养的一种或多种细胞的类型可起重要作用。在许多实施方式中，不在细胞培养室130或其一部分上施涂涂层。具有上述结构化表面的微流控细胞培养制品可用来培养各种细胞，并且可提供重要的三维结构，以便赋予所培养的细胞所需的特性。任何类型或组合类型的细胞(例如肝细胞、干细胞、肾细胞、心脏细胞、神经元细胞或神经胶质细胞等)均可在这种微流控细胞培养制品中培养。现在参考图18-19，它们呈现了使用本文所述的微流控设备的总体方法。在图18 所示的方法中，将细胞引入细胞停留室￠00)，例如经细胞室进口将细胞注入该室内。在许多实施方式中，将足够数量的细胞引入该室，使室内装满细胞。虽然装入该室的细胞的数量可根据所用的一种或多种细胞的类型变化，但约5000-15000个肝细胞足以装满容积为 O. 06毫米3的细胞室。在一些实施方式中，在细胞室中引入少于装满细胞室所需数量的细胞。细胞可通过使细胞增殖到装满细胞室的方式培养，或者可通过不会使细胞室装满细胞的方式培养。所加细胞的数量和细胞室是否装满可取决于所培养的细胞、要研究的影响等。 将细胞引入细胞停留室(600)之后，可经灌流通道注入细胞培养基(610)。经过足够长的时间之后(例如直到细胞形成紧密的衔接点，对肝细胞来说这大约需要3天)，可通过槽注入流体(620)，以产生所需的影响或者研究该影响。参考图19，本文所述的微流控设备可用来测定各种试剂如小分子药理剂或生物剂对细胞的影响，或者细胞对这些试剂的影响。类似于图18所示的方法，将细胞引入设备的细胞停留室(700)，然后经灌流通道注入细胞培养基(710)。培养足够长的时间之后，可使试剂接触细胞(720)。所述试剂可经灌流通道、槽或细胞停留室引入。对试剂和细胞保温合适的时间之后，可测定细胞对试剂的影响、试剂对细胞的影响等(730)。在一些实施方式中，可将传感器、标记物或合适的读数装置结合到设备中，这样就可测定所述影响。在多个实施方式中，从所述设备收集流体或细胞，分析流体，以确定细胞对试剂的影响、试剂对细胞的影响等。流体可从灌流通道、槽或细胞停留室收集。本文已经说明，具有结构化表面的微流控细胞培养制品得到了具有重建极性和类似于活体内的功能的培养肝细胞，这在下面的实施例中将更详细地描述。体外肝细胞广泛用于药物代谢和毒性研究。然而，在常规二维细胞培养基底上培养的肝细胞很快失去极性以及执行药物代谢和转运体功能的能力。为了提高肝细胞维持药物代谢和转运体功能的能力，在成熟的体外模型中培养了肝细胞，包括⑴在MATRIGEL [BD生物科学公司(BD Biosciences), —种动物来源的蛋白质基质]上培养；以及(ii)在两层ECM(如胶原)之间的夹心培养系统中培养。但是，这种系统存在明显的缺点，包括因MATRIGEL 或ECM材料的动物来源而可能对人肝细胞造成抗菌素污染，分子组成复杂，各批次之间存在变化，涂覆不可控。在本文所述的微流控设备中培养肝细胞可克服现有系统的一个或多个缺点。任何肝细胞均可在本文所述的微流控设备中培养。例如，要培养的肝细胞可以是人的或不是人的(例如大鼠、猪等的)肝细胞。可以培养的人肝细胞的例子包括人IfepG2 细胞、人H印G2C3A细胞、永生化的FaM细胞、人原代肝细胞等，或者它们的组合。肝细胞可以任何合适的密度接种在微流控设备的细胞培养室中。为装满细胞培养室，肝细胞的接种密度可约为100000-200000个细胞/微升细胞培养室。接种密度可根据培养条件和持续时间优化。例如，对于长期培养，接种密度可低一些(例如30000-50000个细胞/微升细胞培养室)。在一些实施方式中，能增殖的细胞如hepG2细胞的接种密度可低于装满细胞培养室的密度，所述细胞可通过增殖装满细胞培养室。在多个实施方式中，非增殖细胞如原代肝细胞以装满细胞室的密度接种。可采用任何合适的保温时间和条件，而不管细胞类型如何。可以理解，温度、CO2和 O2的水平、培养基成分等取决于所培养的细胞的性质，并且容易调整。细胞在细胞停留室里的保温时间长短可根据所研究的细胞响应或者所需要的细胞响应变化。在接种细胞之前， 可以将细胞采集并悬浮在合适的培养基例如生长培养基中，细胞一旦被接种到表面上便可在所述基质中培养。例如，可以将细胞悬浮在以下培养基中并在其中进行培养含血清的培养基，条件培养基，或者化学限定的培养基。用于每类细胞的最佳培养基，如美国组织细胞培养中心(American Tissue Cell Culture)或其他供应商推荐的培养基,可在改进之后使用或直接使用。虽然本文未示出，但可以理解，本文所述的微流控设备容易为提高处理容量而多路化，制成多器件芯片形式。例如，这种多器件芯片形式可具有常规96孔板的轨迹。一方面(I)，提供了一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包含具有第一结构化表面的细胞停留室，其中所述结构化表面包含主表面，多个凸起自所述主表面延伸到所述室中，所述多个凸起经适当排列，使所述室内培养的细胞悬浮在主表面上方；以及第一灌流通道，所述第一灌流通道(i)被设置用来运送细胞培养基和(ii)形成多个与所述细胞停留室连通的开口，所述开口被设置用来防止细胞从所述停留室进入所述灌流通道。一方面
(2)，提供了根据第I方面所述的细胞培养装置，其中所述多个凸起中的每个凸起具有被设置用来接触一个或多个所述细胞的细胞接触表面，所述细胞接触表面的径向尺寸小于15 微米。一方面(3)，提供了根据第2方面所述的细胞培养装置，其中每个凸起的所述细胞接触表面的径向尺寸为5-10微米。一方面(4)，提供了根据第1-3方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中每个凸起从所述主表面延伸至5-25微米的高度。一方面(5)，提供了根据第1-4方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中相邻凸起之间的距离小于15微米。 一方面￠)，提供了根据第1-4方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中所述相邻凸起之间的距离约为5-10微米。一方面(7)，提供了根据第1-6方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中在所述多个凸起之间形成槽，所述槽在所述结构化表面的长度上延伸。一方面(8)，提供了根据第7方面所述的细胞培养装置，其中所述装置还包含与所述槽流体连通的进口。一方面(9)，提供了根据第8方面所述的细胞培养装置，其中所述装置还包含与所述槽流体连通的出口，所述出口与所述进口相同或不同。一方面(10)，提供了根据第1-9方面中任何一方面所述的细胞培养装置，所述细胞培养装置还包含形成多个开口且与所述细胞停留室流体连通的第二灌流通道，所述开口的尺寸被设置成防止细胞从细胞室进入所述第二灌流通道。一方面(11)，提供了根据第10方面所述的细胞培养装置，其中所述第一和第二灌流通道位于所述细胞停留室的大致相对的两侧。一方面(12)，提供了根据第1-11方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中所述细胞停留室的宽度为80-110微米。一方面
(13)，提供了根据第1-12方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中所述细胞停留室的高度为40-50微米。一方面(14)，提供了根据第1-13方面中任何一方面所述的细胞培养装置，其中所述第一灌流通道的高度为30-50微米，宽度为30-50微米。另一方面(15)，提供了一种在根据前述权利要求中任一项所述的装置里培养细胞的方法，所述方法包括将细胞引入所述停留室；以及通过所述第一灌流通道注入细胞培养基。一方面(16)，提供了根据第15方面在根据第8-14方面中任何一方面所述的装置里培养细胞的方法，所述方法包括将细胞引入所述停留室；通过所述第一灌流通道注入细胞培养基；以及将细胞培养足够长的时间，使得所述室里的细胞将所述槽与所述第一灌流通道隔离。一方面(17)，提供了根据第16方面所述的方法，所述方法还包括通过所述进口将流体组合物引入所述槽。一方面(18)，提供了一种测定细胞对试剂的影响的方法，所述方法包括将所述细胞引入根据第1-14方面中任何一方面所述的装置的停留室里；使试剂接触所述细胞；以及测定所述细胞对所述试剂的影响。一方面(19)，提供了根据第18方面所述的方法，其中所述使试剂接触所述细胞的步骤包括通过所述第一灌流室注入所述试剂。 一方面(20)，提供了根据第18或19方面所述的方法，其中测定所述细胞对所述试剂的影响的步骤包括分析取自所述槽的流体。一方面(21)，提供了根据第20方面所述的方法，所述方法还包括在分析所述流体之前从所述槽中抽取所述流体。一方面(22)，提供了测定试剂对细胞的影响的方法，所述方法包括将所述细胞引入根据第1-14方面中任何一方面所述的装置的停留室里；使所述细胞接触所述试剂；以及测定所述试剂对所述细胞的影响。一方面(23)，提供了根据第22方面所述的方法，其中所述使所述细胞接触所述试剂的步骤包括通过所述第一灌流室注入所述试剂。一方面(24)，提供了根据第22或23方面所述的方法，其中测定所述试剂对所述细胞的影响的步骤包括分析来自所述槽的流体。一方面(25)，提供了根据第24方面所述的方法，所述方法还包括在分析所述流体之前从所述槽中抽取所述流体。一方面(26)，提供了一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包含具有第一结构化表面的细胞停留室，其中所述结构化表面包含主表面，多个凸起从所述主表面延伸到所述室中，所述凸起中的每个凸起具有与所述主表面相对的细胞接触表面，所述细胞接触表面的径向尺寸小于15微米，每个凸起从所述主表面延伸至大于5微米的高度，相邻凸起之间的距离小于15微米，所述结构化表面包含槽，所述槽的至少一部分在相邻的凸起之间形成，所述槽在所述结构化表面的长度上延伸；与所述槽流体连通的槽进口 ；与所述细胞停留室流体连通的室进口 ；以及第一灌流通道，所述第一灌流通道(i)被设置用来运送细胞培养基和(ii)形成多个与所述细胞停留室连通的开口，所述开口被设置用来防止细胞从所述停留室进入所述灌流通道。一方面(27)，提供了根据第26方面所述的细胞培养装置， 其中所述槽经适当设置，使得在所述室里培养细胞时，所述槽至少与所述室部分隔离。下面给出了非限制实施例，它们描述了以上讨论的制品和方法的各种实施方式。
实施例实施例I :设备的制造和组装四英寸硅树脂晶片用P-20 [Microprime底涂剂P-20，亚利桑那州凤凰城信越微硅公司(Shin-Etsu MicroSi, Phoenix, Arizona)]涂底，在晶片上旋涂 I 微米厚的 Shipley 1813光刻胶[宾夕法尼亚州费城罗门哈斯公司(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)]，旋涂速度为3000rpm，时间为30秒(加速度1000rpm/s)，在110°C热板上软烘I分钟。通过铬掩模使晶片受紫外光作用，所述铬掩模具有所需的结构，用MA6[卡尔萨斯公司(Karl Suss)] 掩模对准器设计成CAD-图形。在80°C后烘2分钟后，对晶片进行最后显影[60-100秒， MF-319,希普利公司(Shipley)],用水彻底清洗,然后干燥。利用Plasma Therm 72氟基反应式离子蚀刻机，在硅树脂中蚀刻具有15微米深的槽以及45微米深的流体通道和细胞培养室的模具。剥离光刻胶并清洁之后，使硅树脂母体接触三氯(1H，1H，2H，2H)-全氟辛基蒸气2小时，进行钝化。通过将前体混合物倾倒在整个4”上[I 10固化剂预聚物， Sylgard 184,美国陶氏康宁公司(Dow Corning)],形成聚二甲基娃氧烧(PDMS)复制品。然后，在室温下将它固化至少24小时，将固化的PMDS从硅树脂模具上剥离，完成制造。在此工艺中适合采用室温固化，因为它能保持高的尺寸真实度。若采用常规热固化(65°C或更高)，从母体上剥离PDMS结构之后，其尺寸与设计值相比会发生较大收缩，这对阵列结构而言是不利的，因为上下室的布局不匹配。用23G 2型尖锐针头为培养基灌流室和细胞培养室钻进出口。利用显微镜将上下PDMS件对准，使它们迅速接触。通过适形接触实现了可逆
彡口口 图20显示了通过上述工艺得到的示例性硅树脂晶片模具的图像。图21显示了复制得到的组装设备的图像。图22A-B显示了设备的可选实施方式的图像，它们显示停留支柱和底通道(或顶通道)亚结构具有不同的尺寸。出于方便的目的，在图21和图22A-B中标出了凸起144、槽142、停留支柱160和灌流通道120、122。如图21、22A和22B所示，停留支柱160以及凸起144和槽142几乎可取任何合适的形状。下面的实施例2-6采用如上所述制备的微流控设备，它们的细胞室具有图14D、 22A、22B所示的底部结构化表面。所示底部结构化表面具有宽度和深度为10微米、高度为15微米的凸起阵列。凸起之间的间距(即槽的宽度)为10微米。细胞培养室的高度为45 微米，长度为15000微米。在图21和图22A中，为了识别槽142，在图中加入了白色直线或折线。实施例2 :微流控设备的微流控特征为了测试所述设备内的灌流通道与细胞培养室之间的传质情况，接下来采用左右灌流通道都只有单一进出口的微流控设备，注射磺酰罗丹明B染料溶液(8. 9xl0_5摩尔/升 SRB,在PBS缓冲液中)和羧基荧光素染料溶液(4xl0_5摩尔/升，在PBS缓冲液中)。在细胞培养室中观察到磺酰罗丹明B的荧光强度增大，并且随流速和时间变化(图23A)，表明沿着停留障碍(支柱)以及在灌流通道与细胞室之间存在良好的流体转运。反过来，当通过细胞室进口引入荧光素(4xl0_5摩尔/升，在PBS缓冲液中)时，观察到沿着停留障碍(支柱)的荧光强度增大，并填满灌流通道(图23B)。在图23A和23B所示的图像中，图像左侧更靠近引入流体的进口，而图像右侧更靠近流体离开所述设备的出口。经细胞室进口将细胞引入微流控细胞培养设备的主室。采用约5微升原代人肝细胞的悬浮液(2百万个细胞/毫升)。将悬浮液里的细胞注射到细胞停留室内，流动速率为O. 5微升/分钟。一旦整个细胞停留室装满细胞(每个设备约10000个细胞)，停止注射细胞悬浮液。用细胞培养基对所述设备灌流3天，然后开始对底部结构通道进行独立灌流。随后经底部通道进口注射非荧光溶液[细胞培养基——MFE必需支持介质(Essential Support Medium) F/MFE培养基补充剂Α，#Κ4105·Χ，泽洛特有限公司(XenoTech)]和荧光溶液(右旋糖酐-罗丹明共轭试剂，丽10000，8毫克/毫升，在HBSS缓冲液中)。如图24Α 所示，细胞附连到亚结构顶部使得流体可在细胞停留室底部独立流过亚结构。这通过图24Α 中仅亚结构区域有荧光染料流动得到证实。荧光染料没有混合或进入细胞室任意一侧的左右灌流通道(比较图24Α和图24Β，其中为了作比较，特意在底部和侧面通道中注入荧光染料)。在所测试的设备中，亚结构通道的灌流流速被设置成大约比两条主要的侧面灌流通道的灌流流速低9/10。因此，所述设备中的灌流流量可经适当设置，以有效模拟活体内观察到的复杂细胞外流体分布，例如提供作为肝组织特征的胆盐梯度。实施例3 :微流控设备中的长期细胞培养在微流控设备中对人原代肝细胞进行保温，以说明它们长期支持表型活性细胞群的能力。将5000-10000个原代人肝细胞[冻存人肝细胞，堪萨斯州勒尼克萨市(Lenexa， Kansas)泽诺特公司]平板接种到微流控设备中(经细胞室端口)，所述设备用MFE细胞培养基以开环模式灌流，流速为I微升/分钟。在96孔板培养中，每天手工更换细胞培养基。 每天监控设备，跟踪细胞形态和健康状况的可能变化。在不同时刻停止保温，进行活/死细胞染色[购自俄勒冈州尤金市分子探针公司(Molecular Probes, Eugene, OR)的用于哺乳动物细胞的LIVE/DEAD活性/细胞毒性试剂盒]，监控细胞存活率和形态。图25-26显示了装在设备中的细胞的图像和活/死细胞染色结果。图25是装在设备的细胞室中培养7天的人原代肝细胞图像(放大20倍)。显微检测证实细胞被装载成三维形式，没有发生延展。据观察，肝细胞(仅)停留在细胞室中， 看上去没有堵塞灌流通道或者阻碍穿过停留支柱的灌流过程。图26A-B是代表性荧光图像(A :放大5倍；B :放大20倍)，显示了保温7天后的活/死细胞染色结果。经活/死细胞染色，绿荧光表示细胞是活的，红荧光表示细胞是死的。尽管从本文提供的黑白复制图看得不明显，保温7天后接近100%的细胞是活的(绿荧光)。图26A-B所示的图像说明，微流控培养设备能够穿过停留障碍和通过装满肝细胞的细胞培养室，使分析试剂发生有效灌流。实施例4 :细胞培养室底部的亚结构特征的影响图27A-B是以三维形式装载在无底部亚结构(27A)和有底部亚结构(27B)的细胞室中的肝细胞在保温7天之后拍摄的荧光图和明场图。在图27A中，最左边的一张是荧光图(5倍)，右边三张是放大5倍、20倍和20倍(分别从左到右)的亮场图。在图27B中， 最左边一张是荧光图(放大10倍)，中间一张是亮场图(放大10倍)，右边一张是亮场图 (放大20倍)。无论是培养在有底部亚结构的设备中还是培养在无底部亚结构的设备中，几乎所有的肝细胞都是活的(基于用上述活/死细胞染色得到的绿荧光，这在本文提供的黑白复制图中看不到)。但是，形态评价揭示，在无底部亚结构的设备上培养的细胞没有紧密融合。 与之形成对照，在细胞室的底部亚结构上培养的肝细胞显示出更组织状形貌，细胞紧密融合(图27最右边一张中的箭头)，三维组织结构显示光滑边缘，证明了细胞融合的程度，其形貌像组织。实施例5 :流控对细胞的影响为测试微流控设备的灌流通道中灌流流动的重要性，采用以下两种条件在微流控设备中培养细胞使细胞培养基流过灌流通道；使细胞培养基静止地存在于通道中(无连续流动)。简而言之，将大约10000个冻存的人肝细胞(堪萨斯州勒尼克萨市泽诺特公司) 引入设备。使用5微升/小时的灌流流速。对于静止条件，每天手工更换细胞培养基。细胞总共保温7天。图28显示了灌流条件下培养的细胞的三张亮场图。左图显示了组装设备中的细胞。中图显示了取走设备盖之后的细胞。取走盖之后，细胞看上去是融合的，并保持其构型。 右图显示了从设备中移出之后的细胞。同样，细胞保持其融合构型。图29显示了在静态条件下培养的细胞的三张亮场图。左图显示了组装设备中的细胞。中图显示了取走设备盖之后的细胞。细胞看上去是死的、孤立的，没有形成类似于融合组织的结构。右图显示了从设备中移出后的细胞。同样，细胞看上去是死的、孤立的，没有形成类似于融合组织的结构。图30显示了在具有微流控设备的结构化底表面的96孔板上培养的细胞的两张亮场图，所述结构化底表面复制在孔的底表面上。在MFE必需平板培养基F(#K4000)中，每孔接种约60000个冻存人肝细胞(堪萨斯州勒尼克萨市泽诺特有限公司)。保温24小时后， 将培养基换成MFE必需支持介质F/MFE培养基补充剂A (#K4105. X，泽诺特有限公司)。保温期间，每天更换培养基。细胞保温7天。左图是在经等离子体处理的PDMS基底上培养的细胞。右图是在未经处理的PDMS上培养的细胞。两种情况中，静态细胞培养条件不支持三维组织状细胞结构。在96孔板的结构化PDMS表面上于静态条件下培养的肝细胞形成单层培养物，相对于平坦区域，它们没有优先识别结构化区域。微流控设备提供了多个独立的灌流通道，用于在连续介质(流体)流动中培养细胞。基于设计维度的流体灌流模拟肝循环，将气体和营养物高效地连续转运到肝细胞，并高效地连续清除代谢物或细胞废物。细胞室底部的微结构化下流通道使得可以从设备的另两条灌流通道独立地进行灌流。多灌流通道有效转运介质(营养物)、分析试剂和细胞废物， 从而将活细胞培养保持更长的时间。另外，动态细胞培养条件影响三维细胞的形成，这些细胞在不加动物来源的或合成的基质或凝结剂的情况下即可紧密融合成组织状细胞结构，所述结构从设备中移出后保持完好(图28)。设备中的静态培养条件产生孤立的细胞，这些细胞在保温过程中死亡，并且在拆开设备时容易分散(图29)。类似地，在具有结构化PDMS表面的96孔板(复制所述设备的细胞室底部)中的静态细胞培养条件也不支持三维组织状细胞结构。在96孔板的结构化PDMS表面上于静态条件下培养的肝细胞形成单层培养物，相对于平坦区域，它们没有优先识别结构化区域(图30)。实施例6 :膜极性的重建和肝细胞特异性功能细胞外基质(ECM)和其它非实质细胞联合将活体内的肝细胞支撑在三维结构中。 在常规体外二维细胞培养形式中，原代肝细胞迅速去分化，因为细胞-细胞相互作用有限， 并且细胞不能恢复类似于活体内的细胞组构活动。原代肝细胞的分化功能的维持依赖于形态结构和膜极性的重建。已经明确，原代肝细胞的代谢功能与不同培养结构诱导形成的肝细胞极性相关。因此，肝细胞极性的重建对维持肝细胞功能很重要。如上所述，细胞室底部的亚结构提供了穿过这些微结构的下流通道，该下流通道提供独立的灌流。这种设计特征影响紧密融合的组织状细胞结构的形成。三维细胞培养形貌促进细胞膜极性的重建(图31-32)和肝细胞特异性功能如转运功能的重建(图 33)，而不需要加入动物来源的或合成的基质或凝结剂。通过图31-32中的免疫染色可以看到，形成了长长的三维胆小管结构[从胆小管标记物MRP2和间隙连接蛋白即连接蛋白 32 (Connexin 32)的表达可看出]，这证实了细胞膜极性。简而言之，在微流控设备内灌流培养7天后，细胞用PBS中的3%多聚甲醛固定，通过Triton X-100 (1%，在PBS中)获得通透性，并在4°C的温度下用一级抗体的混合物[用封闭缓冲液按I : 100稀释，鼠连接蛋白32 (Connexin 32)抗体，非结合单克隆抗体，25微克/毫升；兔MPR2抗体，多克隆抗体，9微克/毫升，阿巴卡姆公司(Abcam)]保温过夜。保温之后，样品用PBS中的O. I % 吐温20 (Tween 20)洗涤，并用结合到FITC(494/518纳米)和Cy3 (550/570纳米)荧光标记物上的二级抗体保温。用洗涤缓冲液将未结合的抗体洗出(3x200微升)，用20微升 Vectashield封片剂覆盖，所述封片剂中补充了荧光DAPI染色剂，用来对细胞核进行染色。在常规二维细胞培养中，当存在MRP2蛋白质时，观察到它表达为一些细胞之间断开的小点，说明形成有限的胆小管结构(参见图33A，其中肝细胞在常规96孔板上培养)。 在常规96孔板上培养7天后，细胞用MPR2底物[5微摩尔/升5-(6)羧基-2’ 7’ 二氯荧光素二乙酸酯的细胞培养基溶液]保温10分钟。羧基-2’ V 二氯荧光素二乙酸酯被细胞吸收并代谢。代谢物被MRP2蛋白质主动排泄到胆小管结构中。用荧光显微法(494/518纳米)监控荧光素代谢物的换位，从而得到胆小管结构在细胞聚集体内的动态功能染色。MRP2蛋白质同样负责细胞到胆小管结构的转运功能。近年来，转运功能常称作肝内第III阶段药物代谢，对于药物代谢物的清除或者药物化合物主动转运到细胞中非常重要。图33B给出了一幅动态分析图像，其中荧光素二乙酸酯被肝细胞被动吸收，经MRP2转运蛋白主动转运到延长的胆小管结构中，显示了微流控设备中的肝细胞特异性功能。简而言之，用MPR2底物[5微摩尔/升5-(6)羧基-2’ 7’ 二氯荧光素二乙酸酯的细胞培养基溶液]以I微升/分钟的流速对所述设备灌流10分钟。用荧光显微法(494/518纳米)监控荧光素代谢物的换位，从而得到胆小管结构在所述设备内的动态功能染色。经由细胞-细胞间信号传递的极性重建以及紧密融合的组织状三维细胞结构的形成极大地促进了此功能。据我们所知，这种延长的三维胆小管结构的形成(膜极性的重建)和人原代肝细胞转运功能在微流控设备中的表现以前从未展示过或报告过。总之，本发明描述了一种微流控设备的设计和在体外维持处于高度分化状态的细胞的功能的方法。在组织工程应用和候选治疗剂的评价中，在体外系统中培养的细胞支持其活体内功能的能力非常重要。所述细胞培养体系可用来支持长期细胞培养，促进类似于活体内细胞组构的重建，以提高所培养的细胞的表型特异活性，从而提供与生理相关的信息，用于基于细胞的测试。因此，本发明揭示了“用来培养细胞的微流控设备”的实施方式。本领域的技术人员可以理解，本文所述的细胞培养装置和方法可以采用除上述公开之外的其它实施方式实施。本文所述的实施方式是出于说明的目的，而不构成限制。
权利要求
1.一种细胞培养装置，所述装置包含具有第一结构化表面的细胞停留室，其中所述结构化表面包含主表面，多个凸起自所述主表面延伸到所述室中，所述多个凸起经适当排列，使所述室内培养的细胞悬浮在所述主表面上方；以及第一灌流通道，所述第一灌流通道(i)被设置用来运送细胞培养基和(ii)形成多个与所述细胞停留室连通的开口，所述开口被设置用来防止细胞从所述停留室进入所述灌流通道。
2.如权利要求I所述的细胞培养装置，其特征在于，所述多个凸起中的每个凸起具有被设置用来接触一个或多个所述细胞的细胞接触表面，所述细胞接触表面的径向尺寸小于 15微米。
3.如权利要求2所述的细胞培养装置，其特征在于，每个凸起的所述细胞接触表面的径向尺寸为5-10微米。
4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，每个凸起从所述主表面延伸至5-25微米的高度。
5.如权利要求1-4中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，相邻凸起之间的距离小于15微米。
6.如权利要求1-4中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，相邻凸起之间的距离为5-10微米。
7.如权利要求1-6中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，在所述多个凸起之间形成槽，其中所述槽在所述结构化表面的长度上延伸。
8.如权利要求7所述的细胞培养装置，其特征在于，所述装置还包含与所述槽流体连通的进口。
9.如权利要求8所述的细胞培养装置，其特征在于，所述装置还包含与所述槽流体连通的出口，所述出口与所述进口相同或不同。
10.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养装置，所述装置还包含形成多个开口且与所述细胞停留室流体连通的第二灌流通道，所述开口的尺寸被设置成防止细胞从细胞室进入所述第二灌流通道。
11.如权利要求10所述的细胞培养装置，其特征在于，所述第一和第二灌流通道位于所述细胞停留室的大致相对的两侧。
12.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞停留室的宽度为80-110微米。
13.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞停留室的高度为40-50微米。
14.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述第一灌流通道的高度为30-50微米，宽度为30-50微米。
15.一种在前述权利要求中任一项所述的装置中培养细胞的方法，所述方法包括将细胞引入所述停留室；以及经所述第一灌流通道注入细胞培养基。
16.一种在权利要求8-14中任一项所述的装置中培养细胞的方法，所述方法包括将细胞引入所述停留室；经所述第一灌流通道注入细胞培养基；以及将细胞培养足够长的时间，使得所述室内的细胞将所述槽与所述第一灌流室隔离。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括经所述进口将流体组合物引入所述槽。
18.一种确定细胞对试剂的影响的方法，所述方法包括将所述细胞引入权利要求1-14中任一项所述的装置的停留室中；使所述试剂接触所述细胞；以及确定所述细胞对所述试剂的影响。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，使所述试剂接触所述细胞的步骤包括经所述第一灌流室注入所述试剂。
20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，确定所述细胞对所述试剂的影响的步骤包括分析取自所述槽的流体。
21.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括在分析所述流体之前从所述槽中抽取所述流体。
22.—种确定试剂对细胞的影响的方法，所述方法包括将所述细胞引入权利要求1-14中任一项所述的装置的停留室中；使所述细胞接触所述试剂；以及确定所述试剂对所述细胞的影响。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，使所述细胞接触所述试剂的步骤包括经所述第一灌流室注入所述试剂。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，确定所述试剂对所述细胞的影响的步骤包括分析取自所述槽的流体。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括在分析所述流体之前从所述槽中抽取所述流体。
26.一种细胞培养装置，所述装置包含具有第一结构化表面的细胞停留室，其中所述结构化表面包含主表面，多个凸起从所述主表面延伸到所述室中，所述凸起中的每个凸起具有与所述主表面相对的细胞接触表面，所述细胞接触表面的径向尺寸小于15微米，每个凸起从所述主表面延伸至大于5微米的高度，相邻凸起之间的距离小于15微米；所述结构化表面包含槽，所述槽的至少一部分在相邻的凸起之间形成，所述槽在所述结构化表面的长度上延伸；与所述槽流体连通的槽进口；与所述细胞停留室流体连通的室进口 ；以及第一灌流通道，所述第一灌流通道(i)被设置用来运送细胞培养基和(ii)形成多个与所述细胞停留室连通的开口，所述开口被设置用来防止细胞从所述停留室进入所述灌流通道。
27.如权利要求26所述的细胞培养装置，其特征在于，所述槽经适当设置，使得在所述室里培养细胞时，所述槽至少与所述室部分隔离。
全文摘要
一种微流控细胞培养装置，所述装置包含细胞停留室和灌流通道。细胞停留室具有结构化表面。结构化表面包含主表面，多个凸起从主表面延伸到室中。所述多个凸起经适当排列，使室内的细胞悬浮在主表面上方。第一灌流通道被设置用来提供经过通道的流体层流，形成与细胞停留室连通的多个开口。所述开口被设置用来防止细胞从停留室进入灌流通道。
文档编号C12M1/12GK102612554SQ201080046896
公开日2012年7月25日 申请日期2010年10月12日 优先权日2009年10月12日
发明者O·N·佩措尔德, R·A·法利斯, V·N·戈拉尔, 谢宜铮, 阮宝祺 申请人:康宁股份有限公司