专利名称：编码木脂素甲基化酶的基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有木脂素甲基化活性(将甲基转移给木脂素的活性)的酶、编码该酶的基因、使用该基因制造甲基化木脂素的方法等。
背景技术：
作为植物次级代谢产物的一种的木脂素广泛分布于植物界(非专利文献Umezawa, T. (2003)Phytochem. Rev. 2，371-390)，其中，具有有价值的生物活性的木脂素被用于医药品和健康食品。已知例如作为胡麻科芝麻的双并四氢呋喃型木脂素的代表的芝麻素具有抗氧化性、改善脂质代谢、保护肝功能等的功能性并已有市售(非专利文献I :Nakai, M. , et al. (2003) J. Agri. FoodChem. 51, 1666-1670 ;非专利文献 2 Tsuruoka, T. etal. (2005)Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188)。
另一方面，作为小檗科盾叶鬼臼(美洲八角莲)的根中含有的芳基四氢萘内酯型抗肿瘤性木脂素的鬼白毒素因具有抑制细胞分裂的活性，被用于抗癌剂及新型抗癌剂的开发(非专利文献 3 :Ayres, D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans: Chemical Biological andClinical Properties. CambridgeUniv. Press, Cambridge, U. K.)。此外，认为许多木脂素被摄取后，在体内代谢为具有雌激素样活性的肠内酯。如此，相对于木脂素类的有用性不断趋于明了，对于其生物合成途径中有关催化剂酶基因的信息却很有限(非专利文献4 Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003)Phytochem.Rev. 2, 257-288)。木脂素生物合成主要是用木犀科连翘、小檗科盾叶鬼臼及亚麻科亚麻进行了研究，由通过作为单木质醇的一种的松柏醇的氧化聚合而赋予的双并四氢呋喃木脂素的松脂醇开始。文献显示了在芝麻中，松脂醇通过作为细胞色素P450酶的CYP81Q1在松脂醇上形成两个亚甲基双氧环而转换为芝麻素，进而作为其代谢产物的芝麻酚被糖苷化(非专利文献 5 :Noguchi, A.，et al (2008)Plant J. 54，415-427)。在具有内酯环的木脂素生物合成途径中，松脂醇通过松脂醇·落叶松树脂酚(Iariciresinol)还原酶(PLR)经过落叶松树脂酚而代谢为开环异落叶松树脂酚(非专利文献4)。开环异落叶松树脂酚进一步通过开环异落叶松树脂酚脱氢酶(SIRD)转换为罗汉松树脂酚。有关具有罗汉松树脂酚以后的内酯环的木脂素代谢途径，需要经过直至鬼白毒素糖苷的多个酶反应，但仅报道了一些酶活性，还未达到实际进行酶的分离(非专利文献6 :Sakakibara, N. , et al (2003) Org. Biomol. Chem. I, 2474-2485)。已知在伞形科蛾参的叶、根中，含有亚太因、鬼臼毒素等具有内酯环的木脂素。文献进一步显示出通过标记物给药实验，亚太因经过thu jap Ii cat in ( Y 7° I)力f >)、5位methylthujaplicatin (5 位 J 子卟化'乂 Y 7。丨J 十 >)、4，5 位 methylthujaplicatin 而被生物合成(非专利文献6)。现有技术文献
非专利文献非专利文献I J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670(2003)非专利文献2 Biosci. Biotech. Biochem. 69，179-188 (2005)非专利文献 3 Lignans:Chemical Biological and Clinical Properties.Cambridge Univ. Press, Cambridge, U. K. (1990)非专利文献4 Phytochem. Rev. 2，257-288 (2003)非专利文献5 Plant J. 54，415-427 (2008)非专利文献6 0rg. Biomol. Chem. I, 2474-2485 (2003)
发明内容
发明要解决的课题在此种状况下，希望鉴定出参与木脂素生物合成的新型酶及编码该酶的基因。解决课题的方法本发明是鉴于上述状况而完成的，并提供如下所示的具有木脂素甲基化活性的酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、转化体、使用该转化体制造甲基化木脂素的方法等。(I) 一种多核苷酸，其是由以下(a) (d)组成的组中选出的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有序列号1的碱基序列；(b)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中I 50个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质 '及(d)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。(Ia)多核苷酸，其是由以下(e) (f)组成的组中选出的多核苷酸，(e)多核苷酸，其与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质；及(f)多核苷酸，其与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质。(2)根据上述(I)中所述的多核苷酸，其选自由以下(g) (h)组成的组中(g)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中I 15个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质；及(h)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。(2a)根据上述(I)中所述的多核苷酸，其如下所示(i)多核苷酸，其与由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸或由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质。
(3)根据上述(I)中所述的多核苷酸，其中，含有序列号1的碱基序列。(4)根据上述(I)中所述的多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。(5)根据上述(I) (4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。(6) 一种蛋白质,其由上述(I) (5)中任一项所述的多核苷酸编码。(7) 一种载体，其含有上述(I) (5)中任一项所述的多核苷酸。(8) 一种非人转化体，其导入了上述(I) (5)中任一项所述的多核苷酸。(9) 一种非人转化体，其导入了上述(7)中所述的载体。
(10) —种蛋白质的制造方法，其中，培养上述(8)或(9)中所述的转化体或使其生长发育，由该转化体提取具有木脂素甲基化活性的蛋白质。(11)根据上述(10)中所述的方法，其中，上述转化体为用上述(I) (5)中任一项所述的多核苷酸转化的芝麻、连翘或亚麻。(12) —种甲基化木脂素的制造方法，其中，培养上述(8)或(9)中所述的转化体或使其生长发育，由该转化体提取甲基化木脂素。(13)根据上述(12)中所述的方法，其中，上述转化体为用上述(I) (5)中任一项所述的多核苷酸转化的芝麻、连翘或亚麻。发明的效果根据本发明，可将thujaplicatin等的木脂素甲基化，所以，对探究具有新型功能的木脂素化合物有用。使用本发明的基因探究的化合物或将其作为中间体而得到的化合物可成为医药的有效成分、功能性食品材料、园艺植物中诱导新花色的分子。例如，在后述实施例中得到的methylthujaplicatin作为鬼臼毒素的中间体而有用，所述鬼臼毒素是作为抗癌剂而熟知。因此，本发明在医药品业、食品业、农业等中有用。
图I 分别表不 5’_methylthujaplicatin (上段)、4_methylthujaplicatin (中段)、5-methylthujaplicatin(下段)的标准样品的GC-MS图。TIC意指总离子流色谱图(TotalIon Chromatogram)。图2 分别表不 5，_methylthujaplicatin (上段)、4_methylthujaplicatin (中段)、5-methylthujaplicatin(下段)的标准样品的MS谱图。各个中共同出现的532的离子表示被三甲基娃烧(TMS)化的methylthujaplicatin。图3 表示酶反应底物的 thujaplicatin (左式)及 5 位 methylthujaplicatin (右式)。图中的数字表示各个化学式在用粗折线表示的位置被切割时所产生的碎片离子的推定MS谱图的值。图4 分别表不(A) thujaplicatin 标准品、(B) 5-methylthujaplicatin 的标准品、(C) methylthujaplicatin 和 AsOMTl 16 的反应液、(D) methylthujaplicatin 和煮沸的AsOMTl 16的反应液的GC-MS图。TIC意指总离子流色谱图(Totallon Chromatogram)。图5分别表示(A)作为底物的methylthujaplicatin标准品的MS谱图、(B)5-methylthujaplicatin 的标准品的 MS 谱图、(C)methylthujaplicatin 和 As0MT116 的反应生成物的MS谱图、及(D) AsOMTl 16催化的木脂素甲基化反应的模式图。
具体实施例方式本说明书中，“木脂素”为两分子具有C6C3骨架的苯丙素化合物主要通过它们的8-8’位聚合(8，8’_键)而成的化合物。木脂素被认为有助于植物中的生物防御机构(参照Phytochemistry Rev. 2,371-390 (2,003))。作为代表性的木脂素，可列举为芝麻中含有的(+ )-芝麻素、(+ )-芝麻素酚、(+)-松脂醇、(+ )-胡椒醇及(+ )-芝麻林素酹；连翅(Forsythia intermedia)中含有的(+)_松脂醇、(-)-牛蒡子苷元及(-)_罗汉松树脂酹；甘肃瑞香(Daphne tangutica)中含有的(_)-松脂醇及(_)-落叶松树脂酹；亚麻(Linum usitatissimum)中含有的(+)_开环异落叶松树脂酹等。这些木脂素的分子结构多种多样(参照Wood Research 90, 27-110(2，003)等)。( + )_松脂醇为早期木脂素，被分类到用最广泛的植物种鉴定的双并四氢呋喃型的木脂素类。作为芝麻木脂素之一的芝麻素具有丰富多彩的生理活性作用，对胆固醇代谢、肝功能及免疫功能的改善有效(例如，参照芝麻的科学和功能性、并木满夫编丸善PLANET公司(Π子Q科学i機能性、並木満夫編丸善9木”卜社)(1998))。将芝麻素从芝麻种子或芝麻柏中分离纯化的方法已被实际应用(例如，日本特开2001-139579公报、·日本特开平10-7676号公报等)，将芝麻素作为主要成分的具有酒精分解促进作用的肝功能改善/增强剂已进行市售(商品名芝麻素，经销商三得利株式会社)。此外，还报道了除芝麻素以外的其它木脂素(例如，芝麻素酚、芝麻林素等)也具有生理活性作用(例如，参照日本农艺化学会志、76 :805-813(2002))。如此地，木脂素或其衍生物作为具有各种生理活性的生理活性物质或其中间体而有用。以下，详细说明本发明的将甲基转移给木脂素的酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、转化体等。I.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有序列号1的碱基序列 '及(b)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。多核苷酸可以为DNA，也可以为RNA。本发明中作为对象的多核苷酸不限于上述(a)及(b)的多核苷酸，还包含编码与由这些多核苷酸编码的蛋白质功能相同的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如可列举(C)由序列号2的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。作为此种蛋白质，可列举由序列号2的氨基酸序列中例如I 50个、I 40个、I 39个、I 38个、I 37个、I 36个、I 35个、I 34个、I 33个、I 32个、I 31个、I 30个、I 29个、I 28个、I 27个、I 26个、I 25个、I 24个、I 23个、I 22个、I 21个、I 20个、I 19个、I 18个、I 17个、I 16个、I 15个、I 14个、I 13个、I 12个、I 11个、I 10个、I 9个、I 8个、I 7个、I 6个(I 几个)、1 5个、I 4个、I 3个、I 2个、I个氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或附加的数量通常越小越优选。此外，作为此种蛋白质，例如可列举(d)具有与序列号2的氨基酸序列有约70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上同一性的氨
基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。上述同源性的数值通常越大越优选。本说明书中，“木脂素甲基化活性”意指将木脂素甲基化的活性、即将甲基转移给木脂素的活性。“木脂素甲基化活性”，可通过使作为甲基供体的SAM和作为底物的木脂素与木脂素甲基化酶反应，并对其反应生成物实施HPLC或LC-MS分析来进行测定或确认。通常的甲基化酶活性测定法已记载于公知文献中(例如，参照Toquin, V. , et al. (2003)PlantMol. Biol. 52，495-509.，Gang, D. R.，et al. (2002)Plant Cell 14，505-519 等)。此外，本发明还包含(e)多核苷酸，其与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质；及(f)多核苷酸，其与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质。·在此，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，以由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸或由编码序列号2所示的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等而得到的多核苷酸(例如，DNA)。作为杂交的方法，例如可使用“Molecular Cloning 3rd Ed.、CurrentProtocols in Molecular Biology, Johnffiley & Sons 1987-1997” 等中所记载的方法。本说明书中提到的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、O. 5%SDS、50%甲酰胺、32°C的条件。另外，“中严谨条件”例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、O. 5%SDS、50%甲酰胺、42°C的条件。“高严谨条件”例如为5 X SSC、5 X Denhardt溶液、O. 5%SDS、50%甲酰胺、50°C的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如，DNA)。但作为影响杂交严谨性的因素，认为还有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适当选择这些因素，可实现同样的严谨性。且杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司制)。此时,根据试剂盒中附带的说明方案,与标记后的探针孵育过夜后，将膜在55 °C的条件下用含有O. l%(w/v) SDS的最初的洗涤缓冲液(I次洗浄K ''J 7 7 —、洗涤，之后可检测杂交后的多核苷酸(例如，DNA)。作为除上述以外可杂交的多核苷酸，可列举通过FASTA、BLAST等的同源性搜索软件并使用默认参数计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸有约70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99% 以上、99. 1% 以上、99. 2% 以上、99. 3% 以上、99. 4% 以上、99. 5% 以上、99. 6% 以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上同一性的多核苷酸。此外，氨基酸序列、碱基序列的同一性可使用根据Karl in及Altschul的BLAST算法(proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268，1990 ; proc Natl Acad SciUSA 90:5873，1993)确定。开发了基于BLAST算法的、被称为BLASTN、BLASTX的程序(AltschulSF, et al J Mol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score=100、word length = 12。另外,使用BLASTX分析氨基酸序列时,参数例如为score = 50、word length = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时,使用各程序的默认参数。上述本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获得。2.本发明的蛋白质本发明还提供由上述多核苷酸(a) ⑴中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质是由序列号2的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。作为此种蛋白质，可列举由序列号2的氨基酸序列中如上所述数量的氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。此外，作为此种蛋白质，可列举具有与序列号2的氨基酸序列有如上所述的同源性的氨基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。 此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols inMolecularBiology》、“Nuc. Acids. Res. , 10, 6487 (1982) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 79，6409(1982) ”、“Gene, 34，315(1985) ”、“Nuc. Acids. Res.，13，4431 (1985) ”、“Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 82，488(1985) ”等中所述的定点诱变法获得。本发明的蛋白质的氨基酸序列中I个以上的氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加，是指在同一序列中的任意、且I个或多个氨基酸序列中的位置上，I个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加之意，缺失、取代、插入和附加中的两种以上也可同时发生。以下举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸出组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；(组天冬酰胺、谷氨酰胺山组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸出组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。此外，本发明的蛋白质也可通过Fmoc法(9_荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法来制造。此外,还可利用Advanced Chem Tech公司制、拍金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、ProteinTechnology Instruments 公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。本发明的蛋白质可催化上述的木脂素(特别是thujaplicatin)的甲基化反应。3.载体及导入该载体的转化体其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a) (i)中任一项所述的多核苷酸(DNA )。本发明的载体通常具有如下构成，即本发明的载体含有(i )在宿主细胞内可转录的启动子；(ii)与该启动子结合的上述(a) (j)中任一项所述的多核苷酸与RNA分子的转录终止和多聚腺苷化有关的、在宿主细胞内起作用的信号作为构成因子的表达盒。如此构建的载体被导入宿主细胞。作为表达载体的制备方法，可列举使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但无特别限定。
载体的具体种类无特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即根据宿主细胞的种类，为使本发明的多核苷酸确切地表达，选择适合的启动子序列，将其与本发明的多核苷酸整合进各种质粒等中而获得载体，并将该载体作为表达载体使用即可。本发明的表达载体依赖于应导入的宿主的种类而含有表达调控区(例如，启动子、终止子和/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用常用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、Iac启动子等)，作为酵母用启动子，例如可列举3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpC等。此外，作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如，SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。表达载体优选含有至少一个选择标记。作为此种标记，可使用营养缺陷型标记(ura5> niaD)、抗药性标记(潮霉素(hygromycine)、Zeocin)、遗传霉素(geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUPl) (Marin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992; Hussain etet al. , gene, 101, 149, 1991)等。
此外，本发明还提供导入了上述(a) (i)中任一项所述的多核苷酸的转化体。3.转化体本发明提供导入了上述编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质的多核苷酸的转化体或细胞。在本说明书中，术语“转化体”的意义不仅包含组织或器官，还包含生物个体。转化体或细胞的制备方法(生产方法)无特别限定，例如，可列举将上述重组载体导入宿主进行转化的方法。在此使用的宿主细胞无特别限定，可优选使用以往公知的各种细胞。具体地说，例如可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等的细菌、酵母(芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae、裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe)、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)的卵母细胞等。用于上述宿主细胞的适合的培养基和条件为本领域所周知。此外，对作为转化对象的生物也无特别限定，可列举在上述宿主细胞中例示的各种微生物、植物或动物。本发明的转化体或细胞的特征在于，改变了这些转化体或细胞天然具有的木脂素和/或甲基化木脂素的组成。本发明的转化体或细胞优选为植物或其后代、或来自它们的组织，特别优选芝麻、连翘或亚麻。此种转化体或细胞通过使用本发明的控制甲基化木脂素含量的方法，能够增加或减少产生木脂素的生物中的甲基化木脂素的含量。本发明的转化体可为植物转化体。本实施方式的植物转化体如下获得将包含本发明的多核苷酸的重组载体，以使由该多核苷酸编码的蛋白质能够表达的方式，导入植物中来获得。使用重组表达载体时，用于植物体转化的重组表达载体，只要是能够使本发明的多核苷酸在该植物内表达的载体即可，无特别限定。作为此种载体，例如，可列举具有在植物细胞内使多核苷酸组成型表达的启动子(例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体或具有通过外界刺激而被诱导性地激活的启动子的载体。本发明中成为转化对象的植物，是指植物体全株、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、柵状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶片切片、愈伤组织等中的任一种。作为用于转化的植物无特别限定，也可为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物中的任一种。向植物内导入基因，可使用本领域技术人员公知的转化方法(例如，农杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等)。例如，农杆菌介导的方法和直接向植物细胞导入的方法为众所周知。使用农杆菌法时，将构建的植物用表达载体导入适合的农杆菌(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)),此菌株根据叶盘法(内宫博文著,植物基因操作手册(1990) 27 31页，讲谈社scientific，东京(内宫博文著、植物遺伝子操作^ 二二 T >(1990)27 31頁、講談社寸4 r λ 7 λν々、東京))等感染无菌培养叶片，可获得转化植物。此外，还可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.，67，325 (1990))。此方法为如下方法首先，例如将表达载体导入农杆菌，然后将经转化的农杆菌用Plant MolecularBiology Manual (S. B. Gelvin 等、Academic PressPublishers)中记载的方法导入植物细胞或植物组织。在此，“植物组织”包括通过植物细胞培养而得到的愈伤组织。当使用农杆菌法进行转化时，可使用双元载体(PBI121或pPZP202等)。
此外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，已知有电穿孔法、基因枪法。使用基因枪时，可直接使用植物体、植物器官、植物组织自身，也可在制备切片后使用，还可制备原生质体后使用。可将如此制备的样品使用基因导入装置(例如ros-iooo(BI0-RAD公司)等)处理。处理条件虽然因植物或样品不同而不同，但通常用450 2000psi左右的压力、4 12cm左右的距离进行。导入了基因的细胞或植物组织，首先使用潮霉素抗性等的抗药性选择，其次通过常规方法再生为植物体。由转化细胞进行的植物体的再生，可根据植物细胞的种类采用本领域技术人员公知的方法进行。当将植物培养细胞作为宿主使用时，转化是将重组载体用基因枪、电穿孔法等导入培养细胞。作为转化结果而得到的愈伤组织、不定芽、须根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，此外，还可使用以往已知的植物组织培养法，并通过投入适当浓度的植物激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)再生为植物体。确认基因是否被导入植物,可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。例如，从转化植物中制备DNA，设计DNA特异性引物以进行PCR。一旦获得本发明的多核苷酸整合进基因组内的转化植物体，即可通过该植物体的有性生殖或无性生殖得到其后代。此外，从该植物体或其后代或这些的克隆中，例如可得到种子、果实、切穂、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等，并以这些为基础可进行该植物体的量产。因此，本发明中也包括可表达地导入本发明的多核苷酸的植物体或与该植物体具有同一特性的该植物体的后代或来自它们的组织。此外，已报到了针对各种植物的转化方法。作为本发明的转化体植物,例如可列举为芝麻、稻子、烟草、大麦、小麦、菜籽、马铃薯、番茄、杨树、香蕉、桉树、甘薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、玫瑰、菊花、香石竹、金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗、小苍兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、天竺葵、老鹳草、矮牵牛、蓝猪耳、郁金香、连翘、拟南芥、亚麻、蛾参和百脉根等，但并不限于此。在优选实施方式中，可使用芝麻制备本发明的转化体。作为芝麻转化体的制备方法，例如可列举 T. Asamizu: Transformation of sesame plants using MAT vectorsystem:introduction of fatty acid desaturase genes. Sesame Newsletter 16:22 25(2002)中记载的公知的方法。若使用如上所述得到的转化芝麻，由于在该芝麻内生产甲基化木脂素，所以，可通过低成本且对环境负荷低的生产工艺来生产甲基化木脂素(例如，methylthujaplicatin)。在其他优选实施方式中，作为本发明的转化体，可优选使用烟草。烟草与矮牵牛等均是容易转化的代表性植物，由一个去除了细胞壁的细胞(原生质体)即可再生一个植物个体。该再生的一个植物个体因与来自多细胞的一个个体不同，不会形成嵌合状，所以可有效地制备转化体。作为烟草转化的优选方法，可列举叶盘法。此方法是操作简便，且可从I枚叶切片得到多个独立转化体的方法。转化的方法，如“新生物化学实验手册3核酸的分离 分析和基因实验法化学同人(新生物化学实验O手引务3核酸O分離·分析i遺伝子实验法化学同人)1996年”中记载。
若使用如此得到的转化烟草，能够以低成本且对环境负荷低的生产工艺生产木脂
素甲基化酶。在其他优选实施方式中，作为本发明的转化体，也可优选使用稻子。若使用转化稻，能够在该稻子内通过低成本且对环境负荷低的生产工艺生产出木脂素甲基化酶。本发明的转化体只要是含有木脂素(特别是thujaplicatin)的生物，无论是何种生物种，均可通过导入上述多核苷酸来生产该甲基化木脂素。若使用导入了包含编码本发明的蛋白质的多核苷酸的重组表达载体的转化体，SP可催化在植物等的生物内存在的木脂素进行甲基化的反应，所以，能够以低成本且对环境负荷低的生产工艺大量制备甲基化木脂素。进而，本发明还可通过大量制备甲基化木脂素，提供廉价的食品或工业产品。只要使用本发明的转化体，即可在低成本且对环境负荷低的条件下提供催化木脂素甲基化反应的蛋白质。在一实施方式中，本发明的细胞可以是各种细菌宿主。本实施方式的细胞可通过将包含本发明的多核苷酸的重组载体，以使由该多核苷酸编码的蛋白质能够表达的方式，导入细胞中而获得。根据本说明书中的记载，本领域技术人员应容易地理解只要导入包含编码具有木脂素甲基化活性的蛋白质的多核苷酸的重组表达载体，即可对从细菌到高等植物的大范围的生物，赋予木脂素甲基化能力。对本发明的细胞而言，只要是包含木脂素(特别是thujaplicatin)的生物，无论是何种生物种，均可通过导入上述多核苷酸来生产该甲基化木脂素。若使用导入了包含编码本发明的蛋白质的多核苷酸的重组表达载体的细胞，能够在该细胞内催化木脂素甲基化反应，所以，可通过低成本且对环境负荷低的生产工艺大量制备甲基化木脂素。进而，本发明还可通过大量制备甲基化木脂素，提供廉价的食品或工业
女口
广叩ο若使用本发明的细胞，能够在低成本且对环境负荷低的条件下提供催化木脂素甲基化反应的蛋白质。4.本发明的蛋白质的制造方法本发明在其他实施方式中，提供使用上述转化体的本发明的蛋白质的制造方法。具体地说，通过从上述转化体的培养物中分离、纯化本发明的蛋白质，可得到本发明的蛋白质。在此，培养物指培养液、培养菌体或培养细胞、培养菌体或培养细胞的破碎物中的任一种。本发明的蛋白质的分离、纯化可根据通常的方法进行。例如，当本发明的蛋白质在培养菌体内或培养细胞内积累时，培养后，可用通常的方法(例如，超声波、溶菌酶、冻融等)破碎菌体或细胞，然后，通过通常的方法(例如，离心分离、过滤等)得到本发明的蛋白质的粗提取液。当本发明的蛋白质在培养液中积累时，可在培养结束后，通过用通常的方法(例如，离心分离、过滤等)将菌体或细胞与培养上清分离，从而得到包含本发明的蛋白质的培养上清。如此得到的提取液或培养上清中所含有的本发明的蛋白质的纯化，可根据通常的分离、纯化方法进行。作为分离、纯化方法，例如，可单独或适当组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法、超滤法等。5.甲基化木脂素的制造方法
法。上述生物体可为天然的未改造生物体，也可以是使用了重组表达系统的转化体。本发明的甲基化木脂素的制造方法可高效制造木脂素(特别是thujaplicatin)。在一实施方式中，本发明的甲基化木脂素的制造方法为使用由编码本发明的蛋白质的多核苷酸转化的生物体或其组织来制造甲基化木脂素。上述生物体优选为上述转化体植物或细菌，特别优选为大肠杆菌、芝麻、连翘或亚麻。本发明的甲基化木脂素的制造方法包含将编码本发明的蛋白质的多核苷酸导入上述生物体的工序。作为将多核苷酸导入上述生物体的工序，可使用上述的各种基因导入方法。在本实施方式中，对上述生物体而言，在转化前产生的甲基化木脂素与转化后产生的甲基化木脂素的组成不同。具体地说，从上述生物体中得到的木脂素及甲基化木脂素的含有率增加了。本实施方式的甲基化木脂素的制造方法还包含从上述生物体中提取甲基化木脂素的工序。6.食品和工业产品本发明提供使用通过上述甲基化木脂素的制造方法制得的甲基化木脂素而制造的食品和工业产品。本项中所述的食品可以是上述转化植物体的种子、果实、切穂、块茎和/或块根，也可以是使用从上述转化植物体中提取的甲基化木脂素而制造的食品(例如，芝麻、连翘或亚麻、或这些的加工食品)。本发明的食品或工业产品可含有所需量的木脂素(特别是 thujaplicatin)。例如，如上所述，从甲基化木脂素含量增加了的本发明的转化植物中提取的甲基化木脂素提取液，作为甲基化木脂素含量高的食品而被提供。而且，不限于所提取的甲基化木脂素，上述转化植物体的种子、果实、切穂、块茎和/或块根等也可作为大量含有甲基化木脂素的食品而被提供。对改变甲基化木脂素组成的对象无特别限定，除植物以外，还可将动物、细菌或酵母等所有的生物作为对象。此外，基于木脂素及甲基化木脂素的独特物性，本发明的蛋白质或多核苷酸可应用于工业产品(例如，薄膜、生物分解性塑料、功能性纤维、润滑油或洗涤剂等的工业产品)的原料中。通过以下的实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例[实施例I]:基因克隆本实施例中使用的分子生物学的方法，只要无其他详细说明，均按照MolecularCloning(Sambrook 等、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)中记载的方法进行。使用RNeasy Plant Mini 试剂盒(QIAGEN),从伞形科蛾参(Anthrissussylvestris)的嫩叶和根中提取总RNA,接着,使用Oligotex dT mRNA纯化试剂盒(TaKaRaBio),得到 PolyA (+) RNA。使用 4 μ g 该 polyA (+) RNA,并使用 Lambda ZAPII 定向 cDNA 文库合成试剂盒(Stratagen公司),根据该公司推荐的方法构建cDNA文库。
使用包含上述cDNA文库的噬菌体约30万pfu，将表I中所述的4种由OMT基因特异性引物对扩增的片段混合后作为筛选探针，通过噬菌斑杂交法进行筛选。探针使用非放射性DIG-核酸检测系统(Roche Diagnostics公司),根据制造商推荐的条件通过PCR来标记。此时，有关OMT引物对I及2，将菊科红花的cDNA作为模板来使用(Set I正向(Forward):序列号3 ；Set I 反向(Reverse):序列号-A ；Set 2 正向(Forward):序列号5 ；Set 2反向(Reverse):序列号6)。此外，有关OMT弓丨物对3及4，将杨柳科杨树的cDNA作为模板来使用(Set 3正向(Forward):序列号7 ；Set 3反向(Reverse):序列号8 ；Set4正向(Forward):序列号9 ；Set 4反向(Reverse):序列号:10)。使用含有模板cDNAl μ I、IXTaq buffer (TakaRa Bio)、0. 2mMdNTPs、表 I 所示的基因特异性引物各 0. 2pmol/μ I、rTaq polymerase I. 25U的PCR反应液。使该PCR反应液在94°C反应5分钟后，进行94°C I分钟、52°C I分钟、72°C 2分钟的反应30个循环，最后在72°C处理5分钟。使用Mini QuickSpin column (Roche)从该PCR产物中去除引物及未反应的dNTP，将此物质作为探针使用。表I
OMT引物正向反向
Setl51 -ggaactctggttgatgttggtg-31 5' -cgatgatggattcaattgcagga-31
Set251 -tgaagaccttggtggatgttgg-31 5' -tatgaaatcctttgaagccggcag-31
Set351 -tgaaggcctcacgtccttggt-315' -tggaagccagctcccttagct-31
Set451 -cgccagaattgtgatgaaggct-31 5' -gtaacgactaaacccgccttcca-3'文库的筛选以及阳性克隆的检测，是使用非放射性DIG-核酸检测系统(RocheDiagnostics),并根据制造商推荐的方法进行。杂交反应是在含有30%甲酰胺的5xSSC中，37°C下进行一夜，膜的洗涤是使用4xSSC、l%SDS在55°C下进行20分钟。从筛选约40万噬菌斑后得到的阳性克隆中，使用DNASequencer model 3100 (Applied Biosystems),通过使用合成寡核苷酸引物的引物步移法得到cDNA序列。通过将所得到的cDNA序列根据Blastx程序(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行同源性分析，而得到蛾参甲基化酶样基因(AsOMT)。序列号I及2所示的AsOMT克隆116 (以下As0MT116)通过Blastx分析显示出与Rosa chinensis 的 phloroglucinol O-methyltransferase (注册号 BAD18975)低的同源性(约51%)，但因无法推测明确的功能，所以，使其在大肠杆菌中表达来进行功能分析。As0MT116cDNA 序列(序列号1)ATGTCTAAACAAGATCAAGATGCCACTGAATTCACAAGGGTGCTGCAGGTAAGTGGTGGCATAATTCTTGGAATGGTATTGAAAGCTGCTGTTGAGTTTAATCTTTTCGAGATCATGGCCAATGCTGCTGCTGTTGATGGAGCTTCTCCTTTCGGAGATGATGCTAGAAGTTGTCTAGTGATGATATTGTAGCTCATCTTCCCACACAAAATCCTGCAGCTACTGCAATGCTGGAGCGAATTCTTCGGTTTCTGTCTGCTCATTCCTTTCTTACCAGGACCGTAGTAGCTGGAGAAG·GTGGCCAGGAACAGAGTTTGTATGGTCTAGAAAGTATTTGCAAGAATTACATTCCTGATCAAGATGGTGTTTCATTTGCTCCTTTATTGGTTATGCTTCATGACAAAGTTATCATCGATTCTTTGTTGTGCTTGAAAGATGCACTTCTTGAGGGAGGTATTCCGTTTAACAAGGCTCATGATGGCATGGATGCATTTGAATACCCTGCAATAGACAGCAGATTCAATGACGTTTTCAATCAAGCAATGTACAACCACACCACTTTAATCATGAAGAAGATTCTAGAAGTTTACGCTGGATTCGAAGAACTCACAGAGATTGTAGATGTTGGTGGTGGAACCGGGGCAACACTAGCCAAAATCATGTCCAAATATCCTCATATCAGGGGAATCAACTTCGATTTGCCTCATGTCATCAAGAACGCCCCTCCTTTAGCTGGTGTGGAGCATGTGGGAGGAGATATGTTTGAAAGTGTCCCGAAAGGAGAGGTCATCTTCATGAAGTGGATACTTCATGATTGGAGCGATGGACACTGCTTAAAGCTTTTGCAGAATTGCTGCAACTCCCTTCCAGAATCTGGCAAGGTGATAATTGTAGAATCAATAGTGCCAGAGAATACGAACACAGGTTCTTCATCGGAATTAAGCAATGTCATGAGCAATGATATGGTAATGCTGGCAGTAAATCCGGGAGGAAAGGAGAGGAGTATCAAAGAATTTGAGGCATTGGCAAAAGAATCTGGATTCGCCACCGTAGAACTCATATGCAGCGTCGCTATATATAGTGTTCTAGAATTTCATAAGAAAGTGAsOMTl 16氨基酸序列(序列号2)的一文字表示MSKQDQDATEFTRVLQVSGGIILGMVLKAAVEFNLFEIMANAAAVDGASPFGDDAKKLSSDDIVAHLPTQNPAATAMLERILRFLSAHSFLTRTVVAGEGGQEQSLYGLESICKNYIPDQDGVSFAPLLVMLHDKVIIDSLLCLKDALLEGGIPFNKAHDGMDAFEYPAID SRFNDVFNQAMYNHTTLIMKKILEVYAGFEELTEIVDVGGGTGATLAKIMSKYPHIRGINFDLPHVIKNAPPLAGVEHVGGDMFESVPKGEVIFMKWILHDWSDGHCLKLLQNCCNSLPESGKVIIVESIVPENTNTGSSSELSNVMSNDMVMLAVNPGGKERSIKEFEALAKESGFATVELICSVAIYSVLEFHKKV[实施例2]:表达载体构建将AS0MT116的全长0RF，使用附加了下述限制酶位点的引物(表2中上段为序列号11;下段为序列号12)，并通过RT-PCR法进行扩增。表2:亚克隆用引物
权利要求
1.一种多核苷酸，其是由以下(a) (d)组成的组中选出的多核苷酸， (a)多核苷酸，其含有序列号1的碱基序列； (b)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中I 50个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质 '及 (d)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的多核苷酸，其是由以下(g) (h)组成的组中选出的多核苷酸， (g)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中I 15个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质；及 (h)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列，且具有木脂素甲基化活性的蛋白质。
3.根据权利要求I所述的多核苷酸，其中，含有序列号1的碱基序列。
4.根据权利要求I所述的多核苷酸，其中，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的多核苷酸,其为DNA。
6.—种蛋白质，其由权利要求I 5中任一项所述的多核苷酸编码。
7.—种载体，其含有权利要求I 5中任一项所述的多核苷酸。
8.一种非人转化体，其导入了权利要求I 5中任一项所述的多核苷酸。
9.一种非人转化体，其导入了权利要求7所述的载体。
10.一种蛋白质的制造方法，其中，培养权利要求8或9所述的转化体或使其生长发育，并由该转化体提取具有木脂素甲基化活性的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，上述转化体为用权利要求I 5中任一项所述的多核苷酸转化的芝麻、连翘或亚麻。
12.—种甲基化木脂素的制造方法，其中，培养权利要求8或9所述的转化体或使其生长发育，并由该转化体提取甲基化木脂素。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，上述转化体为用权利要求I 5中任一项所述的多核苷酸转化的芝麻、连翘或亚麻。
全文摘要
本发明提供具有将甲基转移给木脂素的活性(木脂素甲基化活性)的酶(例如含有序列号2的氨基酸序列的蛋白质或其突变体)、编码该酶的基因(例如，含有序列号1的碱基序列的多核苷酸或其突变体)、使用该基因制造甲基化木脂素的方法等。
文档编号C12N1/19GK102892883SQ20108006673
公开日2013年1月23日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者小野荣一郎, 梅泽俊明, 服部武文, 铃木史朗 申请人:三得利控股株式会社