城市垃圾堆肥微生物组分的提取方法

文档序号:394142阅读:930来源:国知局
专利名称:城市垃圾堆肥微生物组分的提取方法
技术领域
本发明属于环境保护技术领域,涉及城市垃圾堆肥微生物组分的提取方法。本发明为今后将采用生活垃圾堆肥分离培养的这些菌种应用于草坪植物建植体系中提供了有力的技术支持。
背景技术
堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等) 或商业菌株,有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance,HS) 转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分,它参与地球表面的物质和能量循环。在人为控制条件下,通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost),这种有机肥料作为堆肥化的最终产物,不仅性能稳定,并且对环境的危害甚小。因此,堆肥化是固体废物,尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今,已经历了漫长的历史,对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析,可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。陈世和等(1989)采用垃圾培养基,在城市生活垃圾堆肥处理过程中,温度达 45°C和55°C时,对堆肥菌株进行分离,发现在45°C时曲霉菌[Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳杆菌属[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的优势菌群。而到55°C时则有所不同,除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属Pseudomonas]仍然为优势菌群外,乳酸杆菌属[LactcAacilIus]、链球菌属 [Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群,替代了其它种微生物,表明在堆肥化过程中,微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物,经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属,乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌;曲霉属,毛霉属、红曲霉属,青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌;链霉菌属1属放线菌;酵母菌属,裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现,分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化,使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少,而产芽孢的杆菌大量存在,在堆肥过程中,高温阶段初期和中期阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌,嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。从城市生活垃圾中有机物的组成来看,而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的,不同温度下(中温、高温)堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。近期的相关文献及实际生产表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量,一直是相关科研人员所重点关注的研究内容;在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂,已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟,提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中,合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果,于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂,从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多,但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株,有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程,是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。研究表明,单一的细菌、真菌、放线菌群体,无论其活性多高,在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响,有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究,Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析,以期深入认识堆肥过程的本质,为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。鉴于此,从生活垃圾堆肥中分离微生物,在用于农业生产将无疑具有重要重要作用,而这方面尚无细致和系统的开展工作。本技术就是为生活垃圾堆肥中微生物的应用开辟前景。但在复合微生物菌剂研究过程中,有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类,堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性,以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面,相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类,堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性,以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂,并应用于草坪建植体系,以改善草坪植物生长、 生理特性方面的作用还未见报道。

发明内容
本发明的目的就是公开了一种从堆肥原液中取出菌液,在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养分离,分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养,从而鉴定堆肥有效微生物的组成,而应用于草坪建植中。为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容
一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法,它是将城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基的固体培养基中分别培养分离,分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养,从而鉴定堆肥中有效微生物的组成,其特征在于按如下的步骤进行
(1)配制固体培养基烧杯中加一定量的蒸馏水、去离子水或自来水,按配方称取营养成分,加入浓度为0. lg/L EDTA ;待全部营养成分配齐后,用质量浓度为100g/L的NaOH或质量浓度为100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2,然后加入缓冲剂,分装,置高压蒸汽灭菌锅内灭菌,冷却备用;
(2)菌种分离培养
1)到平板每种培养基倒入3个皿中;
2)制备堆肥稀释液称取新鲜堆肥10克,放入盛90ml无菌水,振摇约20min,制成ΙΟ—1- 10_6稀释度的堆肥溶液;
3)涂布将上述每种培养基的平板底部或培养基周边用记号笔分别写上10_4,10_5, 和10_6 3种稀释度字样,每种培养基每稀释度标记3皿,然后用灭过菌的量程为2(T200ul 的移液枪分别由10_4,10_5和10_6 3管堆肥稀释液中吸取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿放入0. ani,用无菌玻璃涂棒,在培养基表面皿轻轻地涂布均勻,室温下静置 5 IOmin ;
4)培养将含高氏Gause—号培养基的平板倒置于温室下培养5 7天,马铃薯葡萄糖培养基的平板倒置于温室下培养3飞天,牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C温室中培养广2天;
(3)配制液体培养基
1)牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 灭菌 20min ;
2)马铃薯葡萄糖培养基马铃薯40g,葡萄糖4g,水200mL,自然pH,0.IMPa灭菌20分
钟;
3)高氏合成一号培养基可溶性淀粉4g;硝酸钾0.28;氯化钠0.^;三水合磷酸氢二钾0. Ig ;七水合硫酸镁0. Ig ;七水合硫酸亚铁0. 002g ;琼脂4g加入5%的酚溶液2滴,蒸溜水 200ml ;pH7. 2 7. 4,0. IMPa 灭菌 20 分钟;
(4)接种纯菌种用灼烧过的接种环取菌种,先将接种环接触一下没长菌的培养基部分,使其冷却以免烫死菌种,然后用接种环轻轻取菌少许,将取有菌种的接种环送入液体培养基中,并使接种环在液体与瓶壁接触的部位轻轻摩擦,使菌体分散于液体中,接种后塞上棉塞,使液体培养基轻轻摇动,使菌体均勻分布于培养基中,以利生长;
(5)菌种的增值培养将液体培养基放入旋转式摇床进行微生物振荡培养,固定在摇床上的锥形瓶随摇床以200-250r/min的速度运动,由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动,摇床恒温30°C,培养Μ、》ι后,各培养基变混浊,表明各菌种已在培养基中生长,置于冰箱中保存,得出堆肥微生物的组成菌种。本发明所述提取微生物组分的方法,其中的固体培养基为
(1)牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5. Og ;蛋白胨IOg ;NaCL 5g ;琼脂20g ;水IOOOml ;PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 灭菌 20min ;
(2)马铃薯葡萄糖(PDA)培养基马铃薯200g;葡萄糖(蔗糖)20g ;琼脂15_20g ;水 IOOOml ;PH 自然,0. IMPa 灭菌 20min ;
(3)高氏合成一号培养基可溶性淀粉20g;硝酸钾18;氯化钠0.58;三水合磷酸氢二钾0. 5g ;七水合硫酸镁0. 5g ;七水合硫酸亚铁0. Olg ;琼脂20g,蒸馏水IOOOml ; ρΗ7· 2-7. 4,0. IMPa 灭菌 20min。本发明所述提取微生物组分的方法,其中所述的缓冲剂为=K2HPO4 , KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。本发明所述提取微生物组分的方法,其中所述的KT1- 10_6稀释度的堆肥溶液在测定
A.细菌数量时,采用10-4,10_5,10-6稀释度;
B.放线菌数量时,采用10-3,10_4,10-5稀释度;C.真菌数量时,采用10-2,10_3,10-4稀释度。


图1为牛肉膏蛋白胨培养基上的细菌生长情况; 图2为高氏一号培养基上的放线菌生长情况; 图3为土豆培养基上的酵母菌生长情况; 图4为土豆培养基上的霉菌生长情况; 图5,图6为枯草芽孢杆菌划线分离和纯化培养的生长情况; 图7,图8为放线菌划线分离和纯化培养的生长情况; 图9,图10为酵母菌划线分离和纯化培养的生长情况。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施,提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。实施例1
1研制材料与方法 1. 1试验材料
菌种来源天津六里台实验基地垃圾堆肥原料。采土方式在选好适当地点后,先由人工捡去垃圾堆肥中的各类木头、塑料、玻璃、 金属等杂物。用小萨子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。采好的样应及时处理,暂不能处理的也应贮存于4°C冰箱中,但贮存时间不宜过长,取天津市西青区天津师范大学的土壤基质为对照。1. 2微生物的营养和生长
微生物的营养要素
微生物的营养物质应满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构(参与细胞组成),提供能量(机体进行各种生理活动所需要的能量)和调节作用(构成酶的活性成分和物质运输系统)。微生物细胞的化学组成从一个侧面反映了微生物生长繁殖的物质需要。虽然,随微生物种类、生理状态及环境的不同,其组成也有变化,但通过对细胞元素组成的分析可大体看出微生物所需的营养物质。表1显示细菌、酵母菌和霉菌的主要元素组成。这些元素主要以水、有机物和盐的形式存在与细胞中;有机物主要是以蛋白质、糖、核酸、维生素以及激素等形式存在。表1细菌、酵母菌和霉菌的元素组成(干重%)
权利要求
1.一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法,它是将城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基的固体培养基中分别培养分离,分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养,从而鉴定堆肥中有效微生物的组成,其特征在于按如下的步骤进行(1)配制固体培养基烧杯中加一定量的蒸馏水、去离子水或自来水,按配方称取营养成分,加入浓度为0. lg/L EDTA ;待全部营养成分配齐后,用质量浓度为100g/L的NaOH或质量浓度为100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2,然后加入缓冲剂,分装,置高压蒸汽灭菌锅内灭菌,冷却备用;(2)菌种分离培养1)到平板每种培养基倒入3个皿中;2)制备堆肥稀释液称取新鲜堆肥10克,放入盛90ml无菌水,振摇约20min,制成 ΙΟ—1- 10_6稀释度的堆肥溶液;3)涂布将上述每种培养基的平板底部或培养基周边用记号笔分别写上10_4,10_5,和 10_6 3种稀释度字样,每种培养基每稀释度标记3皿,然后用灭过菌的量程为2(T200ul的移液枪分别由10_4,10_5和10_6 3管堆肥稀释液中吸取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿放入0. anl,用无菌玻璃涂棒,在培养基表面皿轻轻地涂布均勻,室温下静置 5 IOmin ;4)培养将含高氏Gause —号培养基的平板倒置于温室下培养5 7天,马铃薯葡萄糖培养基的平板倒置于温室下培养3飞天,牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C温室中培养广2天;(3)配制液体培养基1)牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 灭菌 20min ;2)马铃薯葡萄糖培养基马铃薯40g,葡萄糖4g,水200mL,自然pH,0.IMPa灭菌20分钟;3)高氏合成一号培养基可溶性淀粉4g;硝酸钾0.28;氯化钠0.^;三水合磷酸氢二钾0. Ig ;七水合硫酸镁0. Ig ;七水合硫酸亚铁0. 002g ;琼脂4g加入5%的酚溶液2滴,蒸溜水 200ml ;pH7. 2 7. 4,0. IMPa 灭菌 20 分钟;(4)接种纯菌种用灼烧过的接种环取菌种,先将接种环接触一下没长菌的培养基部分,使其冷却以免烫死菌种,然后用接种环轻轻取菌少许,将取有菌种的接种环送入液体培养基中,并使接种环在液体与瓶壁接触的部位轻轻摩擦,使菌体分散于液体中,接种后塞上棉塞,使液体培养基轻轻摇动,使菌体均勻分布于培养基中,以利生长;(5)菌种的增值培养将液体培养基放入旋转式摇床进行微生物振荡培养,固定在摇床上的锥形瓶随摇床以200-250r/min的速度运动,由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动,摇床恒温30°C,培养Μ、》ι后,各培养基变混浊,表明各菌种已在培养基中生长,置于冰箱中保存,得出堆肥微生物的组成菌种。
2.权利要求1所述提取微生物组分的方法,其中的固体培养基为(1)牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5. Og ;蛋白胨IOg ;NaCL 5g ;琼脂20g ;水IOOOml ;PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 灭菌 20min ;(2)马铃薯葡萄糖(PDA)培养基马铃薯200g;葡萄糖(蔗糖)20g ;琼脂15_20g ;水 IOOOml ;PH 自然,0. IMPa 灭菌 20min ;(3)高氏合成一号培养基可溶性淀粉20g;硝酸钾18;氯化钠0.58;三水合磷酸氢二钾0. 5g ;七水合硫酸镁0. 5g ;七水合硫酸亚铁0. Olg ;琼脂20g,蒸馏水IOOOml ; ρΗ7· 2-7. 4,0. IMPa 灭菌 20min。
3.权利要求1所述提取微生物组分的方法,其中所述的缓冲剂为=K2HPO4、KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。
4.权利要求1所述提取微生物组分的方法,其中所述的ΙΟ—1-10_6稀释度的堆肥溶液在测定Α.细菌数量时,采用10-4,10_5,10-6稀释度; B.放线菌数量时,采用10-3,10_4,10-5稀释度;C.真菌数量时,采用10-2,10_3,10-4稀释度。
全文摘要
本发明公开了一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法,它是将城市垃圾堆肥在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养、分离,以及分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养,从而鉴定堆肥中有效微生物的组成。实验结果表明,在城市垃圾堆肥中的优势菌种为枯草芽孢杆菌、放线菌及酵母菌,这些菌种不仅数量多而且有的种类也很多。本发明为今后将采用生活垃圾堆肥分离培养的这些菌种应用于草坪植物建植体系中提供了有力的技术支持。
文档编号C12N1/16GK102174404SQ201110037030
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者多立安, 王晶晶, 赵树兰 申请人:天津师范大学
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