完整叶绿体长时间离体培养方法

文档序号:394158阅读:1923来源:国知局
专利名称:完整叶绿体长时间离体培养方法
完整叶绿体长时间离体培养方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,主要涉及植物完整叶绿体分离与体外培养的技术与实施,包括叶绿体分离与体外培养试剂的配制和所涉及的操作程序。
背景技术
叶绿体是植物将太阳能转化成化学能的重要细胞器,是地球生物维持生存的主要摄取能量的源头,因此,叶绿体的结构、功能、基因组及基因表达调控等都成为生命科学备受关注的问题,其相关的基础理论和应用研究与粮食、能源、环境等人类的生存密切相关。 处于真核生物细胞中的叶绿体虽然拥有独立的基因组和双层生物膜包被,但属于半自主性细胞器,其发生、发育和功能不仅受细胞核基因组的调控,还与其它细胞器相互影响,协同作用。对叶绿体突变和遗传转化后的细胞形态学变化等等的观察,可以为叶绿体基因组及基因表达调控研究提供重要方法。目前,国际上外源基因导入叶绿体的技术仍局限于主要的基因枪方法,叶绿体突变体和转化子筛选依然比较困难,这些成为制约叶绿体转化等相关研究与应用发展进程的关键瓶颈,而叶绿体离体操作是一个重要的突破口,离体叶绿体若能较长时间保持完整,将为叶绿体基因工程操作提供便捷和开辟新途径。

发明内容
本发明的目的是提供完整叶绿体提取与叶绿体体外长时间培养相关试剂及其提取及培养方法。
权利要求
1.一种完整叶绿体提取相关试剂,其特征在于该试剂组成包括
2.一种完整叶绿体离体培养相关试剂,其特征在于该试剂包括下列表明浓度的组成成分 以上试剂溶于无离子水中,调pH至6. 2,高压灭菌后于4°C冰箱保存。
3.一种完整叶绿体长时间离体培养方法,其特征在于该方法的具体步骤包括 第1、称取4°C过夜的新鲜植物子叶8 10g,剪碎,置于冰上预冷的研钵中;第2、将权利要求1所述试剂中的BufferA40ml分两次加入研钵中,并加入Ig石英砂, 研磨后经6层纱布过滤至50ml离心管中;第3、将第2步中的研磨液于4°C 800g离心6min,弃上清;第4、向第3步中加入预冷的权利要求1所述试剂中的BufferB 25ml,然后加入 17. 5ul β -巯基乙醇,悬浮叶绿体;第5、将第4步中的悬浮液于4°C 800g离心8min,弃上清; 第6、向第5步中加入权利要求1所述试剂中的BufferC I^iil,悬浮叶绿体; 第7、将第6步中的悬浮液于4°C IOOOg离心8min,弃上清,获得完整叶绿体; 第8、取IOml权利要求2所述离体培养试剂悬浮第7步获得的完整叶绿体,置于25V 下避光或弱光培养。
全文摘要
完整叶绿体长时间离体培养方法。本发明分别以黄瓜、烟草和菠菜无菌苗子叶为材料,以柠檬酸、NaCl、Tris和EDTA为主要成分的叶绿体提取试剂,通过对植物材料的研磨、纱布过滤、差速离心等操作分离较完整的叶绿体(

图1);以MnCl2、MgSO4、NaCl、山梨醇等为主要成分的培养试剂,对离体叶绿体进行液体培养。在体外培养长达20天左右,叶绿体仍然保持绿色且显微形态正常(图2),膜结构完整(图3)。离体培养两周内叶绿体经历分裂增值达到相对稳定的数量(图4)。对叶绿体离体转化和外源基因检测证明离体长时间培养的叶绿体内DNA没有发生降解(图5)。本发明可为叶绿体功能、遗传转化和细胞工程等基础理论与应用研究提供便捷和新途径。
文档编号C12N5/04GK102174464SQ20111003886
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月16日 优先权日2011年2月16日
发明者乔明强, 张文娟, 张秀明, 徐海津, 王丹, 王勇, 白艳玲 申请人:南开大学
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