专利名称：一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种α -半乳糖苷酶及其编码基因和应用。
背景技术：
α -半乳糖苷酶(alpha-galactosidase, EC 3. 2. 1. 22)，也叫蜜二糖酶，是一种夕卜切糖苷酶，它可作用于α-半乳糖苷键，催化α-半乳糖苷类的寡糖以及含α-半乳糖苷键的多聚糖。α-半乳糖苷广泛分布于植物、动物和微生物体内。α -半乳糖苷酶作为一种新型的酶制剂，在饲料工业，食品工业，制糖工业，造纸工业以及医学界都发挥着重要的作用。不同的领域PH作用环境不同，对α-半乳糖苷酶的特点要求也就不同。例如，酸性α-半乳糖苷酶目前不适于应用于豆奶加工中，因为豆奶的PH 约为6. 2-6. 4，而酸性α -半乳糖苷酶的ρΗ在4. 0-4. 5，易造成豆奶中蛋白沉降，奶制品口感偏酸；甜菜糖生产中甜菜糖蜜的PH需用硫磺酸调至5. 2，才能使酸性α -半乳糖苷酶发挥作用；在医学研究中，由B型血到0型血的血液转换，需在中性及碱性条件下作用，酸性条件下会使血细胞不稳定，这是因为血液的PH值在7. 3，中性偏碱性的环境下，碱性的α -半乳糖苷酶会发挥明显的优势。目前酶制剂工业中主要采用微生物作为主要酶源。微生物特别是丝状真菌，因其产生的α-半乳糖苷酶产量相对较高，可胞外分泌、酶学性质优良等特点而受到研究者的青睐。目前，α-半乳糖苷酶主要是利用原菌株的发酵生产，产量较低，成本较高。α-半乳糖苷酶的基因工程菌株目前报道也较少，主要还是在实验室研究阶段。因此，不断提高菌种产酶水平，研究α-半乳糖苷酶合成的调控机制、酶基因的克隆和异源高效表达，进行产业化推广应用是今后发展的主要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来自菌株WD(Alternaria sp. )No. 4529，命名为LGAL蛋白， 是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的LGAL蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA 分子1)序列表中序列2自5’端第58至2217位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有α_半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有α_半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在原核表达载体pET-30a(+)的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒。
6.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，或权利要求4或5所述重组表达载体，或权利要求4所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在降解对硝基酚-α -D-吡喃半乳糖中的应用。
7.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，或权利要求4或5所述重组表达载体，或权利要求4所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在生产对硝基酚中的应用。
8.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，或权利要求4或5所述重组表达载体，或权利要求4所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在以对硝基酚-α -D-吡喃半乳糖为底物生产对硝基酚中的应用。
9.链格孢霉菌(Alternariasp.)菌株WD，其保藏编号为CGMCC No. 4529。
10.链格孢霉菌(Alternariasp.)菌株WD CGMCC No. 45 在制备权利要求1所述蛋白和/或权利要求2或3所述基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。本发明提供的α-半乳糖苷酶是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明为今后的高效表达生物反应器的建立提供技术参数，使其应用于不同的工业生产领域，本发明丰富了蛋白来源，该蛋白与已报道的蛋白氨基酸序列一致性低，为α-半乳糖苷酶的分类学提供了新的素材。
文档编号C12R1/645GK102181413SQ20111004991
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者李卓夫, 杨禄良, 段文娟, 王海燕, 谢宁 申请人:北京挑战农业科技有限公司