甘蔗白叶病病原巢式pcr检测方法

文档序号:504810来源:国知局
专利名称:甘蔗白叶病病原巢式pcr检测方法
技术领域
本发明涉及植物保护领域,尤其是一种快速、简便、高效的甘蔗白叶病病原的检测方法。
背景技术
甘蔗白叶病由类菌原体侵染所引致,属全株性病害,也是一种重要的检疫性病害。 主要分布在中国台湾,泰国、澳大利亚和新西兰。症状主要表现为在叶片上有单条或数条白色或乳黄色或浅绿色条纹,严重时整个全叶丧失叶绿素变成白色,呈漂白状,植株矮化, 节间短缩,分蘖增多。类菌原体可通过带病种苗进行传播,在田间叶蝉(Matsumuratetlix hiroglyhious)等昆虫介体可通过取食病株韧皮部进行反复侵染传播。该病害是甘蔗产业毁灭性病害之一,可导致甘蔗的巨大减产,给甘蔗和制糖产业带来巨大损失。近年来,与大湄公河次区域(GMS)国家合作的逐渐增强,并且与这些国家开展甘蔗品种/材料交换日益频繁。由于甘蔗白叶病在GMS国家普遍发生,为了有效防控该病害随引进的甘蔗品种/材料侵入境内,对国际合作中进出口的甘蔗品种/材料进行病害检疫检测非常必要,因此建立一种快速有效的检测甘蔗白叶病的方法迫在眉睫。

发明内容
本发明提出一种甘蔗白叶病病原巢式PCR检测方法,能够快速、简便、高效地检测甘蔗白叶病病原。本发明按下列步骤进行取甘蔗病叶组织,通过CTAB法提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA,应用巢式PCR技术对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增,用1. 0%的琼脂糖凝胶对巢式PCR扩增产物进行电泳检测,第一轮PCR扩增产物的 DNA目标片段大小约为700bp,第二轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为210bp。所述的甘蔗病叶组织经液氮研磨成粉末,转入离心管,采用CTAB抽提缓冲液提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA。所说巢式PCR技术的两次扩增,第一轮PCR扩增采用的引物为ML0X/ML0Y,第二轮 PCR扩增采用的引物为P1/P2。本发明通过应用巢氏PCR方法对样本进行检测,通过反复试验,建立了快速准确的检测方法,从而为严格防控该病害传入境内提供有力的技术保障。本方法具有快速、简便、高效等特点。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明的具体实施方式
进行详细说明实施例步骤如下A、蔗叶总DNA的提取。1、取新鲜叶片剪细,加入液氮研磨成粉末,转入2. OmL离心管;2、加IOOOyL CTAB抽提缓冲液,于65°C水浴温育30min,每IOmin混勻一次,12000rmp 离心 IOmin ;3、取上清液SOOyL于2. OmL离心管,加等体积氯仿/异戊醇04 1),混勻, 12000rmp 离心 IOmin ;4、取上清液750 μ L于2. OmL离心管,加入2/3体积异丙醇,加入200 μ L 5MNaCl 溶液,混勻,于_20°C放置4小时,12000rmp离心5min ;5、弃上清液,于沉淀加入500 μ L 70%乙醇,12000rmp离心^iiin ;6、弃上清液,于沉淀加入500 μ L无水乙醇,12000rmp离心^iiin ;7、弃上清液,室温干燥DNA,力Π 40 μ L灭菌超纯水或TE缓冲液,于_20°C保存备用。B、引物设计。应用两对引物对DNA模板进行巢式PCR扩增。第一轮PCR扩增引物序列为上游引物 MLOX 5' -GTT AGG TTA AGT CCT AAA ACG AGC-3‘,下游引物 MLOY 5' -GTG CCA AGG CAT CCA CTG TAT GCC-3',目标片段约为700bp ;第二轮PCR扩增引物序列为上游引物 Pl 5' -GTC GTA ACAAGG TAT CCC TAC CGG-3‘,下游引物P2 5' -GGT GGG CCT AAA TGG ACTTGA ACC-3 ‘,目标片段约为 210bp。C、巢式PCR扩增反应。1、巢式PCR反应体系为第一轮PCR反应体系循环参数1. 5 μ LlOXbuffer, 0· 9 μ L MgCL2 (25mmol/L),0· 3 μ L dNTPs(10mmol/L),0. 375 μ LMLOX(20 μ mol/L),0. 375 μ L MLOY (20 μ mol/L),0· 3 μ L Taq 聚合酶(5. OU/ μ L),3· 0 μ L DNA 模板(DNA 模板为提取的叶组织总基因组DNA,50 IOOng) ,8. 25 μ L灭菌水,总体积为15 μ L ;PCR反应运行以下程序 940C 5min ;94°C lmin,55°C 30sec,72°C lmin,24 个循环;72°C 7min。2、第二轮 PCR 反应体系循环参数1. 5μ L 10 X buffer, 0. 6 μ L MgCL2 (25mmol/L), 0. 3μ L dNTPs(10mmol/L) ,0. 375 μ L Pl (20 μ mol/L),0. 375 μ L Ρ2 (20 μ mol/L),0· 3 μ L Taq聚合酶(5. OU/ μ L), 3. 0 μ LDNA模板(DNA模板为第一轮PCR扩增产物稀释100倍), 8. 55μ L灭菌水,总体积为15μ L ;PCR反应运行以下程序94°C 5min ;94°C lmin,62°C 30sec,72°C lmin,30 个循环;72°C 7min。D、扩增产物检测巢式PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳分析,第一轮PCR扩增到大约700bp条带的为阳性,未扩出700bp条带的为阴性;第二轮PCR扩增到大约210bp 条带的为阳性,未扩出210bp条带的为阴性。引物序列表
MLOX5'-GTTAGGTTAAGTCCTAMACGAGC--3'MLOY5'-GTGCCAAGGCATCCACTGTATGCC--3'Pl5'-GTCGTAACAAGGTATCCCTACCGG--3'P25'-GGTGGGCCTMATGGACTTGAACC--3'
权利要求
1.一种甘蔗白叶病病原巢式PCR检测方法,其特征是按下列步骤进行取甘蔗病叶组织,通过CTAB法提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA,应用巢式PCR技术对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增,用1. 0%的琼脂糖凝胶对巢式PCR扩增产物进行电泳检测,第一轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为700bp,第二轮PCR扩增产物的DNA 目标片段大小约为210bp。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征是所说的甘蔗病叶组织经液氮研磨成粉末,转入离心管,采用CTAB抽提缓冲液提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征是所说巢式PCR技术的两次扩增,第一轮 PCR扩增采用的引物为ML0X/ML0Y,第二轮PCR扩增采用的引物为P1/P2。
全文摘要
一种甘蔗白叶病病原巢式PCR检测方法,取甘蔗病叶组织,通过CTAB法提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA,应用巢式PCR技术对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增,用1.0%的琼脂糖凝胶对巢式PCR扩增产物进行电泳检测,第一轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为700bp,第二轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为210bp;所说的两次扩增,第一轮PCR扩增采用的引物为MLOX/MLOY,第二轮PCR扩增采用的引物为P1/P2;本方法具有操作快速、简便、高效等特点。
文档编号C12Q1/04GK102154490SQ20111005005
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者卢文洁, 李文凤, 王晓燕, 赵培方, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1