专利名称：猪气管上皮细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明涉及生物动物细胞系领域，具体涉及猪气管上皮细胞系及其建立方法。
背景技术：
气管上皮位于气管管腔内表面，属假复层纤毛柱状上皮，是机体对外防御有害物质侵扰的第一道屏障。其组成细胞——气管上皮细胞除具有机械防御作用之外，还可以合成和分泌多种粘液成分和细胞因子，用于调节气道上皮细胞生长、维持气管上皮完整性、湿润和净化呼吸道、抵抗多种病原菌对气管上皮的侵害，另外，气管上皮细胞还具有参与气道黏膜免疫反应、帮助消除气管炎症等重要作用。目前，尚无有关猪气管上皮细胞细胞系建立方法的研究出现，且以现有细胞系建立方法获取的永生化的猪血管内皮细胞，由于在筛选过程中获得单克隆阳性细胞较少，细胞生长的量也很少，且增殖缓慢，营养条件要求较高，生产成本高，不利于推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种易于培养，生长速度较快，操作方法简便的猪气管上皮细胞系及其建立方法。本发明采用如下技术方案一种猪气管上皮细胞系的建立方法，包括以下步骤(1)原代培养无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12 培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养；(2)转染和筛选提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。所述的方法，所述步骤( 将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的猪气管上皮细胞，其具体步骤如下(1)转染前Mh，将STECs用蔗糖EDTA和0.25%胰酶分步消化成单个细胞，以 IXio5个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80% 90%的融合；(2)转染前4h更换无血清的DMEM/F12 ；(3)用无血清的DMEM/F12稀释5 μ LpCI-neo-hTERT质粒至体积为50 μ L，轻轻混勻，质粒浓度达到300ng/ μ L 400ng/ μ L室温作用5min ；(4)用无血清的 DMEM/F12 分别稀释 Lipofectamine 20006 μ L、9 μ L、12 μ L 到 50 μ L，轻轻混勻，室温作用5min ；(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100 μ L。轻轻混勻，室温作用20min ；
(6)将12孔板中的旧培养液吸出，用D-Hank’ s清洗，加入900 μ L无血清的DMEM/ F12 ；(7)逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混勻；同时设立2孔未转染作为空白对照；(8)在37°C、体积分数比为5% CO2饱和湿度培养箱中孵育4 6h，弃去培养液， 加入完全的DMEM/F12培养基；(9)24h 48h观察细胞，并及时换液。所述的方法，所述步骤(3)的具体操作为(1)转染48h后待细胞汇合至80%时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400 μ g/mL ；(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止；(4)将阳性克隆用滤纸片法消化并转移至新12孔板，扩大培养。本发明还提供了按照上述方法建立的猪气管上皮细胞系。本发明采用脂质体转染法将人端粒酶逆转录酶基因转入正常的猪气管上皮细胞， 激活其端粒酶活性，以自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒，获得无限分裂和增殖的能力，建立了猪气管上皮细胞的永生化细胞系。
图1原代培养传至第3代的细胞(X 100)电镜图。图2转染后第50代细胞(X100)电镜图。图3转染后第50代细胞(X 200)电镜图。图4转染前第3代和转染后第15代、35代永生化的STECs hTERTmRNA RT-PCR检测结果图。图5转染后永生化的STECs气管上皮细胞8型角蛋白免疫荧光检测(X400)电镜图。图6原代STECs和永生化的STECs生长曲线比较。图7原代第3代STECs细胞生长周期分布图。图8永生化的STECs第35代细胞生长周期分布图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例11、无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞，形态呈圆球状，多单个存在，显微镜下可见纤毛摆动。2、将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养。6 他，细胞贴壁；24h左右，细胞呈单层贴壁生长；2 4d细胞铺满平皿底部。经 8型角蛋白间接免疫荧光鉴定，细胞核无特异性荧光，细胞膜有荧光，结合细胞形态观察，证实所分离培养的细胞为猪气管上皮细胞。3、提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法， 利用Lipofectamine 2000 Regent转染试剂盒将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒 pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪气管上皮细胞进行转染。4、转染4 后通过G418进行筛选，第2天细胞开始死亡，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，G418浓度降至一半维持筛选，继续筛选一个月左右，待发现抗G418阳性细胞克隆后，于37°C、5%的 CO2培养箱内扩大培养，利用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆纯化，获得单克隆的气管上皮细胞，并将其传代培养。5、RT-PCR技术在转染hTERT的细胞中均检测到hTERT mRNA在转染细胞中表达， 用抗hTERT单克隆抗体进行Western Blot检测，发现有特异性条带产生，而原代培养的细胞没有检测到。表明外源性hTERT基因可以在转染猪气管上皮细胞中表达，并激活猪气管上皮细胞的端粒酶活性。6、将阳性单克隆气管上皮细胞在体外于37°C、5%的(X)2培养箱内连续培养，单层细胞呈铺路石样，细胞间界限分明，存在接触抑制，具有正常细胞的增殖周期，培养超过80 代次，即得永生化的细胞系。本发明所述DMEM/F12培养基购自invitrogen公司，完全培养基是在原培养基中加入10%胎牛血清。本发明所述的无血清DMEM/F12培养液是不加10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。实施例3上述阳性细胞的筛选过程和转染细胞的纯化过程，具体步骤如下1、G418筛选及阳性细胞的获得(1)转染48h后待细胞汇合至80%时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液(完全DF12培养基加G418)。连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400 μ g/mL。(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。(4)将阳性克隆用滤纸片法消化并转移至新12孔板，扩大培养。2、转染细胞的纯化(1)将扩大培养的阳性细胞消化后制成细胞悬液(2)用完全DMEM/F12培养基将细胞稀释成100个/mL、50个/mL、25个/mL、10个 /mL和1个/mL的悬液。(3)将细胞悬液分别种入96孔培养板，每孔0. lmL，细胞含量分别为10个/孔、5 个/孔、2.5个/孔和1个/孔。(4)在37°C、体积分数比为5% CO2饱和湿度培养箱中培养。(5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，做好标记，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。(6)待孔中细胞达到70% 80%的融合时，用蔗糖EDTA和胰酶分步消化法将细胞转移到新的12孔板，进行扩大培养。实施例4细胞鉴定试验过程1、转染细胞形态学观察原代培养的STECs (图1)与永生化的STECs (图2和图3)形态相似，呈典型的上皮样。细胞中央核明显，常有2个以上的核仁，细胞可以铺满单层，单层细胞呈典型的鹅卵石铺路石状排列，细胞间存在接触抑制。2、RT-PCR检测永生化细胞中外源性hTERT的表达(1)细胞总RNA的提取方法如下①待原代第3代、永生化的第15代和35代细胞达到70% 80%时，将细胞消化下来转移到1. 5mL的Eppendorf管内。②离心去掉细胞培养液，计入750 μ LTrizol，振荡混合，室温静置lOmin。③加入200 μ L三氯甲烷，颠倒混勻，室温静置;3min。④4°C条件下，12000r/min 离心 15min。⑤吸取上清液550 μ L，加入等体积的异丙醇，颠倒混勻，室温静置15min。⑥4°C条件下，12000r/min 离心 15min。⑦弃去上清，加入预冷DEPC水处理过的70%乙醇。⑧4°C条件下，12000r/min 离心 15min。⑨弃去上清，瞬时离心，吸弃多余液体，室温干燥lOmin。⑩加入M μ LDEPC水处理，融解lOmin，置_20°C备用。(2)引物设计与合成根据GenBank 中 hTERT 的 mRNA 序列，利用 Primer Premier 5. 0，设计了一对检测外源性人端粒酶逆转录酶基因的引物，最终得到的产物为461bp，引物由南京金斯瑞公司合成。表IPCR引物序列
引物核苷酸序列
Pl5'-GCAAAGCATTGGAATCAG-3'
P25'-GTGTTCTGGGGTTTGATG-3'(3) RT-PCR 扩增①反转录合成cDNA反应体系如下总RNA提取液7 μ LOlig(dt) 152μ LdNTP2 μ LRNase-free Η20 2. 5 μ L70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入如下成分
5XFirst-strand Buffer 4μ L0. IM DTT1 μ LRNasin0. 5 μ LTiANScript-M-MLV1 μ L混勻42°C温浴50min，95°C加热5min后终止反应，加液过程在冰上进行。②PCR扩增反应体系如下
Pl1 μ
Ρ21 μ
灭菌去离子水10 μL
MIX12.5 μ
反转录cDNA液0.5 μLPCR 反应条件为94°C 4min 预变性；94°C 30s，45°C 30s, 72°C 40s，共 30 个循环； 最后72°C延伸6min，4°C保存。③RT-PCR产物凝胶电泳鉴定取上述PCR产物5 μ L于10g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含0. 5μ g/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为1XTAE，120V, 15min电泳完毕后于紫外凝胶成像系统观察、拍照。结果显示，在永生化的STECs两个不同代次的细胞中均能扩增出特异性片段，片段长度与预期一致，约为461bp，而第3代的STECs扩增结果为阴性(见图4)。3、角蛋白8的间接免疫荧光鉴定将永生化的细胞以1 X 105/cm2密度接种于预先放置2张盖玻片的60mm培养皿内 24h后，弃掉培养液，收集2张爬片，PBS冲洗3次，丙酮固定15min，PBS冲洗，取1张爬片滴加一抗(小鼠抗人8型角蛋白单克隆抗体)，另一张做对照滴加PBS，4°C孵育24h，PBS洗涤 3次，再滴加二抗(羊抗小鼠FITC-IgG)，37°C避光作用30min，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察。观察结果显示，角蛋白位于细胞膜上，细胞胞膜着色，显示特异性的绿色荧光，细胞核不着色无荧光显示，对照组无荧光，结果表明永生化的STECs为上皮源性(见图5)。4、MTT法检测细胞活力情况(1)将永生化的细胞按1 X IOVcm2接种于96孔板中，接于8排孔中，每孔再做3个重复，另接原代STECs做对照。(2)待细胞融合成单层，给第一排的3个孔加入20 μ LMTT液，继续培养3 4h。(3)弃去培养基，加入DMSO 150 μ L，均勻混合，转入新的酶标板中。(4)在酶标仪上，490nm波长，测其吸光度。(5)依此方法连续测8天，采集数据，绘制活力曲线图。从图中可以看到，永生化的STECs和STECs的活力曲线均呈倒置的“S”型(见图 6)，两种细胞在接种后的第3 5d为增殖活跃的对数生长期，然后进入平台期。从图中看出，永生化的STECs较STECs增殖活跃。5、流式细胞仪检测细胞周期将培养至35代的永生化的STECs和培养至第3代的原代STECs消化下来，分别收集到1. 5mL的无菌离心管中，至少保证细胞浓度达到1 X IO6个，PBS液清洗，3000r/min离心5min，弃掉PBS液，再加入ImLPBS重悬，加入2mL无水乙醇充分混勻，吹散，使细胞成单个，4°C状态下，送至流式细胞仪进行细胞周期检测，对结果进行分析。从结果发现，永生化的STECs核型正常，依然为2倍体(见图7和图8)。第35代永生化的STECs在Gl期的细胞占53. 66%，少于第3代原代的STECs的75%，在S期细胞占46. 34%，多于第3代原代的STECs的22. 76%，表明永生化的STECs较原代的STECs增殖活力增加。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种猪气管上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(1)原代培养无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养；(2)转染和筛选提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤( 将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的猪气管上皮细胞，其具体步骤如下(1)转染前Mh，将STECs用蔗糖EDTA和0.25 %胰酶分步消化成单个细胞，以1 X IO5 个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80% 90%的融合；(2)转染前4h更换无血清的DMEM/F12；(3)用无血清的DMEM/F12稀释5μ L pCI-neo-hTERT质粒至体积为50 μ L，轻轻混勻， 质粒浓度达到300ng/ μ L 400ng/ μ L室温作用5min ；(4)用无血清的DMEM/F12 分别稀释 Lipofectamine 2000 6 μ L、9 μ L、12 μ L 到 50 μ L, 轻轻混勻，室温作用5min ；(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine2000，此时总体积为100 μ L。轻轻混勻， 室温作用20min ；(6)将12孔板中的旧培养液吸出，用D-Hank’s清洗，加入900 μ L无血清的DMEM/F12 ；(7)逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混勻； 同时设立2孔未转染作为空白对照；(8)在37°C、体积分数比为5%CO2饱和湿度培养箱中孵育4 6h，弃去培养液，加入完全的DMEM/F12培养基；(9)24h 4 观察细胞，并及时换液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为(1)转染4 后待细胞汇合至80%时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入 800 μ g/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400μ g/mL ；(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止；(4)将阳性克隆用滤纸片法消化并转移至新12孔板，扩大培养。
4.根据权利要求1所述的方法建立的猪气管上皮细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种猪气管上皮细胞系的建立方法，包括以下步骤(1)原代培养无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37℃，5％CO2条件下培养；(2)转染和筛选提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。本发明方法易于培养，生长速度较快，操作方法简便。
文档编号C12R1/91GK102174573SQ20111005076
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者张彦明 申请人:张彦明, 陈宝玉